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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Resumen

Los fotorreceptores de varilla son neuronas sensoriales altamente polarizadas con compartimentos distintos. Los bastones de ratón son largos (~80 μm) y delgados (~2 μm) y están empaquetados lateralmente en la capa más externa de la retina, la capa fotorreceptora, lo que resulta en la alineación de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, la sección tangencial de la retina plana congelada se ha utilizado para estudiar el movimiento y la localización de las proteínas dentro de diferentes compartimentos de bastones. Sin embargo, la alta curvatura de la retina del ratón dominante en bastón hace que la sección tangencial sea un desafío. Motivados por el estudio del transporte de proteínas entre compartimentos, desarrollamos dos métodos de peeling que aíslan de manera confiable el segmento externo de varilla (ROS) y otros compartimentos subcelulares para western blots. Nuestras técnicas relativamente rápidas y simples entregan fracciones enriquecidas y subcelulares específicas para medir cuantitativamente la distribución y redistribución de importantes proteínas fotorreceptoras en bastones normales. Además, estas técnicas de aislamiento también se pueden adaptar fácilmente para aislar e investigar cuantitativamente la composición proteica de otras capas celulares dentro de retinas sanas y degeneradas.

Introducción

Las células fotorreceptoras de varilla, estrechamente empaquetadas en la capa más externa de la retina neural, son una parte integral de la visión con luz tenue. Para funcionar como contadores de fotones fieles, las varillas utilizan una vía de señalización basada en proteína G, denominada fototransducción, para generar respuestas rápidas, amplificadas y reproducibles a la captura de un solo fotón. Esta respuesta a la luz finalmente desencadena un cambio en la corriente en la membrana plasmática y posteriormente se señala al resto del sistema visual1. Como su nombre lo indica, cada célula de varilla tiene una forma distinta en forma de varilla y exhibe una morfología celular altamente polarizada, que consiste en un segmento externo (OS), segmento interno (IS), cuerpo celular (CB) y terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular tiene una maquinaria proteica específica (unida a la membrana y soluble), características biomoleculares y complejos de proteínas que desempeñan funciones cruciales como la fototransducción visual, la limpieza general y la síntesis de proteínas, y la transmisión sináptica2,3.

Hace más de 30 años, se observó por primera vez el movimiento recíproco dependiente de la luz de las proteínas subcelulares, específicamente la transducina (lejos del SO) y la arrestina (hacia la SG)4,5,6,7. Al principio, este fenómeno observado fue recibido con escepticismo, debido en parte a la vulnerabilidad de la inmunohistoquímica al enmascaramiento del epítopo8. A principios de la década de 2000, se confirmó la translocación de proteínas dependientes de estímulos mediante el uso de una rigurosa y ardua técnica de seccionamiento físico9. La seccionamiento tangencial serial de las retinas de roedores de montaje plano congelado seguido de inmunoblotting reveló que la transducina9,10, la arrestina11,12 y la recuperación13 experimentan redistribución subcelular en respuesta a la luz. Se cree que la translocación impulsada por la luz de estas proteínas clave de señalización no solo regula la sensibilidad de la cascada de fototransducción9,14,15, sino que también puede ser neuroprotectora contra el daño de la luz16,17,18. Debido a que el transporte de proteínas impulsado por la luz en bastones parece ser muy significativo para la biología y fisiología celular de los bastones, las técnicas que permiten el aislamiento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar la distribución de proteínas son herramientas de investigación valiosas.

Actualmente, hay algunos métodos destinados a aislar los compartimentos subcelulares de los bastones. Sin embargo, estos métodos pueden ser largos y difíciles de reproducir, o requieren una cantidad considerable de aislamiento de retina. Las preparaciones de segmentos externos de varilla (ROS) a través de la centrifugación por gradiente de densidad19, por ejemplo, se usan comúnmente para separar las ROS del homogeneizado retiniano. Este método es ampliamente utilizado para western blot, pero el procedimiento lleva mucho tiempo y requiere un mínimo de 8-12 retinas murinas20. Por otro lado, la seccionamiento tangencial serial de retinas murinas y de rata congeladas se ha implementado con éxito en el aislamiento de la SG, IS, CB y ST9,11,13. Sin embargo, este método es técnicamente desafiante debido a la necesidad de aplanar completamente la retina murina pequeña y altamente curvada para alinear las capas retinianas antes de la sección tangencial. Dado que hay una gran cantidad de modelos de ratones y ratones transgénicos que recapitulan enfermedades del sistema visual, la creación de una técnica que separe de manera confiable, rápida y fácil los compartimentos de varillas individuales es prometedora para revelar los procesos fisiológicos que ocurren en cada compartimento especializado y los mecanismos que subyacen a los procesos visuales en la salud y la enfermedad.

