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요약

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

초록

막대 광수용체는 뚜렷한 구획을 가진 고도로 편광 된 감각 뉴런입니다. 마우스 막대는 길고 (∼80 μm) 얇고 (~2 μm) 망막의 최외곽층, 광수용체 층에 측방으로 패킹되어, 유사한 세포 하부 구획의 정렬을 초래한다. 전통적으로, 동결된 평탄한 망막의 접선 절편은 상이한 막대 구획 내의 단백질의 이동 및 국소화를 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 막대 지배적 마우스 망막의 높은 곡률은 접선 단면화를 어렵게 만든다. 구획 사이의 단백질 수송에 대한 연구에 동기를 부여하여, 우리는 막대 외부 세그먼트 (ROS)와 서부 블로트를위한 다른 세포 하부 구획을 안정적으로 분리하는 두 가지 박리 방법을 개발했습니다. 우리의 비교적 빠르고 간단한 기술은 농축 및 아세포 특이적 분획을 제공하여 정상 막대에서 중요한 광수용체 단백질의 분포 및 재분포를 정량적으로 측정합니다. 더욱이, 이러한 분리 기술은 또한 건강한 망막 및 퇴행성 망막 내의 다른 세포층의 단백질 조성을 분리하고 정량적으로 조사하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

서문

신경 망막의 최외곽층에 단단히 포장 된 막대 광수용체 세포는 희미한 빛 시력의 필수적인 부분입니다. 충실한 광자 카운터 역할을 하기 위해 로드는 광형질도입(phototransduction)이라고 불리는 G-단백질 기반 신호전달 경로를 활용하여 단일 광자 포획에 대한 신속하고 증폭되며 재현 가능한 반응을 생성합니다. 빛에 대한 이러한 반응은 궁극적으로 원형질막에서 전류의 변화를 촉발시키고 그 후 시각 시스템의 나머지 부분에 신호를 보냅니다1. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 각 막대 세포는 뚜렷한 막대 모양의 모양을 가지며 외부 세그먼트 (OS), 내부 세그먼트 (IS), 세포체 (CB) 및 시냅스 말단 (ST)으로 구성된 고도로 편광 된 세포 형태를 나타냅니다. 각 세포 하부 구획에는 특정 단백질 기계 (막 결합 및 용해성), 생체 분자 특징 및 시각적 광형질도입, 일반적인 하우스 키핑 및 단백질 합성, 시냅스 전달과 같은 중요한 역할을하는 단백질 복합체가 있습니다2,3.

30여 년 전, 아세포 단백질, 특히 트랜스듀신(OS로부터 멀어짐)과 어레스틴(OS를 향하여)의 광의존적 상호 이동이 처음 관찰되었다4,5,6,7. 초기에, 이 관찰된 현상은 부분적으로는 에피토프 마스킹에 대한 면역조직화학의 취약성 때문에 회의론으로 받아들여졌다8. 2000년대 초에, 자극-의존성 단백질 전좌는 엄격하고 힘든 물리적 절편 기술9을 사용하여 확인되었다. 면역블롯팅에 이어 동결된 평탄한 설치류 망막의 직렬 접선 절편은 트랜스듀신9,10, arrestin11,12 및 recoverin13이 모두 빛에 반응하여 세포하 재분배를 겪는다는 것을 밝혀냈다. 이러한 주요 신호전달 단백질의 광구동 전좌는 광형질도입 캐스케이드9,14,15의 감도를 조절할 뿐만 아니라, 광손상에 대한 신경보호가 될 수도 있다고 여겨진다16,17,18. 막대에서의 광 구동 단백질 수송은 막대 세포 생물학 및 생리학에 매우 중요한 것으로 보이기 때문에 단백질 분포를 결정하기 위해 다른 세포 하위 구획을 분리 할 수있는 기술은 귀중한 연구 도구입니다.

