JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Özet

Çubuk fotoreseptörleri, farklı bölmelere sahip oldukça polarize duyusal nöronlardır. Fare çubukları uzun (~80 μm) ve incedir (~2 μm) ve retinanın en dış tabakasında, fotoreseptör tabakasında lateral olarak paketlenir ve bu da benzer hücre altı bölmelerin hizalanmasına neden olur. Geleneksel olarak, donmuş düz monte edilmiş retinanın teğetsel kesiti, farklı çubuk bölmeleri içindeki proteinlerin hareketini ve lokalizasyonunu incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, çubuk baskın fare retinasının yüksek eğriliği, teğetsel kesiti zorlaştırır. Kompartmanlar arasındaki protein taşınması çalışmasıyla motive olarak, çubuk dış segmentini (ROS) ve batı lekeleri için diğer hücre altı bölmeleri güvenilir bir şekilde izole eden iki soyma yöntemi geliştirdik. Nispeten hızlı ve basit tekniklerimiz, normal çubuklardaki önemli fotoreseptör proteinlerinin dağılımını ve yeniden dağılımını nicel olarak ölçmek için zenginleştirilmiş ve hücre altı spesifik fraksiyonlar sunar. Dahası, bu izolasyon teknikleri, hem sağlıklı hem de dejenere retina içindeki diğer hücresel tabakaların protein bileşimini izole etmek ve kantitatif olarak araştırmak için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Nöral retinanın en dış tabakasında sıkıca paketlenmiş çubuk fotoreseptör hücreleri, loş ışık görüşünün ayrılmaz bir parçasıdır. Sadık foton sayaçları olarak işlev görmek için, çubuklar, tek foton yakalamaya hızlı, güçlendirilmiş ve tekrarlanabilir tepkiler üretmek için fototransdüksiyon adı verilen G-proteini tabanlı bir sinyal yolu kullanır. Işığa verilen bu tepki nihayetinde plazma zarındaki akımda bir değişikliği tetikler ve daha sonra görsel sistemin geri kalanına sinyal verir1. Adından da anlaşılacağı gibi, her çubuk hücresi farklı bir çubuk benzeri şekle sahiptir ve bir dış segment (OS), iç segment (IS), hücre gövdesi (CB) ve sinaptik terminalden (ST) oluşan oldukça polarize bir hücresel morfoloji sergiler. Her hücre altı bölmenin kendine özgü protein makineleri (membrana bağlı ve çözünür), biyomoleküler özellikleri ve görsel fototransdüksiyon, genel temizlik ve protein sentezi ve sinaptik iletim gibi önemli roller oynayan protein kompleksleri vardır2,3.

30 yıldan fazla bir süre önce, hücre altı proteinlerin, özellikle transdüsin (işletim sisteminden uzak) ve arrestinin (işletim sistemine doğru) ışığa bağımlı karşılıklı hareketi ilk olarak gözlendi4,5,6,7. İlk başlarda, gözlemlenen bu fenomen, kısmen immünohistokimyanın epitop maskelemeye karşı savunmasızlığı nedeniyle şüphecilikle karşılandı8. 2000'li yılların başında, uyarana bağımlı protein translokasyonu, titiz ve zorlu bir fiziksel kesitleme tekniği kullanılarak doğrulandı9. Dondurulmuş düz monte kemirgen retinanın seri teğetsel kesitlenmesi ve ardından immünoblotlama, transdüsin9,10, arrestin11,12 ve recoverin13'ün hepsinin ışığa yanıt olarak hücre altı yeniden dağılıma uğradığını ortaya koymuştur. Bu anahtar sinyal proteinlerinin ışığa bağlı translokasyonunun sadece fototransdüksiyon kaskadının duyarlılığını düzenlemekle kalmayıp9,14,15, aynı zamanda ışık hasarına karşı nöroprotektif olabileceğine inanılmaktadır16,17,18. Çubuklardaki ışığa bağlı protein taşınması, çubuk hücresi biyolojisi ve fizyolojisi için çok önemli göründüğünden, protein dağılımını belirlemek için farklı hücre altı bölmelerin izolasyonuna izin veren teknikler değerli araştırma araçlarıdır.