Para facilitar estas investigaciones, describimos dos métodos de peeling que aíslan los compartimentos subcelulares de los bastones más fácilmente que los protocolos actuales. El primer método de peeling, adaptado de una técnica para exponer células bipolares marcadas fluorescentemente para el registro de pinzas de parche21, emplea papel de filtro de celulosa para eliminar secuencialmente las ROS de una retina murina viva y aislada (Figura 1). El segundo método, adaptado de un procedimiento que aísla las tres capas primarias de células retinianas de una retina de pollito22 y rana23, utiliza cinta adhesiva para eliminar el ROS y el segmento interno del bastón (RIS) de una retina liofilizada (Figura 2). Ambos procedimientos se pueden completar en 1 h y son considerablemente fáciles de usar. Proporcionamos validación de la efectividad de estos dos protocolos de separación para western blot mediante la utilización de retinas adaptadas a la oscuridad y expuestas a la luz de ratones C57BL / 6J para demostrar la translocación inducida por la luz de la transducina de bastón (GNAT1) y la arrestina (ARR1). Además, utilizando el método de pelado en cinta, proporcionamos evidencia adicional de que nuestra técnica se puede utilizar para examinar y abordar las inconsistencias entre los datos de localización de proteínas adquiridos por inmunocitoquímica (ICC) y western blots. Específicamente, nuestra técnica mostró que: 1) la isoforma de la proteína quinasa C-alfa (PKCα) está presente no solo en células bipolares, sino también en ROS murinas y RIS, aunque en bajas concentraciones24,25, y 2) rodopsina quinasa (GRK1) está presente predominantemente en la muestra aislada de SG. Estos datos demuestran la efectividad de nuestras dos técnicas de peeling para separar y cuantificar proteínas específicas de bastones y retinales.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales locales del comité de cuidado de animales de investigación de la Universidad del Sur de California (USC).