현재, 막대 세포 하부 구획을 분리하기위한 몇 가지 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 길고 재현하기 어렵거나 상당한 양의 망막 분리가 필요할 수 있습니다. 밀도 구배 원심분리19를 통한 막대 외부 세그먼트(ROS) 제제는 예를 들어, 망막 균질물로부터 ROS를 분리하는데 일반적으로 사용된다. 이 방법은 웨스턴 블롯에 널리 사용되지만 절차는 매우 시간이 많이 걸리고 최소 8-12 뮤린 레티네20이 필요합니다. 한편, 냉동 뮤린 및 래트 망막의 직렬 접선 절편은 OS, IS, CB, 및 ST9,11,13을 단리하는데 성공적으로 구현되었다. 그러나이 방법은 접선 절편화 전에 망막 층을 정렬하기 위해 작고 고도로 구부러진 뮤린 망막을 완전히 평평하게 할 필요가 있기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 시각 시스템의 질병을 되풀이하는 마우스 모델과 트랜스제닉 마우스가 과다하기 때문에 개별 막대 구획을 안정적이고 신속하며 쉽게 분리하는 기술의 생성은 각 특수 구획에서 발생하는 생리 학적 과정과 건강 및 질병의 시각적 과정의 기초가되는 메커니즘을 드러내는 데 공약을 가지고 있습니다.

이러한 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 현재의 프로토콜보다 더 쉽게 막대 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 박리 방법을 설명합니다. 패치 클램프 기록21을 위해 형광 표지된 양극성 세포를 노출시키는 기술로부터 적응된 첫 번째 박리 방법은 셀룰로오스 여과지를 사용하여 살아있는 분리된 뮤린 망막으로부터 ROS를 순차적으로 제거한다(도 1). 병아리22 및 개구리23 망막으로부터 3개의 일차 망막 세포층을 분리하는 절차에서 적응된 두 번째 방법은 접착 테이프를 사용하여 동결건조된 망막으로부터 ROS 및 막대 내부 세그먼트(RIS)를 제거한다(그림 2). 두 절차 모두 1 시간 내에 완료 할 수 있으며 상당히 사용자 친화적입니다. 우리는 로드 트랜스듀신(GNAT1) 및 어레스틴(ARR1)의 광유도 전좌를 입증하기 위해 C57BL/6J 마우스로부터의 어두운 적응 및 광노출 망막을 활용하여 웨스턴 블롯에 대한 이러한 두 가지 분리 프로토콜의 효과에 대한 검증을 제공합니다. 또한, 테이프 필링 방법을 사용하여, 우리는 우리의 기술이 면역 세포 화학 (ICC)에 의해 획득 된 단백질 국소화 데이터와 서양 블로트 사이의 불일치를 조사하고 해결하는 데 사용될 수 있다는 추가적인 증거를 제공합니다. 구체적으로, 우리의 기술은 1) 단백질 키나아제 C-알파 (PKCα) 이소형이 양극성 세포뿐만 아니라 뮤린 ROS 및 RIS에도 존재하며, 낮은 농도임에도 불구하고24,25, 및 2) 로돕신 키나아제 (GRK1)가 단리된 OS 샘플에 우세하게 존재한다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 특정 막대와 망막 단백질을 분리하고 정량화하기위한 두 가지 박리 기술의 효과를 보여줍니다.

프로토콜

모든 실험은 서던 캘리포니아 대학 (USC)의 동물 관리 연구위원회의 지역 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 살아있는 세포 망막 박리 방법