Şu anda, çubuk hücre altı bölmelerini izole etmeyi amaçlayan birkaç yöntem vardır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğaltılması uzun ve zor olabilir veya büyük miktarda retinal izolat gerektirebilir. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme yoluyla çubuk dış segment (ROS) preparatları19, ROS'u retinal homojenattan ayırmak için yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem batı lekesi için yaygın olarak kullanılır, ancak prosedür çok zaman alır ve en az 8-12 murin retina20 gerektirir. Öte yandan, donmuş murin ve sıçan retinasının seri teğetsel kesiti, OS, IS, CB ve ST9,11,13'ün izole edilmesinde başarıyla uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, teğetsel kesitten önce retina tabakalarını hizalamak için küçük ve oldukça kavisli murin retinanın tamamen düzleştirilmesi gerekliliği nedeniyle teknik olarak zordur. Görsel sistemin hastalıklarını özetleyen çok sayıda fare modeli ve transgenik fare bulunduğundan, bireysel çubuk bölmelerini güvenilir, hızlı ve kolay bir şekilde ayıran bir tekniğin yaratılması, her bir özel bölmede meydana gelen fizyolojik süreçleri ve sağlık ve hastalıkta görsel süreçlerin altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmada umut vaat etmektedir.

Bu araştırmaları kolaylaştırmak için, çubuk hücre altı bölmelerini mevcut protokollerden daha kolay izole eden iki soyma yöntemi tanımladık. Yama kelepçesi kaydı21 için floresan olarak etiketlenmiş bipolar hücreleri açığa çıkarma tekniğinden uyarlanan ilk soyma yöntemi, ROS'u canlı, izole edilmiş bir murin retinadan sırayla çıkarmak için selüloz filtre kağıdı kullanır (Şekil 1). Üç primer retinal hücre tabakasını bir chick22 ve frog23 retinadan izole eden bir prosedürden uyarlanan ikinci yöntem, liyofilize bir retinadan ROS ve çubuk iç segmentini (RIS) çıkarmak için yapışkan bant kullanır (Şekil 2). Her iki prosedür de 1 saatte tamamlanabilir ve oldukça kullanıcı dostudur. Batı lekesi için bu iki ayırma protokolünün etkinliğinin, çubuk transdüsin (GNAT1) ve arrestinin (ARR1) ışığa bağlı translokasyonunu göstermek için C57BL / 6J farelerden karanlığa adapte olmuş ve ışığa maruz kalan retinayı kullanarak doğrulanmasını sağlıyoruz. Ayrıca, bant soyma yöntemini kullanarak, tekniğimizin immünositokimya (ICC) ve batı lekeleri tarafından elde edilen protein lokalizasyon verileri arasındaki tutarsızlıkları incelemek ve ele almak için kullanılabileceğine dair ek kanıtlar sunuyoruz. Spesifik olarak, tekniğimiz şunları göstermiştir: 1) protein kinaz C-alfa (PKCa) izoformu sadece bipolar hücrelerde değil, aynı zamanda düşük konsantrasyonlarda da olsa murin ROS ve RIS'de de bulunur24,25 ve 2) rodopsin kinaz (GRK1) ağırlıklı olarak izole edilmiş OS örneğinde bulunur. Bu veriler, spesifik çubuk ve retinal proteinleri ayırmak ve ölçmek için iki soyma tekniğimizin etkinliğini göstermektedir.

Protokol

Tüm deneyler, Güney Kaliforniya Üniversitesi'nden (USC) araştırma hayvanı bakımı komitesinin yerel kurumsal kurallarına göre gerçekleştirildi.