1. Método de peeling de retina de células vivas

  1. Preparación de tampones de Ames, papeles de pelar y plato de disección
    1. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte el papel de filtro de celulosa (Grado 413) en rectángulos que midan aproximadamente 5 mm x 2.5 mm. Guarde los esquejes para su uso futuro.
    2. Prepare 1 L de tampón HEPES de Ames combinando una botella de Ames' Medium, 2,38 g de HEPES y 0,877 g de NaCl. Disuelva los reactivos en una botella de vidrio estéril con agua ultrapura destilada y ajuste la osmolaridad y el pH a 280 mOsm y 7.4, respectivamente. Filtro para esterilizar (tamaño de poro 0,2 μm), selle la tapa con película de parafina y guárdela a 4 °C.
    3. Prepare 1 L de tampón de bicarbonato de Ames combinando una botella de Ames' Medium y 1,9 g de NaHCO3. Disuelva los reactivos en una botella de vidrio estéril con agua ultrapura destilada y ajuste la osmolaridad y el pH a 280 mOsm y 7.4, respectivamente. Filtro para esterilizar (tamaño de poro 0,2 μm), selle la tapa con película de parafina y guárdela a 4 °C.
      NOTA: Los tampones hepes y bicarbonato de Ames se pueden preparar con anticipación y almacenar durante 1 semana a 4 °C.
    4. En la parte inferior de una placa de Petri de 35 x 10 mm, cree un patrón de celosía o tablero de ajedrez con un bisturí (hoja No. 11, 40 mm).
      NOTA: El fondo texturizado de la placa de Petri mantiene el ojo aislado y flotante en su lugar durante la disección de la retina.
  2. Disección de la retina
    NOTA: Para este procedimiento, el tampón debe llevarse y mantenerse a temperatura ambiente (RT). Refresque el tampón de bicarbonato de Ames cada 15 minutos con el tampón de bicarbonato de Ames fresco carbogenado durante la disección. Esto mantiene el pH fisiológico necesario.
    1. Alrededor de 15-20 minutos antes de la disección, oxigene el tampón HEPES de Ames en un laboratorio de 100 ml o una botella de medios equipada con un adaptador de tapa de tubo y burbujee el tampón de bicarbonato de Ames con 95% de O2 y 5% de CO2 en una cámara de incubación de tejidos y en un laboratorio de 100 ml o una botella de medios equipada con un adaptador de tapa de tubo.
    2. Sacrificar un número igual de ambos sexos de ratones C57BL / 6J (2-3 meses de edad) ya sea por inhalación de isoflurano o dióxido de carbono (CO2) seguido de dislocación cervical. Enucle los ojos con tijeras curvas y coloque los ojos en la placa de Petri texturizada de 35 x 10 mm llena de tampón de bicarbonato de Ames burbujeado.
    3. Cree una copa del ojo (Figura 1A) perforando un orificio en la unión córnea-limbo con una aguja de 18 G. Corte a lo largo del perímetro de esta unión usando tijeras de iris de microdisección para eliminar la córnea de cada ojo. Separe la lente y el humor vítreo de cada ojo con pinzas y deseche.
    4. Aísle la retina de la copa del ojo pelando cuidadosamente el complejo epitelio pigmentado de la retina (EPR)-esclerótica-coroides lejos de la retina neural. Deseche el complejo RPE-esclerótica-coroides. Asegúrese de que la retina no se dañe durante la disección manejando solo los bordes.
    5. Transfiera retinas aisladas utilizando una pipeta de transferencia de orificio ancho en la tapa de un plato de 60 x 15 mm lleno de tampón de bicarbonato de Ames burbujeado.
    6. Oriente la retina en forma de hemisferio cóncava hacia arriba (los fotorreceptores están mirando hacia abajo hacia la parte inferior del plato) y divida cada retina (a través del nervio óptico) usando tijeras de iris o un bisturí (hoja No. 10, 40 mm). Recorte los bordes curvos de cada media retina para formar dos rectángulos (Figura 1A).