  1. Ames의 완충액, 필링 종이 및 해부 접시 준비
    1. 무딘 팁 아이리스 가위(또는 이와 동등한 가위 유형)를 사용하여 셀룰로오스 여과지(등급 413)를 약 5mm x 2.5mm 크기의 직사각형으로 자릅니다. 나중에 사용할 수 있도록 절단을 보관하십시오.
    2. Ames' Medium, 2.38g HEPES 및 0.877g의 NaCl 1병을 배합하여 Ames' HEPES 버퍼 1L를 준비합니다. 시약을 멸균 유리 병에 증류수 초순수로 용해시키고 삼투압 및 pH를 각각 280 mOsm 및 7.4로 조정한다. 여과하여 멸균시키고(기공 크기 0.2 μm), 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 4°C에서 보관한다.
    3. Ames' Medium 1병과 NaHCO3 1.9g을 결합하여 Ames' 중탄산염 완충액 1L를 준비합니다. 시약을 멸균 유리 병에 증류수 초순수로 용해시키고 삼투압 및 pH를 각각 280 mOsm 및 7.4로 조정한다. 여과하여 멸균시키고(기공 크기 0.2 μm), 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 4°C에서 보관한다.
      참고: Ames의 HEPES 및 Ames의 중탄산염 버퍼는 미리 준비하여 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 35 x 10mm 페트리 접시 바닥에 메스(블레이드 번호 11, 40mm)가 있는 격자 또는 바둑판 패턴을 만듭니다.
      참고 : 페트리 접시의 질감이있는 바닥은 망막 해부 중에 고립되고 자유롭게 떠있는 눈을 제자리에 고정시킵니다.
  2. 망막의 해부
    참고: 이 절차에서는 버퍼를 실온(RT)으로 가져와 보관해야 합니다. 해부 중에 신선한 탄산 에임스의 중탄산염 버퍼로 15 분마다 새로 고칩니다. 이것은 필요한 생리학적 pH를 유지한다.
    1. 해부 전 약 15-20분 전에 튜브 캡 어댑터가 장착된 100mL 실험실 또는 미디어 병에 Ames의 HEPES 버퍼를 산소를 공급하고 Ames의 중탄산염 버퍼를 조직 배양 챔버 및 튜브 캡 어댑터가 장착된 100mL 실험실 또는 미디어 병에 95% O2 및 5 % CO2 로 버블링합니다.
    2. 이소플루란 흡입 또는 이산화탄소(CO2)에 의해 C57BL/6J 마우스(생후 2-3개월)의 두 성별을 동일하게 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 실시한다. 구부러진 가위로 눈을 에핵화하고 거품이 난 Ames의 중탄산염 버퍼로 채워진 질감이 있는 35 x 10mm 페트리 접시에 눈을 넣습니다.
    3. 18G 바늘로 각막-림푸스 접합부에 구멍을 뚫어 아이컵(그림 1A)을 만듭니다. 이 접합부의 둘레를 따라 마이크로 해부 홍채 가위를 사용하여 각 눈의 각막을 제거하십시오. 핀셋을 사용하여 각 눈에서 렌즈와 유리체 유머를 분리하고 버리십시오.
    4. 망막 색소 상피 (RPE)-공막-맥락막 복합체를 신경 망막으로부터 조심스럽게 벗겨서 안구 컵에서 망막을 분리하십시오. RPE-공막-맥락막 복합체를 폐기하십시오. 가장자리 만 처리하여 해부 중에 망막이 손상되지 않도록하십시오.
    5. 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여 분리된 망막을 버블링된 Ames' 중탄산염 버퍼로 채워진 60 x 15mm 접시의 뚜껑으로 옮깁니다.
    6. 반구 모양의 망막을 오목하게 (광수용체가 접시의 바닥을 향하고 있음) 방향을 잡고 홍채 가위 또는 메스 (블레이드 번호 10, 40mm)를 사용하여 각 망막 (시신경을 통해)을 양분합니다. 각 절반 망막의 곡선 가장자리를 트리밍하여 두 개의 사각형을 만듭니다(그림 1A).