1. Canlı hücre retinal peeling yöntemi

  1. Ames tamponlarının, soyma kağıtlarının ve diseksiyon kabının hazırlanması
    1. Künt uçlu iris makası (veya eşdeğer makas tipi) kullanarak, selüloz filtre kağıdını (Grade 413) yaklaşık 5 mm x 2,5 mm boyutlarında dikdörtgenler halinde kesin. Kesimleri ileride kullanmak üzere saklayın.
    2. Bir şişe Ames 'Medium, 2.38 g HEPES ve 0.877 g NaCl'yi birleştirerek 1 L Ames HEPES tamponu hazırlayın. Reaktifleri damıtılmış ultra saf su ile steril bir cam şişede çözün ve ozmolarite ve pH'ı sırasıyla 280 mOsm ve 7.4'e ayarlayın. Sterilize etmek için filtre uygulayın (gözenek boyutu 0,2 μm), kapağı parafin film ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
    3. Bir şişe Ames Medium ve 1.9 g NaHCO3'ü birleştirerek 1 L Ames bikarbonat tamponu hazırlayın. Reaktifleri damıtılmış ultra saf su ile steril bir cam şişede çözün ve ozmolarite ve pH'ı sırasıyla 280 mOsm ve 7.4'e ayarlayın. Sterilize etmek için filtre uygulayın (gözenek boyutu 0,2 μm), kapağı parafin film ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Ames'in HEPES ve Ames'in bikarbonat tamponları önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de 1 hafta saklanabilir.
    4. 35 x 10 mm'lik bir Petri kabının altında, neşterli bir kafes veya dama tahtası deseni oluşturun (bıçak No. 11, 40 mm).
      NOT: Petri kabının dokulu alt kısmı, retina diseksiyonu sırasında izole edilmiş, serbest yüzen gözü yerinde tutar.
  2. Retina diseksiyonu
    NOT: Bu prosedür için, tampon odaya getirilmeli ve oda sıcaklığında (RT) tutulmalıdır. Ames'in bikarbonat tamponunu, diseksiyon sırasında taze karbojenlenmiş Ames'in bikarbonat tamponu ile her 15 dakikada bir yenileyin. Bu, gerekli fizyolojik pH'ı korur.
    1. Diseksiyondan yaklaşık 15-20 dakika önce, Ames'in HEPES tamponunu bir boru kapağı adaptörü ile donatılmış 100 mL'lik bir laboratuvarda veya ortam şişesinde oksijenlendirin ve Ames'in Bikarbonat tamponunu bir doku inkübasyon odasında ve bir boru kapağı adaptörü ile donatılmış 100 mL'lik bir laboratuvar veya medya şişesinde% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklayın.
    2. C57BL / 6J farelerinin (2-3 aylık) her iki cinsiyetinin eşit sayıda ötenazisini izofluran inhalasyonu veya karbondioksit (CO2) ve ardından servikal çıkık ile ötenazileştirin. Gözleri kavisli makasla enüklee edin ve gözleri kabarcıklı Ames'in bikarbonat tamponuyla doldurulmuş dokulu 35 x 10 mm Petri kabına yerleştirin.
    3. 18 G'lik bir iğne ile kornea-limbus kavşağındaki bir deliği delerek bir vizör kapağı oluşturun (Şekil 1A). Her gözün korneasını çıkarmak için mikro diseksiyon iris makası kullanarak bu kavşağın çevresi boyunca kesin. Lensi ve vitreus mizahını cımbız kullanarak her gözden ayırın ve atın.
    4. Retinal pigmentli epitel (RPE)-sklera-koroid kompleksini nöral retinadan dikkatlice soyarak retinayı göz kapağından izole edin. RPE-sklera-koroid kompleksini atın. Sadece kenarları tutarak diseksiyon sırasında retinanın hasar görmediğinden emin olun.
    5. Geniş delikli bir transfer pipeti kullanarak izole edilmiş retinayı, kabarcıklı Ames'in bikarbonat tamponuyla doldurulmuş 60 x 15 mm'lik bir kabın kapağına aktarın.
    6. Yarımküre şeklindeki retinayı içbükey yukarı doğru yönlendirin (fotoreseptörler çanağın dibine doğru bakmaktadır) ve iris makası veya neşter (bıçak No. 10, 40 mm) kullanarak her retinayı (optik sinir yoluyla) ikiye bölün. İki dikdörtgen yapmak için her yarım retinanın kavisli kenarlarını kesin (Şekil 1A).