      NOTA: Minimizar la curvatura de cada retina cortada a la mitad permite que la retina se aplane mejor en los pasos posteriores de peeling y produce una exfoliación precisa de la capa del segmento externo del bastón (ROS).
    7. Almacene la retina cortada a la mitad en la cámara de incubación de tejido que está continuamente burbujeada con 95% de O2 y 5% de CO2.
      NOTA: Las retinas aisladas se pueden mantener en el tampón de bicarbonato carbogenado de Ames durante ~ 24 h.
  3. Recogida de segmentos exteriores de varilla (ROS) mediante pelado de papel de filtro
    NOTA: Actualice el tampón HEPES oxigenado RT de Ames cada 15-20 minutos durante el proceso de peeling para mantener el pH fisiológico necesario.
    1. Transfiera un rectángulo retiniano de la cámara de tejido con una pipeta de transferencia de orificio ancho y un trozo de papel de filtro de 5 mm x 2,5 mm a una placa de Petri de 35 x 10 mm llena de tampón HEPES de Ames burbujeado con 100% de O2.
    2. Oriente la retina dividida cóncava hacia arriba y asegúrese de que los fotorreceptores estén mirando hacia abajo hacia la parte inferior del plato. Agarre ligeramente los lados de la retina cortada a la mitad con pinzas y muévala sobre el papel de filtro. Una vez que la retina esté centrada en el papel de filtro, mueva el papel de filtro hacia arriba para que la retina cortada a la mitad toque el papel de filtro para crear la adhesión de papel ROS a filtro (Figura 1B).
      NOTA: Asegúrese de que la capa fotorreceptora haga contacto directo con el papel de filtro.
    3. Levante con cuidado el papel de filtro con la retina adjunta fuera del tampón HEPES de Ames. Coloque la parte inferior del papel de filtro (el lado sin retina) sobre una toalla de papel y aplique 2-3 veces para que se seque (Figura 1B).
    4. Agregue una gota de HEPES de Ames en el costado del papel de filtro con la retina. Coloque el papel de filtro sobre la toalla de papel nuevamente para que se seque, como se acaba de describir. Repita este proceso dos veces más.
    5. Coloque el papel de filtro con la retina de nuevo en la placa de Petri. Con pinzas, empuje suavemente todos los bordes de la retina cortada a la mitad hacia arriba y lejos del papel de filtro en todos los lados.
    6. Pelar delicadamente la retina lejos del papel de filtro. Toque solo el perímetro extremo de la retina durante el proceso de peeling para preservar la integridad estructural de la retina.
    7. Levante el papel de filtro de la placa de Petri y retire el exceso de líquido en una toalla de papel. Asegúrese de que el lado que estuvo en contacto con la retina no entre en contacto con la toalla de papel.
    8. Coloque el papel de filtro con la capa parcial de ROS en un tubo etiquetado sobre hielo (Figura 1B). Mantenga la retina pelada sumergida en el tampón HEPES de Ames.
    9. Repita el proceso de peeling para esta retina cortada a la mitad aproximadamente 7-8 veces para eliminar toda la capa de ROS. Después de cada peeling, coloque el papel de filtro en el mismo tubo, que contendrá las ROS aisladas de una retina cortada a la mitad.
      NOTA: Tenga cuidado de no rasgar la retina cortada a la mitad al despegarla del papel de filtro, ya que la retina se vuelve más delgada durante este proceso.
    10. Coloque el tubo que contiene todas las cáscaras de papel de filtro de la ROS aislada en hielo para su uso inmediato o congele directamente sobre hielo seco y guárdelo a -80 °C.
    11. Use pinzas para transferir la retina pelada sobrante (que carece de ROS) a un tubo debidamente marcado. Coloque el tubo sobre hielo para su uso inmediato o congele con hielo seco y guárdelo a -80 °C.
    12. Repita el proceso de peeling para cada retina cortada a la mitad y etiquete con precisión cada tubo.