      참고: 각 반으로 줄어든 망막의 곡률을 최소화하면 후속 박리 단계에서 망막이 더 잘 평평해지고 막대 외부 세그먼트(ROS) 층의 정확한 박리가 생성됩니다.
    7. 반으로 줄어든 망막을 95% O2 및 5% CO2로 지속적으로 버블링되는 조직 인큐베이션 챔버에 보관하십시오.
      참고 : 분리 된 망막은 ~ 24 시간 동안 탄수화물 화 된 Ames의 중탄산염 완충액에 보관할 수 있습니다.
  3. 여과지 필링에 의한 막대 외부 세그먼트 (ROS) 수집
    참고: 필요한 생리적 pH를 유지하기 위해 박리 과정에서 15-20분마다 RT 산소화된 Ames의 HEPES 버퍼를 새로 고칩니다.
    1. 넓은 보어 전달 피펫과 5mm x 2.5mm 여과지가 있는 티슈 챔버에서 100% O2로 버블링된 Ames의 HEPES 버퍼로 채워진 35 x 10mm 페트리 접시에 망막 구형 1개를 옮깁니다.
    2. 분할 된 망막을 오목하게 향하게하고 광수용체가 접시의 바닥을 향해 아래로 향하고 있는지 확인하십시오. 핀셋으로 반으로 줄어든 망막의 측면을 가볍게 잡고 여과지 위로 옮깁니다. 망막이 여과지에 중앙에 배치되면 절반으로 줄어든 망막이 여과지에 닿도록 여과지를 위쪽으로 움직여 ROS-to-여과지 접착력을 만듭니다(그림 1B).
      참고: 광수용체 층이 여과지와 직접 접촉하는지 확인하십시오.
    3. 부착된 망막이 있는 여과지를 조심스럽게 Ames의 HEPES 버퍼에서 들어올립니다. 여과지의 아래쪽(망막이 없는 쪽)을 종이 타월에 놓고 2~3회 닦아 말립니다(그림 1B).
    4. 망막이있는 여과지 측면에 Ames의 HEPES 한 방울을 추가하십시오. 방금 설명한 대로 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 말립니다. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 망막이 있는 여과지를 페트리 접시에 다시 넣습니다. 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 모든 가장자리를 부드럽게 밀어 올리고 사방의 여과지에서 멀리 뺍니다.
    6. 망막을 여과지에서 섬세하게 벗겨냅니다. 박리 과정에서 망막의 극단적 인 둘레 만 만져서 망막의 구조적 무결성을 보존하십시오.
    7. 페트리 접시에서 여과지를 들어 올리고 종이 타월에 과도한 액체를 제거하십시오. 망막과 접촉한 쪽이 종이 타월에 닿지 않는지 확인하십시오.
    8. 부분 ROS 층이 있는 여과지를 얼음 위에 라벨이 표시된 튜브에 넣습니다(그림 1B). 껍질을 벗긴 망막을 Ames의 HEPES 버퍼에 잠기십시오.
    9. 이 반으로 줄어든 망막에 대해 박리 과정을 약 7-8회 반복하여 전체 ROS 층을 제거한다. 각 껍질을 벗긴 후, 하나의 반으로 줄어든 망막으로부터 분리된 ROS를 함유할 동일한 튜브에 여과지를 놓는다.
      참고: 반으로 줄어든 망막을 여과지에서 떼어낼 때 망막이 찢어지지 않도록 주의하십시오.
    10. 분리된 ROS의 모든 여과지 껍질을 함유하는 튜브를 즉시 사용하기 위해 얼음 위에 놓거나 드라이아이스 상에 직접 동결시키고 -80°C에서 보관한다.
    11. 핀셋을 사용하여 남은 껍질을 벗긴 망막 (ROS 부족)을 적절하게 표지 된 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 올려 놓고 즉시 사용하거나 드라이 아이스로 얼리고 -80 °C에서 보관하십시오.
    12. 반으로 줄어든 각 망막에 대해 필링 과정을 반복하고 각 튜브에 정확하게 라벨을 붙입니다.