      NOT: Her yarıya indirilmiş retinanın eğriliğini en aza indirmek, retinanın sonraki soyma adımlarında daha iyi düzleşmesini sağlar ve çubuk dış segmenti (ROS) tabakasının doğru bir şekilde soyulmasını sağlar.
    7. Yarıya indirilmiş retinayı, %95 O2 ve %5 CO2 ile sürekli kabarcıklanan doku kuluçka odasında saklayın.
      NOT: İzole retina, karbojenlenmiş Ames'in bikarbonat tamponunda ~ 24 saat boyunca tutulabilir.
  3. Filtre kağıdı soyma ile çubuk dış segment (ROS) toplama
    NOT: Gerekli fizyolojik pH'ı korumak için soyma işlemi sırasında RT oksijenli Ames'in HEPES tamponunu her 15-20 dakikada bir yenileyin.
    1. Geniş delikli transfer pipeti ve 5 mm x 2,5 mm filtre kağıdı ile doku odasından bir retinal dikdörtgeni, Ames'in %100 O2 ile kabarcıklanmış HEPES tamponuyla doldurulmuş 35 x 10 mm'lik Petri kabına aktarın.
    2. Bölümlenmiş retinayı içbükey yukarı doğru yönlendirin ve fotoreseptörlerin çanağın dibine doğru aşağı baktığından emin olun. Yarıya indirilmiş retinanın kenarlarını cımbızla hafifçe kavrayın ve filtre kağıdının üzerine getirin. Retina filtre kağıdı üzerinde ortalandıktan sonra, filtre kağıdını yukarı doğru hareket ettirin, böylece yarıya indirilmiş retina filtre kağıdına dokunarak ROS'tan filtreye kağıt yapışmasını oluşturur (Şekil 1B).
      NOT: Fotoreseptör tabakasının filtre kağıdı ile doğrudan temas ettiğinden emin olun.
    3. Filtre kağıdını, bağlı retina ile Ames'in HEPES tamponundan dikkatlice kaldırın. Filtre kağıdının alt tarafını (retinasız taraf) bir kağıt havluya yerleştirin ve kuruması için 2-3 kez sürün(Şekil 1B).
    4. Retina ile filtre kağıdının yan tarafına bir damla Ames HEPES ekleyin. Filtre kağıdını, az önce açıklandığı gibi kuruması için tekrar kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
    5. Filtre kağıdını retina ile tekrar Petri kabına yerleştirin. Cımbız kullanarak, yarıya indirilmiş retinanın tüm kenarlarını yavaşça yukarı doğru itin ve her taraftaki filtre kağıdından uzağa itin.
    6. Retinayı filtre kağıdından nazikçe soyun. Retinanın yapısal bütünlüğünü korumak için soyma işlemi sırasında retinanın sadece aşırı çevresine dokunun.
    7. Filtre kağıdını Petri kabından kaldırın ve kağıt havlu üzerindeki fazla sıvıyı çıkarın. Retina ile temas eden tarafın kağıt havluya temas etmediğinden emin olun.
    8. Kısmi ROS tabakasına sahip filtre kağıdını buz üzerinde etiketli bir tüpe yerleştirin (Şekil 1B). Soyulmuş retinayı Ames'in HEPES tamponuna batırılmış halde tutun.
    9. Tüm ROS tabakasını çıkarmak için bu yarıya inmiş retina için soyma işlemini yaklaşık 7-8 kez tekrarlayın. Her soyulduktan sonra, filtre kağıdını, yarıya indirilmiş bir retinadan izole edilmiş ROS'u içerecek olan aynı tüpe yerleştirin.
      NOT: Bu işlem sırasında retina inceldiği için yarıya incelmiş retinayı filtre kağıdından soyarken yırtmamaya dikkat edin.
    10. İzole edilmiş ROS'un tüm filtre kağıdı kabuklarını içeren tüpü hemen kullanılmak üzere buzun üzerine yerleştirin veya doğrudan kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
    11. Artık soyulmuş retinayı (ROS'tan yoksun) uygun şekilde etiketlenmiş bir tüpe aktarmak için cımbız kullanın. Tüpü hemen kullanmak için buzun üzerine yerleştirin veya kuru buzla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
    12. Her yarıya indirilmiş retina için soyma işlemini tekrarlayın ve her tüpü doğru bir şekilde etiketleyin.