2. Método de peeling de retina liofilizado

  1. Tampones, medio de pelado, preparación de platos de disección y configuración del liofilizador
    1. En una botella de almacenamiento de 1 L, prepare la solución de Ringer agregando 500 ml de agua ultrapura destilada. Disolver los reactivos para alcanzar una concentración final de 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES y 0,02 mM EDTA. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH, agregue agua ultrapura para llevar el volumen final a 1 L y ajuste la osmolaridad a 313 mOsm.
    2. Antes del uso, filtre la solución de Ringer con un filtro estéril (tamaño de poro 0,2 μm), selle la tapa con una película de parafina y guárdela a 4 °C.
    3. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte el papel de filtro de celulosa en rectángulos que midan aproximadamente 5 mm x 2,5 mm. Use un lápiz para escribir en un lado del papel de filtro para crear una etiqueta única.
    4. Cree un patrón de celosía o tablero de ajedrez en la parte inferior de una placa de Petri de 35 x 10 mm con un bisturí (hoja No. 11, 40 mm).
    5. Encienda el liofilizador de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
    6. Adquirir nitrógeno líquido en un matraz Dewar o matraz de vacío aislante similar.
  2. Disección retiniana
    1. Completar la disección retiniana como se describe en la sección 1 del protocolo (Figura 1A). Use la solución fría de Ringer en lugar del búfer de Ames.
    2. Después de la disección, guarde las retinas rectangulares cortadas a la mitad en una placa de Petri de 35 x 10 mm llena de solución fría de Ringer y colóquelas en hielo.
  3. Preparación de muestras de retina para la liofilización
    1. Coloque un trozo de papel de filtro de 5 x 2,5 mm y transfiera una retina cortada a la mitad a la placa de Petri texturizada de 35 x 10 mm llena de tampón frío de Ringer. Use una pipeta de transferencia de orificio ancho para mover cada retina entre platos.
    2. Use pinzas para voltear cuidadosamente la retina para que esté orientada cóncava hacia arriba (los fotorreceptores apuntan hacia arriba) y muévala para que descanse sobre el papel de filtro (Figura 2A).
      NOTA: Asegúrese de que los fotorreceptores no entren en contacto con el papel de filtro (la capa de células ganglionares de la retina debe estar en contacto directo con el papel de filtro) y que la etiqueta única sea visible. Para identificar fácil y rápidamente el aislado de retina, se recomienda que la etiqueta única se ubique en la parte inferior del papel de filtro.
    3. Levante el papel de filtro por los bordes hacia arriba para que el trozo de retina cortado a la mitad toque el papel de filtro y continúe levantando el papel de filtro de la solución de Ringer.
    4. Coloque la parte inferior del papel de filtro (el lado sin la retina) sobre una toalla de papel y aplique cuidadosamente 2-3 veces para eliminar el exceso de líquido (Figura 2A).
    5. Tome el papel de filtro con pinzas y agregue una gota de Ringer frío en el costado del papel de filtro con la retina. Coloque el papel de filtro sobre la toalla de papel nuevamente para eliminar el exceso de líquido. Repita el proceso dos veces más.
      NOTA: Estos pasos alternos de humectación y secado aseguran que el pañuelo esté firmemente unido al papel de filtro.
    6. Guarde cada muestra de retina/papel de filtro adherida en una placa de Petri llena de Ringer frío hasta que esté lista para congelar todas las muestras. Repita este proceso para todas las retinas cortadas a la mitad.
    7. Obtenga una placa de Petri limpia y seca de 35 x 10 mm (solo en la parte inferior) y un trozo de papel de aluminio cortado en un cuadrado de 3,5 x 3,5 pulgadas.
    8. Levante cada muestra del amortiguador del Ringer frío con pinzas. Asegúrese de que las pinzas entren en contacto solo con los bordes del papel de filtro, evitando la retina cortada a la mitad.
    9. Coloque la parte inferior de cada papel de filtro (el lado sin la retina) sobre una toalla de papel y retire el exceso de líquido.
    10. Agregue una gota de 1x PBS frío (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) en el lado del papel de filtro donde se adhiere la retina. Frote el papel de filtro en la toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.