2. 동결건조된 망막 박리법

  1. 완충액, 박리 배지, 해부 접시 준비 및 동결 건조기 설정
    1. 1L 저장병에 증류수 500mL를 첨가하여 링거 용액을 준비합니다. 130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 및 0.02 mM EDTA의 최종 농도에 도달하도록 시약을 용해시킨다. NaOH로 pH를 7.4로 조정하고, 초순수를 첨가하여 최종 부피를 1 L로 만들고, 삼투압을 313 mOsm으로 조정한다.
    2. 사용 전에, 링거 용액을 멸균 필터(기공 크기 0.2 μm)로 여과하고, 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 4°C에서 보관한다.
    3. 무딘 팁 아이리스 가위(또는 이와 동등한 가위 유형)를 사용하여 셀룰로오스 여과지를 약 5mm x 2.5mm 크기의 직사각형으로 자릅니다. 연필을 사용하여 필터 용지의 한쪽면에 글을 써서 고유 한 레이블을 만듭니다.
    4. 메스(블레이드 번호 11, 40 mm)를 사용하여 35 x 10 mm 페트리 접시의 바닥에 격자 또는 바둑판 패턴을 만듭니다.
    5. 제조업체의 사양에 따라 동결 건조기를 켭니다.
    6. Dewar 플라스크 또는 유사한 절연 진공 플라스크에서 액체 질소를 획득하십시오.
  2. 망막 박리
    1. 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 망막 박리를 완료합니다(도 1A). Ames의 버퍼 대신 콜드 링거의 솔루션을 사용하십시오.
    2. 해부 후 반으로 줄어든 직사각형 망막을 차가운 링거 용액으로 채워진 35 x 10mm 페트리 접시에 보관하고 얼음 위에 놓습니다.
  3. 동결건조를 위한 망막 시료 준비
    1. 5 x 2.5mm 여과지를 놓고 반쯤 된 망막을 차가운 링거의 버퍼로 채워진 질감화 된 35 x 10mm 페트리 접시에 옮깁니다. 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여 각 망막을 접시 사이로 옮깁니다.
    2. 핀셋을 사용하여 망막이 오목하게 위로 향하도록 조심스럽게 뒤집고(광수용체가 위쪽을 향하고 있음) 여과지 위에 놓이도록 움직입니다(그림 2A).
      참고 : 감광체가 여과지에 닿지 않도록하십시오 (망막 신경절 세포층은 여과지와 직접 접촉해야합니다) 고유 한 라벨이 보입니다. 망막 분리물을 쉽고 빠르게 식별하려면 고유한 라벨을 여과지의 아래쪽에 위치시키는 것이 좋습니다.
    3. 절반으로 줄어든 망막 조각이 여과지에 닿도록 가장자리를 위쪽으로 들어 올리고 링거의 용액에서 여과지를 계속 들어올립니다.
    4. 여과지의 아래쪽(망막이 없는 쪽)을 종이 타월에 놓고 조심스럽게 2-3번 닦아 과도한 액체를 제거합니다(그림 2A).
    5. 핀셋으로 여과지를 집어 들고 망막이있는 여과지 측면에 차가운 링거 한 방울을 추가하십시오. 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 과도한 액체를 제거하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.
      참고: 이러한 번갈아 가며 습윤 및 건조 단계는 조직이 여과지에 단단히 부착되도록 합니다.
    6. 부착 된 각 망막 / 여과지 샘플을 모든 샘플을 동결 할 준비가 될 때까지 차가운 링거로 채워진 페트리 접시에 보관하십시오. 모든 반으로 줄어든 망막에 대해이 과정을 반복하십시오.
    7. 깨끗하고 건조한 35 x 10mm 페트리 접시 (바닥만)와 3.5 x 3.5 인치 정사각형으로 자른 알루미늄 호일 조각을 얻으십시오.
    8. 핀셋으로 차가운 링거의 버퍼에서 각 샘플을 들어 올립니다. 핀셋이 여과지 가장자리에만 닿았는지 확인하여 망막이 절반으로 줄어든 것을 피하십시오.
    9. 각 여과지의 아래쪽 측면 (망막이없는 쪽)을 종이 타월에 놓고 과도한 액체를 제거하십시오.
    10. 차가운 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)의 방울을 망막이 부착되는 여과지의 측면에 첨가한다. 과도한 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 여과지를 닦으십시오.
      주: 얼기 전에 여과지의 습기가 충분히 제거되었는지 확인하십시오.