2. Liyofilize retina peeling yöntemi

  1. Tamponlar, soyma ortamı, diseksiyon kabı hazırlama ve liyofilizatör kurulumu
    1. 1 L'lik bir saklama şişesinde, 500 mL damıtılmış ultra saf su ekleyerek Ringer çözeltisini hazırlayın. 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 0,02 mM EDTA'nın nihai konsantrasyonuna ulaşmak için reaktifleri çözün. NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın, son hacmi 1 L'ye getirmek için ultra saf su ekleyin ve ozmolariteyi 313 mOsm'a ayarlayın.
    2. Kullanmadan önce, Ringer'ın çözeltisini steril bir filtreyle (gözenek boyutu 0,2 μm) filtreleyin, kapağı parafin filmle kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
    3. Künt uçlu iris makası (veya eşdeğer makas tipi) kullanarak, selüloz filtre kağıdını yaklaşık 5 mm x 2,5 mm boyutlarında dikdörtgenler halinde kesin. Benzersiz bir etiket oluşturmak üzere filtre kağıdının bir tarafına yazmak için kalem kullanın.
    4. Bir neşter kullanarak 35 x 10 mm'lik bir Petri kabının altında bir kafes veya dama tahtası deseni oluşturun (bıçak No. 11, 40 mm).
    5. Liyofilizatörü üreticinin spesifikasyonlarına göre açın.
    6. Bir Dewar şişesinde veya benzeri bir yalıtım vakum şişesinde sıvı azot elde edin.
  2. Retina diseksiyonu
    1. Retina diseksiyonunu protokolün 1. bölümünde açıklandığı gibi tamamlayın (Şekil 1A). Ames tamponu yerine soğuk Ringer çözeltisini kullanın.
    2. Diseksiyon sonrasında, yarıya indirilmiş, dikdörtgen retinayı soğuk Ringer çözeltisi ile doldurulmuş 35 x 10 mm'lik bir Petri kabında saklayın ve buzun üzerine yerleştirin.
  3. Liyofilizasyon için retinal numune hazırlama
    1. 5 x 2,5 mm'lik bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve yarıya indirilmiş bir retinayı, soğuk Ringer tamponuyla doldurulmuş tekstüre edilmiş 35 x 10 mm Petri kabına aktarın. Her retinayı bulaşıklar arasında hareket ettirmek için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın.
    2. Retinayı dikkatlice çevirmek için cımbız kullanın, böylece içbükey olarak yönlendirilir (fotoreseptörler yukarı doğru işaret eder) ve filtre kağıdının üstünde duracak şekilde hareket ettirin (Şekil 2A).
      NOT: Fotoreseptörlerin filtre kağıdına temas etmediğinden (retinal ganglion hücre tabakası filtre kağıdıyla doğrudan temas halinde olmalıdır) ve benzersiz etiketin görünür olduğundan emin olun. Retinal izolatı kolay ve hızlı bir şekilde tanımlamak için, benzersiz etiketin filtre kağıdının alt tarafına yerleştirilmesi önerilir.
    3. Yarıya indirilmiş retina parçasının filtre kağıdına dokunması için filtre kağıdını kenarlarından yukarı doğru kaldırın ve filtre kağıdını Ringer çözeltisinden çıkarmaya devam edin.
    4. Filtre kağıdının alt tarafını (üzerinde retina olmayan taraf) bir kağıt havluya yerleştirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için 2-3 kez dikkatlice süzün (Şekil 2A).
    5. Cımbızlı filtre kağıdını alın ve retinalı filtre kağıdının yan tarafına bir damla soğuk Ringer ekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdını tekrar kağıt havluya yerleştirin. İşlemi iki kez daha tekrarlayın.
      NOT: Bu alternatif ıslatma ve kurutma adımları, mendilin filtre kağıdına sıkıca tutturulmasını sağlar.
    6. Yapıştırılan her retina/filtre kağıdı numunesini, tüm numuneleri dondurmaya hazır olana kadar soğuk Ringer'larla dolu bir Petri kabında saklayın. Bu işlemi yarıya indirilmiş tüm retinalar için tekrarlayın.
    7. Temiz ve kuru bir 35 x 10 mm Petri kabı (yalnızca altta) ve 3,5 x 3,5 inç kareye kesilmiş bir parça alüminyum folyo elde edin.
    8. Her numuneyi cımbızla soğuk Ringer'ın tamponundan kaldırın. Cımbızların yalnızca filtre kağıdı kenarlarına temas ettiğinden ve yarıya inmiş retinadan kaçındığından emin olun.
    9. Her filtre kağıdının alt tarafını (üzerinde retina olmayan taraf) bir kağıt havluya yerleştirin ve fazla sıvıyı çıkarın.
    10. Filtre kağıdının retinanın yapıştığı yan tarafına bir damla soğuk 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) ekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdını kağıt havlunun üzerine sokun.