      NOTA: Asegúrese de que la humedad del papel de filtro se elimine lo suficiente antes de congelarse.
    11. Coloque todas las piezas de papel de filtro en la placa de Petri de 35 x 10 mm. Use un papel de seda sin pelusa para eliminar cualquier exceso de líquido que rodee el papel de filtro.
      NOTA: No llene la placa de Petri con muestras. Si se usan más de cuatro ojos murinos, considere usar una placa de Petri más grande o varias placas de Petri más pequeñas para contener las muestras de retina / papel de filtro.
    12. Envuelva firmemente todo el plato con papel de aluminio. Asegúrese de que los bordes del papel de aluminio estén asegurados y presionados suavemente en la parte inferior de la placa de Petri. Perfore un puñado de agujeros de 0.1-0.2 mm en la tapa de papel de aluminio (Figura 2A).
    13. Usando pinzas de metal, baje gradualmente la placa de Petri cubierta de papel de aluminio en el nitrógeno líquido. Mantenga las muestras en el nitrógeno líquido (<10 min) hasta que estén listas para liofilizar.
  4. Liofilización
    1. Coloque la placa de Petri cubierta de papel de aluminio en un matraz de liofilización y conéctela a la máquina liofilizadora siguiendo el protocolo del fabricante. Liofilizar la retina durante 30 min.
    2. Separe el matraz del liofilizador y apague la máquina según el fabricante.
    3. Retire el papel de aluminio y trabaje con las muestras liofilizadas el mismo día o guárdelas en tubos de microcentrífuga de 1 ml debidamente etiquetados. Coloque estos tubos en un recipiente (como un tubo cónico de 50 ml) lleno de un desecante anhidro y almacene las muestras a -80 °C.
  5. Recogida de segmentos exteriores e interiores de varillas mediante pelado de cinta adhesiva.
    1. Corte tiras de cinta adhesiva transparente (1-2 cm) y guarde las tiras en el borde del dispensador de cinta / banco de laboratorio / etc. para un uso rápido.
    2. Mueva una muestra de retina a la tapa de una placa de Petri de plástico de 60 x 15 mm para pelarla. Asegúrese de agarrar solo los bordes más externos del papel de filtro y evite tocar la retina.
    3. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte un pequeño trozo rectangular de cinta al tamaño aproximado del tejido (1,5 x 2,5 mm).
    4. Coloque cuidadosamente un pequeño trozo de cinta adhesiva sobre la retina liofilizada (Figura 2B) y aplique una ligera presión con las pinzas para asegurarse de que se adhiera a la capa fotorreceptora (la capa superior teñida de naranja / rosa).
    5. Pelar lentamente la cinta. Tanto el segmento exterior de la varilla (ROS) como el segmento interior de la varilla (RIS) se adherirán a la cinta (Figura 2B).
    6. Asegúrese de que haya una película blanca delgada en la superficie fracturada. Esto es RIS.To separar el RIS, colocar otro trozo de cinta y empujar la cinta hacia abajo sobre la superficie fracturada (Figura 2B).
      NOTA: Puede tomar más de un trozo de cinta para eliminar toda la capa blanca delgada.
    7. Coloque el trozo de cinta con solo la capa naranja / rosa en un tubo de microcentrífuga etiquetado con +ROS.
    8. Coloque la cinta o trozos de cinta con la fina capa blanca en un tubo de microcentrífuga etiquetado con +RIS.
      NOTA: Separar la retina liofilizada con cinta adhesiva requiere práctica. La cantidad de presión aplicada a la cinta afectará la forma en que la muestra liofilizada se fraccionará. Si se ejerce demasiada presión sobre la cinta sobre la muestra, toda la retina liofilizada se despegará del papel de filtro y se pegará a la cinta. Si se agrega muy poca presión a la cinta, la capa superior naranja / rosa (+ ROS) no se pegará a la cinta.
    9. Recoja el tejido retiniano sobrante (desprovisto de capas ROS y RIS, -OIS) ubicado en el papel de filtro despegando la capa gruesa y blanca del papel de filtro con cinta adhesiva. Coloque el aislado en un tubo con la etiqueta -OIS.
    10. Repita estos pasos para cada muestra de retina cortada a la mitad.
    11. Guarde las capas aisladas de la retina liofilizada a temperatura ambiente si realiza cuantificación de proteínas, electroforesis en gel e inmunoblots de proteínas ese mismo día, o guárdelas en un recipiente (como un tubo cónico de 50 ml) lleno de desecante anhidro a -80 °C para su uso posterior.