    11. 모든 여과지 조각을 35 x 10mm 페트리 접시에 넣으십시오. 보풀이 없는 티슈 페이퍼를 사용하여 여과지 주변의 과도한 액체를 제거하십시오.
      참고 : 샘플로 페트리 접시를 과밀하지 마십시오. 네 개 이상의 뮤린 눈을 사용하는 경우 망막 / 여과지 샘플을 보관하기 위해 더 큰 페트리 접시 또는 여러 개의 작은 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다.
    12. 접시 전체를 알루미늄 호일로 단단히 감싸십시오. 알루미늄 호일의 가장자리가 고정되어 있고 페트리 접시의 바닥에 부드럽게 눌려져 있는지 확인하십시오. 알루미늄 호일 뚜껑에 0.1-0.2mm 구멍 몇 개를 뚫습니다(그림 2A).
    13. 금속 집게를 사용하여 페트리 접시로 덮인 알루미늄 호일을 액체 질소로 서서히 내립니다. 샘플을 동결건조할 준비가 될 때까지 액체 질소(<10분)에 보관하십시오.
  4. 동결건조
    1. 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 동결 건조 플라스크에 넣고 제조업체의 프로토콜에 따라 동결 건조기 기계에 부착하십시오. 망막을 30 분 동안 동결 건조하십시오.
    2. 동결 건조기에서 플라스크를 분리하고 제조업체에 따라 기계를 차단하십시오.
    3. 알루미늄 호일을 제거하고 같은 날 동결 건조 된 샘플로 작업하거나 적절하게 표지 된 1 mL 마이크로 원심분리 튜브에 보관하십시오. 이들 튜브를 무수 건조제로 채워진 용기(예: 50 mL 원뿔형 튜브)에 넣고 샘플을 -80°C에서 보관한다.
  5. 접착 테이프 필링에 의한 막대 외부 및 내부 세그먼트 수집.
    1. 명확한 접착 테이프 (1-2cm)의 스트립을 자르고 빠른 사용을 위해 테이프 디스펜서 / 실험실 벤치 / 등의 가장자리에 스트립을 보관하십시오.
    2. 껍질을 벗기기 위해 망막 샘플 하나를 플라스틱 60 x 15mm 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다. 여과지의 가장 바깥 쪽 가장자리 만 잡고 망막에 닿지 않도록하십시오.
    3. 무딘 팁 아이리스 가위 (또는 동등한 가위 유형)를 사용하여 작은 직사각형 테이프 조각을 조직의 대략적인 크기 (1.5 x 2.5mm)로 자릅니다.
    4. 동결건조된 망막 위에 작은 테이프 조각을 조심스럽게 깔고(그림 2B) 핀셋에 약간의 압력을 가하여 광수용체 층(주황색/분홍색 색조의 최상층)과 결합하는지 확인합니다.
    5. 테이프를 천천히 벗겨냅니다. 로드 외부 세그먼트(ROS) 및 로드 내부 세그먼트(RIS) 모두 테이프에 부착됩니다(그림 2B).
    6. 골절 된 표면에 얇은 흰색 필름이 있는지 확인하십시오. 이렇게 RIS.To RIS를 분리하고 다른 테이프 조각을 놓은 다음 테이프를 파단된 표면에 아래로 밀어 넣습니다(그림 2B).
      참고: 얇은 흰색 레이어 전체를 제거하는 데 테이프가 두 개 이상 필요할 수 있습니다.
    7. 주황색/분홍색 층만 있는 테이프 조각을 +ROS라고 표시된 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
    8. 얇은 흰색 층이 있는 테이프 또는 테이프 조각을 +RIS라고 표시된 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
      참고 : 동결 건조 된 망막을 테이프로 분리하는 것은 연습이 필요합니다. 테이프에 가해지는 압력의 양은 동결건조된 샘플이 어떻게 분획되는지에 영향을 미칩니다. 샘플 위에 테이프에 너무 많은 압력을 가하면 동결 건조 된 망막 전체가 여과지를 벗겨 내고 테이프에 달라 붙습니다. 테이프에 너무 적은 압력이 가해지면 주황색/분홍색 상단 레이어(+ROS)가 테이프에 달라붙지 않습니다.
    9. 테이프를 사용하여 여과지로부터 두껍고 하얀 층을 벗겨냄으로써 여과지 상에 위치한 남은 망막 조직(ROS 및 RIS 층의 bereft, -OIS)을 수집한다. 분리물을 -OIS로 표지된 튜브에 넣는다.
    10. 각 반으로 줄어든 망막 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
    11. 단백질 정량, 겔 전기영동 및 단백질 면역블롯을 같은 날 수행하는 경우 동결건조된 망막으로부터 분리된 층을 실온에서 보관하거나, 추후 사용을 위해 -80°C에서 무수 건조제로 채워진 용기(예: 50 mL 원뿔형 튜브)에 보관한다.