      NOT: Donmadan önce filtre kağıdındaki nemin yeterince çıkarıldığından emin olun.
    11. Tüm filtre kağıdı parçalarını 35 x 10 mm Petri kabına yerleştirin. Filtre kağıdını çevreleyen fazla sıvıyı uzaklaştırmak için tüy bırakmayan bir mendil kağıdı kullanın.
      NOT: Petri kabını örneklerle aşırı doldurmayın. Dörtten fazla murin gözü kullanılıyorsa, retina / filtre kağıdı örneklerini tutmak için daha büyük bir Petri kabı veya birden fazla küçük Petri kabı kullanmayı düşünün.
    12. Tüm tabağı alüminyum folyo ile sıkıca sarın. Alüminyum folyonun kenarlarının sabitlendiğinden ve Petri kabının dibine düzgün bir şekilde bastırıldığından emin olun. Alüminyum folyo kapağına bir avuç dolusu 0,1-0,2 mm delik açın (Şekil 2A).
    13. Metal maşaları kullanarak, alüminyum folyo kaplı Petri kabını yavaş yavaş sıvı azota indirin. Liyofilize hazır olana kadar numuneleri sıvı azotta (<10 dk) tutun.
  4. Liyofilizasyon
    1. Alüminyum folyo kaplı Petri kabını dondurarak kuruyan bir şişeye yerleştirin ve üreticinin protokolünü izleyerek liyofilizatör makinesine takın. Retinayı 30 dakika boyunca liyofilize edin.
    2. Şişeyi liyofilizatörden çıkarın ve üreticiye göre makineyi kapatın.
    3. Alüminyum folyoyu çıkarın ve dondurularak kurutulmuş numunelerle aynı gün çalışın veya uygun şekilde etiketlenmiş 1 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Bu tüpleri susuz bir kurutucu ile doldurulmuş bir kaba (50 mL konik tüp gibi) yerleştirin ve numuneleri -80 ° C'de saklayın.
  5. Yapışkan bant soyma ile çubuk dış ve iç segment toplama.
    1. Şeffaf yapışkan bant şeritlerini (1-2 cm) kesin ve hızlı kullanım için şeritleri bant dağıtıcısının / laboratuvar tezgahının / vb. kenarında saklayın.
    2. Bir retina örneğini soymak için plastik 60 x 15 mm Petri kabın kapağına taşıyın. Filtre kağıdının yalnızca en dış kenarlarını tuttuğunuzdan ve retinaya dokunmaktan kaçındığınızdan emin olun.
    3. Künt uçlu iris makası (veya eşdeğer makas tipi) kullanarak, küçük bir dikdörtgen bant parçasını dokunun yaklaşık boyutuna (1,5 x 2,5 mm) kesin.
    4. Liyofilize retinanın üzerine dikkatlice küçük bir bant parçası yerleştirin (Şekil 2B) ve fotoreseptör tabakasıyla (turuncu / pembe renkli üst tabaka) yapıştığından emin olmak için cımbızla hafif bir basınç uygulayın.
    5. Bandı yavaşça soyun. Hem çubuk dış segmenti (ROS) hem de çubuk iç segmenti (RIS) banda yapıştırılacaktır (Şekil 2B).
    6. Kırık yüzeyde ince beyaz bir film olduğundan emin olun. Bu, RIS'yi ayırmak, başka bir bant parçası yerleştirmek ve bandı kırık yüzeye aşağı itmek RIS.To (Şekil 2B).
      NOT: İnce beyaz tabakanın tamamını çıkarmak için birden fazla bant parçası gerekebilir.
    7. Bant parçasını sadece turuncu / pembe tabaka ile +ROS etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    8. Bandı veya bant parçalarını ince beyaz tabaka ile +RIS etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      NOT: Liyofilize retinanın bantla ayrılması pratik gerektirir. Banda uygulanan basınç miktarı, liyofilize numunenin nasıl parçalanacağını etkileyecektir. Numune üzerindeki bant üzerine çok fazla basınç uygulanırsa, tüm liyofilize retina filtre kağıdını soyacak ve banda yapışacaktır. Banda çok az basınç eklenirse, turuncu/pembe üst katman (+ROS) banda yapışmaz.
    9. Filtre kağıdı üzerinde bulunan artık retina dokusunu (ROS ve RIS tabakalarından yoksun, -OIS) filtre kağıdındaki kalın, beyaz tabakayı bant kullanarak soyarak toplayın. İzolatı -OIS etiketli bir tüpe yerleştirin.
    10. Her yarıya indirilmiş retina örneği için bu adımları tekrarlayın.
    11. Liyofilize retinadan izole edilen katmanları, aynı gün protein miktarı, jel elektroforezi ve protein immünobolitleri yapılırsa oda sıcaklığında saklayın veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de susuz kurutucu ile doldurulmuş bir kapta (50 mL konik tüp gibi) saklayın.