3. Preparación de muestras de Western blot para aislamientos de pelado

  1. Preparar el búfer de lisis RIPA
    1. En una botella de almacenamiento de 100 ml, agregue reactivos para obtener una concentración final de 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS y 1 mM EDTA. Agregue 100 ml de agua ultrapura desionizada y mezcle bien.
      NOTA: El tampón de lisis RIPA se puede almacenar a 2-8 °C durante 2-3 semanas. Para un almacenamiento más prolongado, alícuota y guárdelo en el congelador de -20 °C.
    2. El día del experimento, agregue un cóctel inhibidor de la proteasa (0.1 M PMSF, 1: 1000 Aprotinin y 1: 1000 Leupeptin) al tampón de lisis RIPA y manténgalo en hielo.
  2. Preparación de lisado pelado de papel de filtro para western blot
    1. Asegúrese de que los tubos que contienen las cáscaras de papel de filtro y las retinas peladas sobrantes se mantengan en hielo (para el experimento el mismo día) o se retiren del almacenamiento del congelador a -80 ° C y se coloquen sobre hielo.
    2. Retire el exceso de líquido de la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga que contienen las cáscaras de papel de filtro. Gire rápidamente en una mini centrífuga durante 2-4 s y deseche cualquier líquido restante.
    3. Pipetear 45-55 μL de tampón RIPA frío en tubos que contengan el aislado de papel de filtro.
    4. Homogeneice cada muestra con un mezclador de mortero limpio y en autoclave durante 1 min. Asegúrese de que el papel de filtro permanezca en contacto con el mezclador de morteros. Mantenga el papel de filtro en el lado de cada tubo en lugar de en la parte inferior.
    5. Con pinzas, mueva los papeles de filtro al costado de cada tubo y gire en la mini centrífuga durante 2-4 s. Esto eliminará el búfer RIPA del papel de filtro.
    6. Retire el papel de filtro seco y repita para todos los papeles de filtro dentro de cada tubo si es necesario.
    7. Transfiera el homogeneizado a un nuevo tubo y etiquételo adecuadamente.
      NOTA: Este es el paso que más tiempo consume, y si no se completa correctamente, gran parte de la muestra terminará siendo absorbida por el papel de filtro.
    8. Pipete 60-80 μL de tampón RIPA frío en los tubos individuales con las retinas peladas sobrantes.
    9. Homogeneice cada muestra con un mezclador de mortero limpio y en autoclave durante 1 min.
  3. Pelado de cinta Preparación de lisado para western blot
    1. Coloque las muestras liofilizadas RT o las muestras de -80 °C sobre hielo.
    2. Pipete 50-70 μL de tampón RIPA frío en cada tubo que contenga cáscaras de cinta +ROS y +RIS.
    3. Pipete 60-80 μL de tampón de lisis en frío en los tubos -OIS que contienen la retina liofilizada restante, con la ROS y la RIS eliminadas.
    4. Homogeneizar cada muestra con un mezclador de mortero limpio durante 1 min. Asegúrese de que la cinta en los tubos individuales permanezca en contacto con el mezclador de morteros y el tampón de lisis.
    5. Con pinzas esterilizadas, mueva la cinta hacia un lado de los tubos y gire con una mini centrífuga durante 2-4 s. Esto eliminará el líquido de la cinta. Retire la cinta seca de los tubos.
      NOTA: En este punto, puede combinar dos aislados de media retina de la misma retina para el método de "peeling de papel de filtro" o "peeling de cinta" para asegurarse de que tiene suficiente volumen para realizar un ensayo de ácido bicinconinico (BCA).

Resultados

Las estrategias actuales se desarrollaron para proporcionar métodos relativamente rápidos y simples para aislar y analizar proteínas entre compartimentos subcelulares de bastones específicos para el análisis de western blot. Aplicamos dos técnicas de peeling secuencial (Figura 1 y Figura 2) seguidas de inmunoblotting para demostrar que estos métodos podrían usarse de manera confiable para detectar la distribución conocida de transducina de bastón (GNAT...

Discusión

Muchas enfermedades de la retina afectan a las células fotorreceptoras de bastoncillos, lo que lleva a la muerte de los bastones y, en última instancia, a la pérdida completa de la visión37. Una parte significativa de los orígenes genéticos y mecanicistas de la degeneración retiniana humana se han recapitulado con éxito en numerosos modelos de ratones a lo largo de los años. En ese contexto, la capacidad de separar fácil y selectivamente los compartimentos subcelulares de bastoncillos in...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH Grant EY12155, EY027193 y EY027387 a JC. Estamos agradecidos al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, EE.UU.) y Natalie Chen (USC, Los Ángeles, EE.UU.) por la revisión del manuscrito. También nos gustaría agradecer al Dr. Seth Ruffins (USC, Los Ángeles, EE.UU.) y al Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Ángeles, EE.UU.) por proporcionar el equipo necesario para recoger las imágenes proporcionadas por el autor. Material de: Kasey Rose et al, Separación de compartimentos de células fotorreceptoras en retina de ratón para análisis de proteínas, Molecular Neurodegeneration, publicado [2017], [Springer Nature].

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapterN/AN/A
100% O2 tankN/AN/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μmGenesee Scientific25-235
4X SDS Sample BufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon tubeFisher Scientific14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tankN/AN/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonateSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, dihydrate)SigmaC-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)VWR100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes pellet pestleSigmaz359971
Labconco Fast-Freeze FlasksLabconcoN/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flaskN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/de-ionized waterEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (powder)J.T. Baker4062-01
NaCl (crystal)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, Free AcidEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Aluminum FoilReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)Scotch-3MN/A
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD67501
Spectrafuge mini centrifugeLabnet International, IncC1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machineSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm)Whatman/GE Healthcare1001-090
Wide bore transfer pipet, Global ScientificVWR76285-362

Referencias

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

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