3. 박리 분리를위한 웨스턴 블롯 샘플 준비

  1. RIPA 용해 완충액 준비
    1. 100 mL 저장 병에서, 시약을 첨가하여 최종 농도인 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 및 1 mM EDTA를 얻었다. 탈이온화 초순수 100 mL를 넣고 완전히 섞는다.
      참고: RIPA 용해 완충액은 2-8°C에서 2-3주 동안 보관할 수 있습니다. 더 긴 보관을 위해, 분취량을 -20°C 냉동고에 보관한다.
    2. 실험 당일, 프로테아제 억제제 칵테일 (0.1 M PMSF, 1:1000 아프로티닌 및 1:1000 루펩틴)을 RIPA 용해 완충액에 첨가하고 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 여과지 박리 용해물 웨스턴 블롯을위한 준비
    1. 여과지 껍질 및 남은 박리된 망막을 함유하는 튜브가 얼음 위에 유지되는지(당일 실험을 위해) 또는 -80°C 냉동고 보관에서 제거되었는지 확인하고 얼음 위에 놓는다.
    2. 여과지 껍질이 들어있는 마이크로 원심분리 튜브의 바닥에서 과도한 액체를 제거하십시오. 미니 원심 분리기에서 2-4 초 동안 빠르게 회전하고 남아있는 액체를 버리십시오.
    3. 차가운 RIPA 완충액 45-55 μL를 피펫으로 여과지를 함유하는 튜브에 넣고 분리하였다.
    4. 각 샘플을 깨끗하고 오토클레이브 된 페슬 믹서로 1 분 동안 균질화하십시오. 여과지가 페슬 믹서와 닿아 있는지 확인하십시오. 여과지를 바닥이 아닌 각 튜브의 측면에 보관하십시오.
    5. 핀셋을 사용하여 여과지를 각 튜브의 측면으로 옮기고 미니 원심 분리기에서 2-4 초 동안 회전하십시오. 그러면 필터 용지에서 RIPA 버퍼가 제거됩니다.
    6. 건조 된 여과지를 제거하고 필요한 경우 각 튜브 내의 모든 필터 용지에 대해 반복하십시오.
    7. 균질액을 새 튜브로 옮기고 적절하게 라벨을 붙입니다.
      참고: 이 단계는 가장 시간이 많이 걸리는 단계이며, 제대로 완료되지 않으면 많은 샘플이 여과지에 흡수됩니다.
    8. 차가운 RIPA 버퍼 60-80 μL를 피펫으로 남은 박리된 망막과 함께 개별 튜브에 넣습니다.
    9. 각 샘플을 깨끗하고 오토클레이브 된 페슬 믹서로 1 분 동안 균질화하십시오.
  3. 테이프 필링 서부 블롯을위한 용해물 준비
    1. RT 동결건조된 샘플 또는 -80°C 샘플을 얼음 위에 놓는다.
    2. 차가운 RIPA 버퍼 50-70 μL를 +ROS 및 +RIS 테이프 껍질을 포함하는 각 튜브에 피펫.
    3. 60-80 μL의 냉 용해 완충액을 피펫 잔여 동결건조된 망막을 함유하는 -OIS 튜브에 넣고, ROS 및 RIS를 제거하였다.
    4. 각 샘플을 깨끗한 페슬 믹서로 1 분 동안 균질화하십시오. 개별 튜브의 테이프가 페슬 믹서 및 용해 버퍼와 접촉하고 있는지 확인하십시오.
    5. 멸균 된 핀셋으로 테이프를 튜브 옆으로 옮기고 미니 원심 분리기로 2-4 초 동안 회전하십시오. 이렇게하면 테이프에서 액체가 제거됩니다. 튜브에서 말린 테이프를 제거하십시오.
      참고: 이 시점에서 '여과지 박리' 또는 '테이프 필링' 방법을 위해 동일한 망막에서 분리한 두 개의 반 망막 분리물을 결합하여 BCA(bicinchoninic acid assay)를 수행하기에 충분한 부피를 확보할 수 있습니다.