3. Soyma izolasyonları için Western blot numunesi hazırlama

  1. RIPA lizis tamponunu hazırlama
    1. 100 mL'lik bir saklama şişesinde, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl,% 1 Triton X-100,% 1 Sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS ve 1 mM EDTA'lık nihai konsantrasyon elde etmek için reaktifler ekleyin. 100 mL deiyonize ultra saf su ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: RIPA lizis tamponu 2-8 °C'de 2-3 hafta saklanabilir. Daha uzun süre saklamak için, aliquot yapın ve -20 °C dondurucuda saklayın.
    2. Deney gününde, RIPA lizis tamponuna bir proteaz inhibitörü kokteyli (0.1 M PMSF, 1: 1000 Aprotinin ve 1: 1000 Leupeptin) ekleyin ve buz üzerinde tutun.
  2. Batı lekesi için filtre kağıdı soyma lizat hazırlama
    1. Filtre kağıdı kabuklarını ve artık soyulmuş retinayı içeren tüplerin buz üzerinde tutulduğundan (aynı günkü deney için) veya -80 °C dondurucu deposundan çıkarıldığından ve buz üzerine yerleştirildiğinden emin olun.
    2. Filtre kağıdı kabuklarını içeren mikrosantrifüj tüplerinin tabanındaki fazla sıvıyı çıkarın. Mini bir santrifüjde 2-4 sn hızla döndürün ve kalan sıvıyı atın.
    3. Pipet, 45-55 μL soğuk RIPA tamponunu içeren tüplere filtre kağıdı izolatı içerir.
    4. Her numuneyi temiz, otoklavlanmış bir havane karıştırıcı ile 1 dakika boyunca homojenize edin. Filtre kağıdının havaneli karıştırıcı ile temas halinde kaldığından emin olun. Filtre kağıdını her tüpün alt kısmında değil, yan tarafında tutun.
    5. Cımbızla, filtre kağıtlarını her borunun yanına hareket ettirin ve mini santrifüjde 2-4 sn boyunca döndürün. Bu, RIPA arabelleğini filtre kağıdından kaldırır.
    6. Kurutulmuş filtre kağıdını çıkarın ve gerekirse her tüp içindeki tüm filtre kağıtları için tekrarlayın.
    7. Homojenatı yeni bir tüpe aktarın ve uygun şekilde etiketleyin.
      NOT: Bu en çok zaman alan adımdır ve düzgün bir şekilde tamamlanmazsa, numunenin çoğu filtre kağıdı tarafından emilecektir.
    8. Pipet, 60-80 μL soğuk RIPA tamponunu, artık soyulmuş retina ile tek tek tüplere yerleştirin.
    9. Her numuneyi temiz, otoklavlanmış bir havane karıştırıcı ile 1 dakika boyunca homojenize edin.
  3. Bant soyma Batı lekesi için lizat hazırlama
    1. RT liyofilize numuneleri veya -80 °C numuneleri buz üzerine yerleştirin.
    2. Pipet, +ROS ve +RIS bant kabukları içeren her tüpün içine 50-70 μL soğuk RIPA tamponu yerleştirin.
    3. Pipet, 60-80 μL soğuk lizis tamponunu, kalan liyofilize retinayı içeren -OIS tüplerine, ROS ve RIS çıkarılarak alınır.
    4. Her numuneyi temiz bir havaneli mikser ile 1 dakika homojenize edin. Tek tek tüplerdeki bandın havane karıştırıcısı ve lizis tamponu ile temas halinde kaldığından emin olun.
    5. Sterilize cımbızla, bandı tüplerin yanına hareket ettirin ve 2-4 s için mini bir santrifüjle döndürün. Bu, sıvıyı banttan çıkaracaktır. Kurutulmuş bandı tüplerden çıkarın.
      NOT: Bu noktada, bibinkoninik asit testi (BCA) yapmak için yeterli hacme sahip olduğunuzdan emin olmak için 'filtre kağıdı soyma' veya 'bant soyma' yöntemi için aynı retinadan iki yarım retinal izolatı birleştirebilirsiniz.