결과

본 전략은 웨스턴 블롯 분석을 위해 특정 막대 세포 구획들 사이에서 단백질을 분리하고 분석하는 비교적 빠르고 간단한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 우리는 두 가지 순차적 박리 기술 (그림 1 및 그림 2)을 적용한 다음 면역 블롯팅을 적용하여 이러한 방법이 암흑 및 광 적응 동물 모두에서 막대 트랜스 듀신 (GNAT1) 및 어레스틴 (ARR1)의 알려진 분?...

토론

많은 망막 질환이 막대 광수용체 세포에 영향을 미쳐 막대 사망으로 이어지고 궁극적으로 완전한 시력 상실37로 이어집니다. 인간 망막 변성의 유전 적 및 기계론적 기원의 상당 부분이 수년에 걸쳐 수많은 마우스 모델에서 성공적으로 재생산되었습니다. 이러한 맥락에서, 작은 마우스 망막으로부터 개별 막대 하부 세포 구획을 쉽고 선택적으로 분리하는 능력은 망막 질환의 국?...

공개

저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 NIH Grant EY12155, EY027193 및 EY027387에서 JC에 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Spyridon Michalakis 박사(Caltech, Pasadena, USA)와 Natalie Chen(USC, Los Angeles, USA)에게 감사드립니다. 또한 저자가 제공한 영상을 수집하는 데 필요한 장비를 제공해 주신 Seth Ruffins 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)와 Janos Peti-Peterdi 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)에게도 감사드립니다. 소재지: Kasey Rose et al., 단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 분리, 분자 신경변성, [2017], [Springer Nature].

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapterN/AN/A
100% O2 tankN/AN/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μmGenesee Scientific25-235
4X SDS Sample BufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon tubeFisher Scientific14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tankN/AN/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonateSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, dihydrate)SigmaC-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)VWR100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes pellet pestleSigmaz359971
Labconco Fast-Freeze FlasksLabconcoN/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flaskN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/de-ionized waterEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (powder)J.T. Baker4062-01
NaCl (crystal)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, Free AcidEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Aluminum FoilReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)Scotch-3MN/A
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD67501
Spectrafuge mini centrifugeLabnet International, IncC1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machineSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm)Whatman/GE Healthcare1001-090
Wide bore transfer pipet, Global ScientificVWR76285-362

참고문헌

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

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