Sonuçlar

Mevcut stratejiler, batı leke analizi için spesifik çubuk hücre altı bölmeleri arasındaki proteinleri izole etmek ve analiz etmek için nispeten hızlı ve basit yöntemler sağlamak üzere geliştirilmiştir. İki ardışık soyma tekniği (Şekil 1 ve Şekil 2) uyguladık ve ardından bu yöntemlerin hem karanlık hem de ışığa adapte olmuş hayvanlarda çubuk transdüsin (GNAT1) ve arrestinin (ARR1) bilinen dağılımını tespit etmek için güveni...

Tartışmalar

Birçok retina hastalığı çubuk fotoreseptör hücrelerini etkileyerek çubuk ölümüne ve nihayetinde tam görme kaybına yol açar37. İnsan retinal dejenerasyonunun genetik ve mekanik kökenlerinin önemli bir kısmı, yıllar boyunca çok sayıda fare modelinde başarıyla özetlenmiştir. Bu bağlamda, bireysel çubuk hücre altı bölmelerini küçük fare retinasından kolayca ve seçici olarak ayırma yeteneği, retina hastalıklarının lokalize biyokimyasal ve moleküler temelleri ha...

Açıklamalar

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma JC'ye NIH Grant EY12155, EY027193 ve EY027387 tarafından desteklenmiştir. Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, ABD) ve Natalie Chen'e (USC, Los Angeles, ABD) makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, ABD) ve Dr. Janos Peti-Peterdi'ye (USC, Los Angeles, ABD) yazarın sağladığı görüntüleri toplamak için gerekli ekipmanı sağladıkları için teşekkür ederiz. Materyal: Kasey Rose ve ark., Protein analizi için fare retinasında fotoreseptör hücre bölmelerinin ayrılması, Moleküler Nörodejenerasyon, yayınlanan [2017], [Springer Nature].

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapterN/AN/A
100% O2 tankN/AN/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μmGenesee Scientific25-235
4X SDS Sample BufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon tubeFisher Scientific14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tankN/AN/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonateSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, dihydrate)SigmaC-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)VWR100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes pellet pestleSigmaz359971
Labconco Fast-Freeze FlasksLabconcoN/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flaskN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/de-ionized waterEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (powder)J.T. Baker4062-01
NaCl (crystal)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, Free AcidEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Aluminum FoilReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)Scotch-3MN/A
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD67501
Spectrafuge mini centrifugeLabnet International, IncC1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machineSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm)Whatman/GE Healthcare1001-090
Wide bore transfer pipet, Global ScientificVWR76285-362

Referanslar

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır