JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقة لزرع وتحديد كرويات الخلايا البشرية في أجنة الكتاكيت. يستخدم نموذج الطعم الغريب هذا البيئة المكروية الجنينية كمصدر للإشارات الإرشادية لفحص هجرة الخلايا والتمايز والانتحاء وهو مناسب بشكل خاص لدراسة مجموعات الخلايا الأولية و / أو غير المتجانسة.

Abstract

Xenografts هي طرق قيمة للتحقيق في سلوك الخلايا البشرية في الجسم الحي. على وجه الخصوص ، توفر البيئة الجنينية إشارات لهجرة الخلايا والتمايز والتشكل ، مع إشارات إرشادية فريدة وهوية الطبقة الجرثومية التي غالبا ما تكون غائبة عن نماذج الطعم الغريب للبالغين. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للنماذج الجنينية التمييز بين الأنسجة الذاتية والأنسجة غير الذاتية ، مما يلغي خطر رفض الكسب غير المشروع والحاجة إلى قمع المناعة للمضيف. تقدم هذه الورقة منهجية لزرع كرويات الخلايا البشرية في أجنة الدجاج ، والتي يمكن الوصول إليها ، وقابلة للتلاعب ، وتتطور عند 37 درجة مئوية.

تسمح الكرويات باختيار منطقة معينة من الجنين للزرع. بعد التطعيم ، يتم دمج الخلايا في الأنسجة المضيفة ، مما يسمح بمتابعة هجرتها ونموها وتمايزها. هذا النموذج مرن بما يكفي للسماح باستخدام مجموعات مختلفة ملتصقة ، بما في ذلك مجموعات الخلايا الأولية غير المتجانسة والخلايا السرطانية. للتحايل على الحاجة إلى وضع العلامات المسبقة على الخلايا ، يتم أيضا وصف بروتوكول لتحديد الخلايا المانحة من خلال تهجين مجسات Alu الخاصة بالإنسان ، وهو أمر مهم بشكل خاص عند التحقيق في مجموعات الخلايا غير المتجانسة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف مجسات الحمض النووي بسهولة لتحديد الأنواع المانحة الأخرى. سيصف هذا البروتوكول الطرق العامة لتحضير الفيريات ، والتطعيم في أجنة الدجاج ، وتثبيت ومعالجة الأنسجة لتقسيم البارافين ، وأخيرا تحديد الخلايا البشرية باستخدام تهجين الحمض النووي في الموقع . ستتم مناقشة الضوابط المقترحة وأمثلة على تفسير النتائج وسلوكيات الخلية المختلفة التي يمكن فحصها بالإضافة إلى قيود هذه الطريقة.

Introduction

Xenografts هي أدوات مفيدة للتحقيق في سلوك الخلايا البشرية في الجسم الحي. قدمت هذه النماذج معلومات لا تقدر بثمن لمجموعة واسعة من الموضوعات العلمية ، مثل بيولوجيا الخلايا الجذعية البشرية1 ، ومراقبة الأحداث الخلوية في الوقت الفعلي2 ، والتحقيق في تكوين الأوعية الدموية الورمية والورم الخبيث3. بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة العديد من جوانب بيولوجيا السرطان ، بما في ذلك تكوين الأورام في الطعوم الغريبة الخاصة بالمريض، 4،5. كل نموذج من نماذج xenograft هذه له مزاياه وعيوبه ، وبالتالي ، فإن كل نموذج مناسب بشكل أفضل لأسئلة علمية محددة. أجنة الكتاكيت هي نموذج بيولوجي تنموي شائع لأنها نموذج سلى يمكن الوصول إليه وقابل للتلاعب الجراحي. سمحت الطعوم غير المتجانسة للباحثين بإنشاء خرائط مصير دقيقة6 أو استكشاف ما إذا كانت السمة مستقلة عن الخلايا أو توجهها البيئة7،8. يسمح الأساس المنطقي المماثل باستخدام جنين الفرخ كنموذج غريب لدراسة سلوك الخلايا البشرية.

تنسق البيئة الجنينية بنشاط تشكل الأنسجة مع إشارات الهجرة والتمايز ، بالإضافة إلى تفاعلات الخلية الخلوية. وبالتالي ، بالمقارنة مع نماذج الطعم الغريب للبالغين ، يوفر الجنين بيئة أكثر إفادة لفحص سلوك الخلايا المطعمة ، على سبيل المثال ، عن طريق محاكاة الإشارات الموجودة في منافذ الخلايا الجذعية البالغة (على سبيل المثال ، BMPs و WNTs و NOTCH و SHH9). بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود نظام مناعي تكيفي أثناء التطور المبكر يسمح بإجراء الطعوم الغريبة دون التعرض لخطر الاستجابة المناعية أو رفض الأنسجة المانحة10. بحثت الدراسات السابقة في الطعوم الغريبة للخلايا البشرية في أجنة الدجاج لهذا الغرض. تم فحص الإمكانات العصبية للخلايا الجذعية البشرية بعد الحقن في الأنبوب العصبي أو الأوعية الدموية11 بالإضافة إلى دمج الخلايا الجذعية الجنينية12 والخلايا الجذعية المستحثةمتعددة القدرات 13 في الجنين. كما تمت دراسة خلايا الورم الميلانيني البشري باستخدام البيئة الجنينية للكتكوت ، والتي كشفت عن روابط بين تكوين الأورام وسلوك خلايا القمة العصبية14 ، بالإضافة إلى إعادة برمجة الخلايا السرطانية بالمعلومات من الجنين15. تصف هذه الورقة بروتوكولا مناسبا بشكل خاص لدراسة سلوك مجموعات الخلايا الأولية وغير المتجانسة البشرية.

في العقود الماضية ، تمت دراسة المكون اللحمي للأنسجة المتنوعة كمصدر ذاتي للخلايا السلفية / الجذعية ولخصائصه المسببة للأوعية والمنظمة المناعية ، والتي كانت تعرف سابقا باسم "الخلايا الجذعية الوسيطة" 16 ، 17 ، 18. كانت أول مجموعات الخلايا هذه التي تم تمييزها هي مجموعة الخلايا اللحمية / الجذعية لنخاع العظم (BMSCs) ، والتي لها إمكانات عظمية ، وأديبو ، وبدرجة أقل ، غضروفية في الجسم الحي19،20. الخلايا اللحمية المشتقة من الدهون (ADSCs) هي مجموعة غير متجانسة يتم الحصول عليها عن طريق الهضم الأنزيمي لعينات الشحم أو استئصال الجلد ، متبوعا بعزل الجزء اللحمي الوعائي (SVF) وأخيرا التوسع في الثقافة21. في الثقافة ، تتميز هذه الخلايا ظاهريا بعلامات مشتركة مع مجموعات اللحمة المتوسطة الأخرى ، مثل CD90 و CD73 و CD105 و CD44 ، وعلامات فريدة مثل CD36 ، وغياب علامات المكونة للدم (CD45) أو البطانية (CD31)22. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع ADSCs بإمكانات عظمية وأديبو وغضروفية في المختبر ، ويمكن تحديد عدد الخلايا الجذعية / السلفية في هذه المجموعة من خلال وحدة تشكيل مستعمرة الأرومة الليفية (CFU-F)22. في الجسم الحي ، تم الإبلاغ عن وجود خلايا ذات النمط الظاهري ل ADSC في اللحمة23 و / أو24 مقصورة حول الأوعية الدموية. أصبح من الواضح بشكل متزايد أنه على الرغم من مشاركة العلامات بعد الثقافة في المختبر ، فإن الحيز اللحمي للأنسجة المختلفة يعكس الخصائص الجوهرية لعضو معين ، وهذه الخلايا لها خصائص مميزة اعتمادا على مصدرها17،25،26،27. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذه الخلايا معزولة بناء على التصاقها بطبق زراعة الخلايا ، فقد تتكون من خلايا من طبقات جرثومية متنوعة28. وبالتالي ، فإن استخدام طريقة xenograft لدراسة إمكانات التمايز والانتوائية للخلايا اللحمية بطريقة غير متحيزة يمكن أن يوفر معلومات قيمة حول مجموعات الخلايا هذه لتوجيه تطوير العلاجات الخلوية المستقبلية.

البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 1) هو طريقة xenograft تستفيد من التكلفة المنخفضة وسهولة التلاعب بأجنة الكتاكيت. لقد تم استخدامه سابقا لدراسة سلوك ADSCالبشري 29 ، والخلايا الليفية الجلدية29 ، والخلايا اللحمية المشتقة من دم الدورةالشهرية 30 ، وخلايا الورم الأروميالدبقي 31. ستشمل هذه الطريقة زرع الخلايا على شكل كرويات32 ، والتي يمكن تحضيرها من أي مجموعة من الخلايا الملتصقة (الشكل 2). سيتم أيضا وصف الإجراءات الجراحية وإعداد المواد الجراحية المخصصة - المشارط الدقيقة والشعيرات الدموية الزجاجية - (الشكل 3). يتم الكشف عن الخلايا البشرية في الأقسام النسيجية عن طريق تهجين مجسات Alu الخاصة بالإنسان (الشكل 4) ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى وضع العلامات المسبقة للخلايا المطعمة. تصف النتائج التمثيلية سلوك ADSC البشري المطعمة في كل من المنطقة السميطية على مستوى برعم الجناح (الشكل 5 والشكل 6 والشكل 7) والقوس البلعومي الأول (الشكل 8) ، بالإضافة إلى الورم الأرومي الدبقي الأولي البشري المطعمة في الدماغ (الشكل 8). سيتم وصف هجرة الخلايا والتمايز والتفاعل مع الأنسجة الجنينية للكتكوت ، بالإضافة إلى المقايسات المقترحة لمزيد من التحقيق في سلوك الخلية باستخدام التلوين المشترك أو تلطيخ الأقسام المجاورة.

Protocol

امتثلت جميع الإجراءات في الجسم الحي المستخدمة في هذه الدراسة لجميع الإرشادات التجريبية ذات الصلة للتجارب والأبحاث على ، وفقا للإرشادات البرازيلية لاستخدام التجريبية (L11794). تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المستخدمة للتعامل مع أجنة الدجاج من قبل لجنة الأخلاقيات حول استخدام في التجارب العلمية (مركز العلوم الصحية التابع لجامعة ريو دي جانيرو الفيدرالية). تمت الموافقة على استخدام الخلايا البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة كليمنتينو فراغا فيلهو (الرقمان 043/09 و 088/04). تم استخدام بيض محدد خال من مسببات الأمراض (SPF) لدجاج White Leghorn (Gallus gallus).

1. تحضير الخلايا الكروية

ملاحظة: يمكن تحضير كرويات الخلايا بمجموعة واسعة من أنواع الخلايا طالما أنها ملتصقة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم عزل الخلايا اللحمية المشتقة من الدهون البشرية (ADSCs) كما هو موضح سابقا، وسيتم استخدام 21،27 (الشكل 2 أ). تم الحصول على الخلايا عن طريق هضم شظايا الأنسجة الدهنية أو الشحم مع الكولاجيناز IA لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية تحت التحريض ، متبوعا بالطلاء عند 1-2 × 104 خلايا / سم2 والحضانة بين عشية وضحانة. تم التخلص من الخلايا غير الملتصقة ، وتم توسيع الخلايا الملتصقة لمدة 3-6 مآمر. كانت ADSCs متجانسة للتعبير عن المستضدات السطحية CD105 و CD90 و CD13 و CD44 وسالبة بالنسبة للمستضدات المكونة للدم CD45 و CD14 و CD34 و CD3 و CD1927. في حين أن الطريقة الموضحة هنا يمكن تنفيذها بسهولة باستخدام الحد الأدنى من المواد بما يتجاوز ما هو مستخدم بشكل روتيني لزراعة الخلايا ، يجب تحديد وقت التجميع الأمثل والحاجة إلى التفكك الجزئي تجريبيا. يمكن استخدام طرق بديلة لتحضير الخلايا الكروية ، مثل طريقة التعليق33 أو الآبار المطلية بالأغاروز34. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل. يجب تنفيذ جميع الإجراءات على مقعد نظيف باستخدام تقنيات التعقيم.

  1. قم بتسخين PBS المعقم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، ووسط الثقافة ، ومحلول التربسين إلى 37 درجة مئوية قبل التلاعب بالخلايا.
  2. مزرعة ADSCs في DMEM منخفض الجلوكوز مكملة بمصل الأبقار الجنينية 10٪ (FBS) و 2 ملي مولار ل-جلوتامين و 100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. استخدم قارورة ملتقية مقاس 25 سم2 من ADSCs لإعداد طبقين من الكرويات. تخلص من وسط المزرعة واغسل طبق المزرعة ثلاث مرات بكمية مناسبة من PBS المعقم (5 مل PBS لكل غسلة إذا تم استخدام قارورة ثقافة خلية25 سم 2 ).
  3. أضف ما يكفي من محلول التربسين (يحتوي على 0.78 ملي مولار EDTA) لتغطية الخلايا (1 مل من محلول التربسين إذا تم استخدام قارورة ثقافة خلية مقاس 25 سم2 ) واترك قارورة المزرعة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بربط الخلايا برفق لأعلى ولأسفل لفصلها. أضف نفس الكمية من وسط الاستزراع الذي يحتوي على FBS لتعطيل التربسين ، وانقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 180 × جم. تخلص من المادة الطافية ، واضغط على الأنبوب لفك الحبيبات.
  6. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر -2 مل من وسط المزرعة المناسب لنوع الخلية (انظر الخطوة 1.2).
    ملاحظة: الحد الأدنى للتركيز هو 5 × 105 خلايا / مل للخلايا الملتصقة مثل ADSCs والخلايا الليفية. يجب إعادة تعليق قارورة متجانسة مقاس 25 سم2 من ADSCs في 2 مل من المتوسط وطلاءها في 2 طبق بتري ، باستخدام 1 مل لكل منهما. قد تستفيد الخلايا الأقل التصاق ، مثل الخلايا الدبقية ، من الطلاء عند ~ 2 × 106 خلايا / مل بحجم أقل.
  7. انقل معلق الخلية بعناية إلى جانب واحد من طبق بتري معقم مقاس 60 مم (غير مطلي وغير معالج ، مثل تلك المستخدمة في تحضير ألواح الأجار). حاول تقييد وسط الاستزراع في أصغر مساحة ممكنة (الشكل 1 ب) عن طريق دعم الطبق فوق قطعة من الشاش المطوي والنظيف لإبقائه مائلا في الحاضنة.
  8. احتضان معلق الخلية عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، حتى تتشكل مجاميع الخلية (6-8 ساعات بعد طلاء ADSCs).
    ملاحظة: قد يختلف وقت التجميع الكروي وفقا لنوع الخلية.
  9. إذا لزم الأمر (انظر المناقشة) ، قم بفصل مجاميع الخلايا الكبيرة جزئيا عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام أطراف 1000 ميكرولتر. فصل الكرات الكروية ADSC بعد 6-8 ساعات من الطلاء.
  10. ضع اللوحة في الحاضنة حتى تصبح الكرويات جاهزة للزرع: مستديرة بحواف محددة ولا يمكن تشتيتها بسهولة (الشكل 1 ج ، د).
    ملاحظة: تكون المركبات ADSC جاهزة بعد يومين من التفكك الجزئي.

2. زرع الكرويات في أجنة الكتاكيت

  1. اعداد
    1. تحضير بيض الدجاج عن طريق احتضان 15-30 بيضة في حاضنة رطبة عند 37.5 درجة مئوية حتى تصل مرحلة هامبرغر هاميلتون (HH) المرغوبةإلى 35: 40-45 ساعة للطعوم في الجسيدات على مستوى برعم الأطراف (HH11-12 أو 13-19 جسدات) أو 29-33 ساعة للطعوم في المنطقة الرأسية (HH8-9 أو 5-8 جسدات). ضع البيض أفقيا ، وارسم خطا بقلم رصاص أعلى البيض قبل الحضانة (الشكل 3 د).
      ملاحظة: قد تختلف أوقات الحضانة قليلا وفقا للحاضنات الفردية. سيضمن رسم خط أنه يمكن التعرف بسهولة على الجزء العلوي من البويضة ، حيث يوجد الجنين ، إذا تم تدوير البويضة قبل التجربة.
    2. قم بإعداد إبر حادة ("مشارط دقيقة") عن طريق ربط إبرة الخياطة بحامل إبرة معدنية (الشكل 3 ب). باستخدام حجر شحذ مدهون بالزيت ، شحذ الإبرة حتى تشبه مشرطا صغيرا بحافة رفيعة (الشكل 3 ج). بدلا من ذلك ، قم بإعداد إبرة تنجستن حادة عن طريق التحليل الكهربائي36.
    3. قم بإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام لهب موقد بنسن لإذابة الجزء الرقيق من ماصة باستور الزجاجية لفترة وجيزة. قم بإزالة الجزء المنصهر من اللهب وقم بتمديده لتشكيل شعرية رقيقة. قسم الشعيرات الدموية بعناية إلى قسمين عن طريق كسرها بالملقط الدقيق. قم بإعداد شعرية رقيقة لحقن الحبر الهندي وشعيرات الدموية السميكة لنقل الكرويات (الشكل 3 ب).
      ملاحظة: من خلال تغيير قوة السحب ، من الممكن إنشاء مقاييس شعرية مختلفة. يجب تحضير الشعيرات الدموية قبل الجراحة مباشرة.
    4. تحضير سطح العمل والمواد الأخرى للتلاعب بالبيض (الشكل 3 أ). تعقيم جميع المواد الجراحية في فرن 100 درجة مئوية طوال الليل أو مع 70٪ إيثانول قبل الاستخدام مباشرة. تسخين PBS معقم إلى 37 درجة مئوية. قم بتوصيل طرف سعة 200 ميكرولتر (مع حاجز) بمجموعة أنبوب الشفاط لحقن الحبر الهندي ونقل الكرويات.
      ملاحظة: استخدم النصائح ذات الحواجز عند نقل كرويات الخلايا البشرية.
    5. قبل التجربة مباشرة ، أضف قطرتين من محلول مخزون الحبر الهندي إلى طبق بتري مقاس 30 مم واخلطه مع 1 مل من PBS المعقم. قم بإزالة الصفيحة الكروية من الحاضنة وضعها فوق صندوق ثلج لبقية التجربة.
  2. تحضير كل بيضة
    1. أخرجي بيضة واحدة من الحاضنة وضعيها فوق حامل البيض. اصنع ثقبا صغيرا في الطرف الحاد للبويضة (الشكل 2 د) واستنشق 1.5 مل من الزلال باستخدام حقنة وإبرة. أدخل الإبرة بشكل عمودي على البيضة لتجنب إتلاف صفار البيض. أغلق الفتحة باستخدام شريط لاصق. اختياريا ، كرر هذه الخطوة لجميع البيض قبل التجربة ، وأعد احتضان باقي البيض.
    2. اقطع بعناية نافذة أعلى البيضة باستخدام المقص (الشكل 3 د). باستخدام الماصة ، أضف 1-2 قطرات من PBS فوق صفار البيض. إذا لزم الأمر، قم بإزالة فقاعات الزلال الكبيرة (مثل تلك التي تظهر في الشكل 3F) باستخدام الماصة.
    3. قم بتوصيل الشعيرات الدموية الرقيقة بمجموعة أنبوب الشفاطة. املأ الشعيرات الدموية الزجاجية جزئيا بمحلول الحبر الهندي عن طريق الشفط. حقن ما يكفي من حبر الهند في صفار البيض تحت الجنين حتى تظهر الهياكل الجنينية (الشكل 3E ، F).
    4. باستخدام المجهر المجسم ، احسب عدد الجسيدات (الشكل 4 أ). قم بترقيم البيض بشكل فردي باستخدام قلم رصاص (الشكل 4 ب).
  3. زرع كروي
    1. تحديد منطقة الكسب غير المشروع: الأديم المتوسط المجاور للشكل على مستوى برعم الجناح (الأديم المتوسط من 15إلى 20الجسد المفترض37) (الشكل 3G والشكل 5 أ) أو منطقة قوس البلعوم الأولى المفترضة (بين الأديم الظاهر والأديم الباطن الجانبي إلى الدماغ المتوسط الخلفي / المتينالأول 38) (الشكل 8 أ).
    2. قطع الغشاء الزجاجي فوق المنطقة المستهدفة باستخدام مشرط دقيق.
    3. باستخدام زوج من المشارط الدقيقة ، قم بعمل قطع ضحل في المنطقة التي سيتم فيها زرع الكروي (الشكل 3 ح).
      ملاحظة: تجنب إتلاف الأديم الباطن الأساسي. خلاف ذلك ، سوف يتسرب صفار البيض (إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة).
    4. قم بإزالة الشعيرات الدموية الرقيقة من الشفاط واستبدلها بالشعرية السميكة. راقب الكرويات تحت المجهر المجسم واختر كرويا بنفس حجم الجسيدات تقريبا (الشكل 2 د). استنشق هذا الكروي في الشعيرات الدموية.
    5. قم بإيداع الكروي برفق بجوار منطقة القطع (الشكل 3H). باستخدام الإبر الحادة ، ادفع الكروي إلى منطقة القطع (الشكل 3I ، J).
    6. أضف 1-2 قطرات من PBS فوق الجنين باستخدام الماصة للتأكد من إدخال الكرة بإحكام.
      ملاحظة: إذا تم إزاحة الكسب غير المشروع ، فيجب زرع كروي جديد (الخطوتان 2.3.4 و 2.3.5).
    7. نظف أي تسرب للألبومين من قشر البيض باستخدام المناديل الورقية للتأكد من إمكانية إغلاق البيضة تماما ، وتجنب التلوث. أغلق النافذة في البيضة باستخدام شريط لاصق.
    8. لاحظ المنطقة المطعمة (الشكل 4 أ). أعد البيضة بحذر إلى الحاضنة الرطبة عند 37.5 درجة مئوية لتجنب إزاحة الكروي المدخل.
    9. احتضن البيضة حتى المرحلة المرغوبة.
      ملاحظة: عندما يتم إجراء الطعم الغريب في الجسيدات على مستوى برعم الأطراف ، تم فحص الهجرة وموت الخلايا بنجاح في أجنة عمرها 3.5 يوم (HH21) ، ولوحظ تمايز الخلايا والانتحاء في الأجنة البالغة من العمر 6 أيام (HH29) (الشكل 5 أ). تم إجراء الاندماج في الأنسجة المضيفة في أجنة عمرها 8 أيام أيضا (HH33). تمت دراسة الخلايا المانحة المطعمة في منطقة القوس البلعومي في أجنة عمرها 4.5 يوم (HH25) (الشكل 8 أ).

3. تشريح الأنسجة وتثبيتها ومعالجتها وإعدادها

  1. التشريح والتثبيت
    1. تحضير المثبت (على الأقل 1 مل / جنين): الإيثانول 100٪ - الفورمالديهايد 37٪ - حمض الخليك الجليدي بنسبة 6: 3: 1. نظف سطح العمل ، وزوج من الملقط الدقيق ، والمقص الجراحي أو مقص القزحية ، وملعقة مشقوقة. املأ طبق بتري زجاجي مقاس 60 مم ببرنامج تلفزيوني بارد وضعه تحت مجهر مجسم.
    2. افتح البيضة عن طريق قطع الشريط اللاصق.
    3. اقطع الأغشية حول الجنين وقم بإزالتها باستخدام الملعقة المشقوقة.
    4. نقل الجنين إلى طبق بتري. إذا كان عمر الجنين 5 أيام (HH26) أو أكبر ، فقم بقطع رأسه على الفور قبل أي تلاعب خارج البيضة.
    5. قم بإزالة أي أغشية متبقية باستخدام الملقط والمقص. حرك العينة برفق في PBS لغسل أي قطرات صفار متبقية.
    6. إذا تم إجراء الطعم الغريب على مستوى الجناح ، فتخلص من الرأس. إذا تم تطعيم الخلايا في المنطقة الرأسية ، فقم بقطع النصف السفلي من الجسم والتخلص منه ، مما يضمن الحفاظ على منطقة القلب سليمة.
    7. انقل كل عينة إلى أنبوب منفصل سعة 2.0 مل يحتوي على 1 مل من المثبت. حدد الأنابيب بشكل فردي كما كان من قبل (الشكل 4 ب). احتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التحريض.
    8. استخدم حبيبات من الخلايا أو الكرات (الشكل 4F) كعنصر تحكم إيجابي. لهذا الغرض ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية (الخطوة 1.5) أو كرويات الخلية (الخطوة 1.10) عند 180 × جم لمدة 10 دقائق في أنبوب سعة 1.5 مل ، وتخلص من وسط الثقافة ، وأضف 1 مل من المثبت دون إزعاج الحبيبات. احتضان الأنبوب طوال الليل عند 4 درجات مئوية دون تحريض ، واستمر بنفس الطريقة كما هو الحال بالنسبة لعينات الكتاكيت.
  2. الجفاف والتضمين
    1. تجفيف الأجنة عن طريق الغسيل المتتالي ل 1 مل من 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول في 1x PBS لمدة ساعة واحدة على الأقل لكل منهما مع التحريض.
    2. احتضان العينات طوال الليل في 1 مل من الإيثانول 100٪ في درجة حرارة الغرفة مع التحريض.
    3. احتضان العينات في 1 مل من الزيلين 100٪ لمدة 1 ساعة في غطاء الدخان. كرر مرتين أخريين.
    4. انقل محتويات الأنبوب إلى كتلة التلوين وتخلص من الزيلين. أضف ما يكفي من البارافين المنصهر لتغطية الجنين وقم بتغطية كتلة التلوين بغطاءها الزجاجي. احتضن طوال الليل في فرن 65 درجة مئوية.
    5. قم بإعداد طبق دافئ وقالب لكتل البارافين للتضمين.
      ملاحظة: زوج من مشابك الورق الممتدة مفيد لوضع الجنين.
    6. املأ القالب بالبارافين المنصهر وانقل الجنين إليه. ضع الجنين للحصول على قسم عرضي من الجذع (الشكل 5 أ) أو قسم إكليلي من الرأس (الشكل 8 أ).
    7. أدخل علامة اسم ورقية في البارافين ، مقابل السطح المراد تقسيمه ، للمساعدة في قطع الجنين في الاتجاه الصحيح (الشكل 4 ج).
    8. في حالة الاستخدام، ضع علبة التضمين فوق العينة. دع الكتلة تبرد تماما قبل إزالتها من القالب. بدلا من ذلك ، قم بتوصيل كتلة البارافين المتصلبة بالكاسيت أو حامل الكتلة الآخر باستخدام البارافين المنصهر واتركه يبرد مرة أخرى.
  3. التقسيم
    1. تحضير المواد للتقسيم. قم بتسخين الصفيحة الساخنة إلى 42 درجة مئوية وقم بتغطية لوح من الورق المقوى أو الستايروفوم بورق ألومنيوم نظيف حوالي 30 سم × 20 سم. نظف جميع الأسطح قبل الاستخدام.
      ملاحظة: استخدم القفازات لتجنب التلوث بالنوكليازات ، خاصة إذا تم استخدام بعض الأقسام لتهجين الحمض النووي الريبي في الموقع . تجنب استخدام حمام الأنسجة لتمديد أقسام البارافين لنفس السبب ما لم يكن من الممكن تنظيف الماء والأسطح جيدا مسبقا.
    2. تقليم البارافين الزائد بشفرة ميكروتوم. قم بإنشاء شطبة على كلا الجانبين ، على شكل شبه منحرف ، لسهولة فصل كل قسم باستخدام شفرة مشرط في خطوة لاحقة (الشكل 3 أ).
    3. اربط الكتلة بالميكروتوم. ضع الكتلة بعناية للتأكد من أن الجانبين الأيسر والأيمن متوازيان مع بعضهما البعض. قم بإجراء تعديل أدق بعد قطع أجزاء قليلة من العينة ومراقبتها تحت المجهر.
    4. عند الوصول إلى المنطقة المستهدفة (إما برعم الطرف أو القوس البلعومي الأول) ، قم بقص أقسام 7 ميكرومتر وضع شرائط البارافين فوق اللوحة المغطاة بورق الألمنيوم. قسم المنطقة المستهدفة بأكملها (الشكل 4 ج).
    5. لإعداد الأقسام التسلسلية ، قم بتغطية العدد الكافي من النظارات المنزلقة بقطرات من الماء المعقم منزوع الأيونات. انقل الأقسام الفردية إلى الشرائح بالتتابع باستخدام الفرش والمشرط. انقل الأقسام المجاورة إلى شرائح مختلفة لإنشاء أقسام تسلسلية (الشكل 4D). قم بإعداد سلسلة من 3 شرائح لعمر 3.5 يوم ، و 4 شرائح لعمر 4.5 أيام ، و 5 شرائح للأجنة البالغة من العمر 6 أيام. تلطيخ الأقسام المجاورة بمجسات أو أجسام مضادة أو بقع نسيجية كلاسيكية مختلفة.
      ملاحظة: قد تحتوي نفس السلسلة على شرائح متجاورة متعددة إذا تم تقسيم جزء كبير من الجنين. يمكن نقل أقسام متعددة إلى كل شريحة ، مع الاحتفاظ ببعض المسافة بين الأقسام للسماح لها بالتمدد. لا تضع الشريحة على الطبق الدافئ بعد.
    6. بعد نقل جميع الأقسام إلى الشرائح ، أضف المزيد من الماء حتى تطفو جميع الأقسام فوق قطرة ماء واحدة. ضع الشريحة على طبق دافئ واترك الأقسام تتمدد. قم بإزالة الشريحة من اللوحة الدافئة ، وقم بإزالة الماء عن طريق إمالة الزجاج المنزلق بعناية على المناديل الورقية.
      ملاحظة: لا تدع الأقسام تلمس الشريحة الزجاجية مباشرة قبل أن تتمدد.
    7. دع الشرائح تجف طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية.

4. تخليق مجسات Alu المسماة بالديجوكسيجينين عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

  1. قم بإعداد محلول مخزون من البادئات التالية الخاصةبالإنسان 39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3 'و AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. قم بإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسلالتالي 40: 1x عازلة PCR ، 2.0 ملي مولار MgCl2 ، 0.1 ملي مولار dCTP ، 0.1 ملي مولار dGTP ، 0.1 ملي مولار dATP ، 0.065 ملي مولار dTTP ، 0.035 ملي مولار حفر -11-dUTP ، 0.4 ميكرومتر بادئات AluFw ، 0.4 ميكرومتر من بادئات AluRev ، 0.05 U / ميكرولتر Taq polymerase ، و 1 نانوغرام / ميكرولتر الحمض النووي الجيني البشري.
  3. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الإعدادات التالية: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق متبوعا ب 40 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، متبوعا بتمسخ نهائي قدره 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. قم بقياس تركيز المسبار باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتخزين المجسات عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون منتج PCR 200-300 نقطة أساس بعد فترة طويلة من الرحلان الكهربائي في جل الاغاروز 2٪ 29.

5. قسم التهجين في الموقع مع مجسات Alu

  1. اليوم 1: النفاذية والتهجين
    ملاحظة: يجب استخدام وعاء زجاجي منزلق معقم لجميع الخطوات التي يتم إجراؤها في اليوم الأول.
    1. سخن غسلة واحدة من PBT (0.1٪ توين 20 في PBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بإعداد غرفة رطبة بها 50٪ فورماميد / 50٪ ماء منزوع الأيونات.
      ملاحظة: احسب حجم جميع عمليات الغسيل بناء على حجم البرطمان الزجاجي. ما لم يتم تحديد ذلك ، يتم إجراء جميع عمليات الغسيل عن طريق غمر الشرائح في المحلول.
    2. قم بإزالة البارافين بثلاث غسلات متتالية في الزيلين ، 5 دقائق لكل منها ، في غطاء الدخان.
    3. أعد ترطيب السلسلة بغسلتين في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما ، متبوعة بغسل الإيثانول بنسبة 90/70/30٪ في PBS لمدة دقيقتين لكل منهما.
    4. يغسل في PBT (0.1٪ Tween 20 في PBS) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. للنفاذية ، أضف 2 ميكروغرام / مل من البروتيناز K إلى PBT المسخن مسبقا ، واغمر الشرائح في المحلول ، واحتضنها لمدة 14 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    6. قم بإصلاح الأقسام عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد / PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. يغسل مع PBS لمدة 5 دقائق.
    8. بعد مسح PBS الزائد من كل شريحة ، قم بتغطية الأقسام ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين (50٪ فورماميد منزوع الأيونات ، 4x SSC pH 5.0 ، 1x محلول Denhardt ، 5٪ كبريتات ديكستران ، 100 ميكروغرام / مل من الحمض النووي للحيوانات المنوية من السلمون) (الجدول 1). احتضان لمدة 1 ساعة عند 42 درجة مئوية في غرفة الفورماميد.
    9. قم بإعداد محلول 0.2 نانوغرام / مل مسبار Alu في المخزن المؤقت للتهجين. قم بإمالة الشريحة لإزالة المخزن المؤقت للتهجين وإضافة 120 ميكرولتر من محلول مسبار Alu فوق الأقسام. قم بتغطيتها بغطاء زجاجي ، مع الحرص على تجنب الفقاعات.
      ملاحظة: لا ينبغي استخدام البارافيلم لتغطية الشرائح في هذه الخطوة ، حيث سيذوب عند درجات حرارة أعلى من 70 درجة مئوية.
    10. سخني الشرائح على طبق ساخن على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: لا تتنفس أبخرة الفورماميد.
    11. احتضان الشرائح عند 42 درجة مئوية في غرفة الفورماميد طوال الليل.
  2. اليوم 2: الغسيل الصارم والكيمياء المناعية
    1. قم بإعداد 20x SSC عازل (3 M كلوريد الصوديوم ، 0.3 م سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5) (الجدول 1). سخن غسلتين من محلول ملحي 0.1x سترات الصوديوم (SSC) ، درجة الحموضة 7.5 ، إلى 42 درجة مئوية.
    2. املأ برطمانا زجاجيا منزلقا بمخزن مؤقت 2x SSC ، درجة الحموضة 7.5. ضع الشرائح برفق في المحلول وانتظر حتى تنفصل الأغطية. قم بإزالة الغطاء باستخدام الكماشة واحتضان الشرائح في 2x SSC المؤقت لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. أعد غسل الشرائح باستخدام 2x SSC buffer ، درجة الحموضة 7.5 ، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. اغسل الشرائح مرتين باستخدام المخزن المؤقت 0.1x SSC ، درجة الحموضة 7.5 ، عند 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل منها.
    5. اغسل الشرائح مرتين باستخدام MABT (عازلة حمض الماليك مع توين ؛ 0.1 م حمض الماليك ، 0.15 م كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ توين 20 ، درجة الحموضة 7.5) (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة.
    6. امسح المخزن المؤقت الزائد من كل شريحة وقم بتغطية الأقسام ب 400 ميكرولتر من محلول الحجب (10٪ مصل الماعز العادي المعطل ، 2٪ كاشف مانع في MABT). احتضان لمدة 2 ساعة في غرفة رطبة (محضرة بالماء منزوع الأيونات) في درجة حرارة الغرفة.
    7. قم بإمالة الشرائح لإزالة السائل وإضافة 150 ميكرولتر من شظايا Fab المضادة للحفر المقترنة بالفوسفاتيز القلوي عند تخفيف 1: 2,000 في محلول الحظر. قم بتغطيتها بغطاء زجاجي أو بارافيلم واحتضانها في الغرفة الرطبة عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة.
  3. اليوم 3: تطوير اللون
    1. قم بإزالة الغطاء أو البارافيلم برفق داخل وعاء باستخدام MABT (كما في الخطوة 5.2.2) ، واحتضن الشرائح في MABT لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. يغسل باستخدام MABT ثلاث مرات أخرى لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
    3. يغسل ب MAB (عازلة حمض الماليك ؛ 0.1 م حمض الماليك ، 0.15 م كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5) (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة.
    4. يغسل مرتين باستخدام NTM (المخزن المؤقت NaCl-Tris-MgCl2 ؛ 100 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 9.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي كلوريد المغنيسيوم) (الجدول 1) لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    5. أضف محلول التلوين (0.45 ميكرولتر / مل 4-نيترو أزرق تيترازوليوم كلوريد ، 3.5 ميكرولتر / مل 5-برومو -4-كلورو-3-إندوليل فوسفات p-toluidine في NTM) (الجدول 1) إلى جرة التلوين واغمر الشرائح في المحلول. غطي البرطمان بورق الألمنيوم واتركي اللون يتطور طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  4. يوم 4: مكافحة التلوين والتركيب
    1. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل منها.
      ملاحظة: تأكد من التخلص من محلول التلوين بشكل صحيح كنفايات الهالوجين.
    2. قم بتركيب الشرائح كما هي عن طريق إضافة قطرات من وسائط التثبيت المائية وتغطية الأقسام بغطاء زجاجي. بدلا من ذلك ، انتقل إلى اللون الأحمر السريع النووي أو اللون الأزرق الألسي.
    3. امسح PBS الزائد وأضف 500 ميكرولتر من محلول مضاد للتلطيخ النووي بنسبة 0.1٪ أحمر سريعنووي 41 (الجدول 1) فوق الأقسام واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 10 دقائق. نصيحة لإزالة اللون الأحمر السريع النووي الزائد والمضي قدما في الجفاف (الخطوة 5.4.5).
    4. اغمر الأقسام في محلول أزرق ألسي 0.5٪ (بقعة الغضروف) 42 لمدة 10 دقائق ؛ اشطفها بالماء المقطر واحتضانها في حمض الفوسفوروموليبيديك 1٪ لمدة 10 دقائق. اشطفها بالماء مرة أخرى واستمر في الجفاف.
      ملاحظة: إذا تم حذف غسل حمض الفوسفوموليبديك ، يصبح اللون الأزرق Alcian بقعة نووية.
    5. جفف في 70/95/100/100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    6. يغسل بالزيلين ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في غطاء الدخان.
    7. قم بالتركيب بوسيط تثبيت قائم على الزيلين وأغطية زجاجية.
    8. دع الشرائح تجف لمدة 16 ساعة على الأقل في غطاء الدخان.

6. الحصول على الصور

  1. بعد تجفيف الشرائح المثبتة تماما ، افحص جميع الأقسام بحثا عن وجود خلايا بشرية مطعمة باستخدام مجهر ساطع منتصب (الشكل 4E). ابحث عن الخلايا الإيجابية للألوي باللون الأزرق والأرجواني (الشكل 4F ، G) وقم بتمييز الأقسام التي تحتوي على خلايا موجبة Alu باستخدام قلم تحديد (الشكل 4E).
    ملاحظة: سيسهل وضع علامة على الأقسام بخلايا Alu إيجابية العثور عليها أثناء تصويرها ومقارنة الشرائح المجاورة الملطخة بعلامات أخرى.
  2. احرص على تصوير الأقسام التي تحتوي على الطعم الغريب بنفس ترتيب وضعها على الشريحة (الاتجاه الأمامي الخلفي). قم بتسمية كل صورة بجميع المعلومات ذات الصلة ، مثل [تاريخ الطعم الغريب] _ [نوع الخلية] _ [العمر الجنيني] _ [نوع المسبار] _ [رقم القسم] _ 001. قم بتضمين ملفات بيانات التعريف لإضافة شريط المقياس لاحقا.
  3. إذا كانت الشرائح الأخرى من نفس السلسلة ملطخة بعلامة أخرى ، على سبيل المثال ، تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع أو الكيمياء المناعية ، فقم بتصوير واسم الأقسام المجاورة (الشكل 6) بنفس الطريقة.

النتائج

تحديد ADSCs الإيجابية Alu في الأقسام النسيجية
تسلسلات Alu هي عناصر متكررة تشكل ~ 10٪ من الجينوم البشري ، وبالتالي فهي أهداف ممتازة لتحديد الخلايا البشرية بطريقة خاصةبالأنواع 43. يمكن استخدام التهجين في الموقع مع مجسات ا?...

Discussion

يقدم البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 1) خيارا ممكنا لفحص سلوك المجموعات الأولية للخلايا البشرية في الجسم الحي ، باستخدام أجنة الكتاكيت كنموذج. تصف هذه الورقة تكوين الخلايا الكروية (الشكل 2) ، وزرع الكروية في جنين الفرخ (الشكل...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

وحظي هذا العمل بدعم من الجامعة الاتحادية لريو دي جانيرو، والمجلس الوطني للدراسات العليا والتكنولوجيا، ومؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو دي أمبارو في المعهد الوطني لريو دي جانيرو، ومؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو دي أمبارو في الفلسفة في ريو دي جانيرو. نشكر T. Jaffredo (CNRS ، باريس ، فرنسا) على تحقيق Runx2 (Cbfa1). تم الحصول على الجسم المضاد HNK1 من بنك الورم الهجين للدراسات التنموية الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD وتحتفظ به جامعة أيوا ، قسم العلوم البيولوجية ، مدينة أيوا ، IA 52242 الولايات المتحدة الأمريكية. نشكر V. Moura-Neto على منحه الوصول إلى الميكروتوم و R. Lent لمنحه الوصول إلى المجهر. نشكر E. Steck على المساعدة في تجميع مجسات Alu .

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Gallus gallus eggsGranja TolomeiSPF-freeWhite leghorn chicken
Reagents
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev primersSigma-aldrichOLIGO5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
Aluminum sulphateSigma-aldrich368458For Nuclear fast red solution preparation
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910Antibody Registry ID: AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 antibody (HNK1, CD57)Developmental Studies Hybridoma Bank3H5Antibody Registry ID: AB_2314644
Anti-mouse, goat IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2973Antibody Registry ID: AB_650513
Anti-mouse, goat IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Antibody Registry ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 antibodyDakoM085129Antibody Registry ID: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Aqueous mounting agent
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Blocking ReagentRoche11096176001
Citric acidVETEC238For SSC buffer preparation
Collagenase type IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt solution 50XInvitrogen750018For hybridization buffer preparation
Dextran sulphate sodium saltThermo Scientific15885118For hybridization buffer preparation
DIG RNA Labeling MixRoche11277073910Contains Dig-11-dUTP
DMEM low-glucoseSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056For NBT and BCIP solution preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-aldrichE6758For trypsin solution preparation
Entellan newMerck107961Non-aqueous mounting medium
EthanolProquímiosN/A
Fetal bovine serumThermoFisher12657029Inactivate at 56 °C before use
Formaldehyde 37% solutionProquímiosN/A
FormamideVetecV900064
Glacial acetic acidProquímiosN/A
India inkPelikan221143
L-glutamine solution (200 mM)Gibco25030-149
Magnesium chlorideMerck8147330100For NTM buffer preparation
Maleic acidSigma-aldrichM0375-500GFor MAB buffer preparation
MethanolProquímios
Normal Goat SerumSigma-aldrichNS02LInactivate at 56 °C before use
4-Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11585029001
Nuclear fast redSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicillin G sodium saltSigma-aldrichP3032
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-aldrichP3813
Phosphomolybdic acidMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
Salmon sperm DNAInvitrogen15632011For hybridization buffer preparation
Sodium chlorideSigma-aldrichS9888For SSC, MAB and NTM buffer preparation
Streptomycin SulfateSigma-aldrichS6501
Taq Polymerase kitCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquímiosN/A
Microscope and equipments
Axioplan upright microscopeCarl Zeiss MicroscopyN/A
Axiovision softwareCarl Zeiss MicroscopyN/A
Cell incubatorThermoForma3110
Egg incubator- 50 eggsGP
Gooseneck lampBiocamN/AFor egg manipulation
Fiji software; Cell Counter pluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminar flow hoodTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Rotary microtomeLeica BiosystemsRM2125 RTSFor sectioning
StereomicroscopeLabomedLuxeo 4DFor egg manipulation
Sterilization ovenREALIS7261690For sterelization of surgical materials
Consumables
0.2 mL (PCR) polypropylene centrifuge tubesEppendorf30124707
15 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430791
1.5 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-150-C
2 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-200-C
50 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μL sizeInvitrogenAM12655For egg manipulation
Excavated Glass Block (Staining Block) with Cover GlassHecht Karl42020010
Embedding cassettesSimportM480Used as a paraffin block holder
Glass coverslides, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Glass Pasteur pipettes 230 mmNORMAX5426023For preparation of glass capillaries
Microtome bladesLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818For sectioning
Parafilm MParafilmP7793
Plastic Petri dish, 30 mmKasviK13-0035For egg manipulation
Plastic Petri dish, 60 mmProlab0303-8For cell spheroids preparation. Should not be treated for cell adhesion. 
Silanized glass slides (Starfrost)Knittel Glass198For sectioning
Syringe 1 mL , Needles 26 G (0.45 x 13 mm)Descarpack32972For egg manipulation (albumen aspiration)
Surgical tools
Aspirator tubeDrummond2-000-000For egg manipulation
Dissection scissorsFine Science Tools14061-11For egg manipulation
Microforceps (tweezers)Fine Science Tools00108-11For egg manipulation and preparation of glass capillaries
Needle holder (adjustable dissection needle chuck)Fisherbrand8955For egg manipulation
Oil whetstone, 10.000 gritN/AN/AFor sharpening needles
Pair of small paint brushesN/AN/AFor handling paraffin sections. Any brand may be used.
Sewing needlesN/AN/AFor sharpening into microscalpels. Any brand may be used.
Sterile disposable scalpel No. 23Swann-Norton110For sectioning
Surgical scalpel handleSwann-Norton914For sectioning
Wecker iris scissors, sharp/sharpSurtexSS-641-11For egg manipulation

References

  1. Herbert, K. E., Lévesque, J. P., Haylock, D. N., Prince, M. The use of experimental murine models to assess novel agents of hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 14 (6), 603-621 (2008).
  2. Parada-Kusz, M., et al. Generation of mouse-zebrafish hematopoietic tissue chimeric embryos for hematopoiesis and host-pathogen interaction studies. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (11), (2018).
  3. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  4. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicological Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  5. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nature Genetics. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  6. le Douarin, N., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
  7. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
  8. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  9. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  10. Douarin, N., et al. le et al. Evidence for a thymus-dependent form of tolerance that is not based on elimination or anergy of reactive T cells. Immunological Reviews. 149 (1), 35-53 (1996).
  11. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e2071 (2010).
  12. Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells and derivatives to the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 584, 367-385 (2010).
  13. Akhlaghpour, A., et al. Chicken interspecies chimerism unveils human pluripotency. Stem Cell Reports. 16 (1), 39-55 (2021).
  14. Kulesa, P. M., Morrison, J. A., Bailey, C. M. The neural crest and cancer: A developmental spin on melanoma. Cells Tissues Organs. 198 (1), 12-21 (2013).
  15. Hendrix, M. J. C., et al. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 246-255 (2007).
  16. Singer, N. G., Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of inflammation. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6, 457-478 (2011).
  17. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  18. Griffin, M. D., et al. Concise review: Adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: How well are we joining the dots. Stem Cells. 31 (10), 2033-2041 (2013).
  19. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposium. 136, 42-60 (1988).
  20. Bianco, P., Robey, P. G., Saggio, I., Riminucci, M. "Mesenchymal" stem cells in human bone marrow (skeletal stem cells): A critical discussion of their nature, identity, and significance in incurable skeletal disease. Human Gene Therapy. 21 (9), 1057-1066 (2010).
  21. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  22. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  23. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: Localization, morphology and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  24. Zannettino, A. C. W., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214 (2), 413-421 (2008).
  25. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  27. Baptista, L. S., et al. marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: How close are they. Journal of Stem Cells. , 73-90 (2007).
  28. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS ONE. 8 (12), 84206 (2013).
  29. Cordeiro, I. R., et al. Chick embryo xenograft model reveals a novel perineural niche for human adipose-derived stromal cells. Biology Open. 4 (9), 1180-1193 (2015).
  30. Santos, R. d. e. A., et al. Intrinsic angiogenic potential and migration capacity of human mesenchymal stromal cells derived from menstrual blood and bone marrow. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 1-23 (2020).
  31. Menezes, A., et al. Live cell imaging supports a key role for histone deacetylase as a molecular target during glioblastoma malignancy downgrade through tumor competence modulation. Journal of Oncology. 2019, 9043675 (2019).
  32. Brito, J. M., Teillet, M. A., le Douarin, N. M. Induction of mirror-image supernumerary jaws in chicken mandibular mesenchyme by Sonic Hedgehog-producing cells. Development. 135 (13), 2311-2319 (2008).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. de Barros, A. P. D. N., et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 5 (2), 9093 (2010).
  35. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1951).
  36. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  37. Tickle, C. How the embryo makes a limb: Determination, polarity and identity. Journal of Anatomy. 227 (4), 418-430 (2015).
  38. Couly, G., Grapin-Botton, A., Coltey, P., le Douarin, N. M. The regeneration of the cephalic neural crest, a problem revisited: The regenerating cells originate from the contralateral or from the anterior and posterior neural fold. Development. 122 (11), 3393-3407 (1996).
  39. Walker, J. A., et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 315 (1), 122-128 (2003).
  40. Steck, E., Burkhardt, M., Ehrlich, H., Richter, W. Discrimination between cells of murine and human origin in xenotransplants by species specific genomic in situ hybridization. Xenotransplantation. 17 (2), 153-159 (2010).
  41. Sams, A., Davies, F. M. R. Commercial varieties of nuclear fast red. Stain Technology. 42 (6), 269-276 (1967).
  42. Lison, L. Alcian blue 8 g with chlorantine fast red 5 B. A technic for selective staining of mucopolysaccharides. Biotechnic and Histochemistry. 29 (3), 131-138 (1954).
  43. Cordaux, R., Batzer, M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 691-703 (2009).
  44. Brüstle, O., et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats. Nature Biotechnology. 16 (11), 1040-1044 (1998).
  45. Warncke, B., Valtink, M., Weichel, J., Engelmann, K., Schäfer, H. Experimental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation - Unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridisation of human-specific Alu sequences. Virchows Archiv. 444 (1), 74-81 (2004).
  46. Kasten, P., et al. Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier. Biomaterials. 26 (29), 5879-5889 (2005).
  47. Baptista, L., et al. Adipose tissue of control and ex-obese patients exhibit differences in blood vessel content and resident mesenchymal stem cell population. Obesity Surgery. 19 (9), 1304-1312 (2009).
  48. Christ, B., Huang, R., Scaal, M. Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anatomy and Embryology. 208 (5), 333-350 (2004).
  49. Scaal, M., Christ, B. Formation and differentiation of the avian dermomyotome. Anatomy and Embryology. 208 (6), 411-424 (2004).
  50. Tucker, G. C., Delarue, M., Zada, S., Boucaut, J. C., Thiery, J. P. Expression of the HNK-1/NC-1 epitope in early vertebrate neurogenesis. Cell and Tissue Research. 251 (2), 457-465 (1988).
  51. Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G., le Douarin, N. M. Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4843-4847 (2004).
  52. Charrier, J. B., Lapointe, F., le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development. 129 (20), 4785-4796 (2002).
  53. Kordes, U., Cheng, Y. C., Scotting, P. J. Sox group e gene expression distinguishes different types and maturational stages of glial cells in developing chick and mouse. Developmental Brain Research. 157 (2), 209-213 (2005).
  54. Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., Mundlos, S. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Developmental Biology. 245 (1), 95-108 (2002).
  55. Grottkau, B. E., Lin, Y. Osteogenesis of adipose-derived stem cells. Bone Research. 1 (2), 133 (2013).
  56. Culling, C. F. A. . Handbook of histopathological and histochemical techniques. Including museum techniques. , (1974).
  57. Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P. M., Tickle, C. Bone morphogenetic proteins and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb. Development. 120 (1), 209-218 (1994).
  58. Huber, K., et al. Persistent expression of BMP-4 in embryonic chick adrenal cortical cells and its role in chromaffin cell development. Neural Development. 3, 28 (2008).
  59. Pouget, C., Gautier, R., Teillet, M. A., Jaffredo, T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development. 133 (6), 1013-1022 (2006).
  60. Kirby, M. L., Hutson, M. R. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adhesion and Migration. 4 (4), 609-621 (2010).
  61. Isern, J., et al. The neural crest is a source of mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell niche function. eLife. 3, 03696 (2014).
  62. Yamazaki, S., et al. Nonmyelinating schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell. 147 (5), 1146-1158 (2011).
  63. Carr, M. J., et al. Mesenchymal precursor cells in adult nerves contribute to mammalian tissue repair and regeneration. Cell Stem Cell. 24 (2), 240-256 (2019).
  64. Walker, J. A., et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Analytical Biochemistry. 316 (2), 259-269 (2003).
  65. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  66. Yong, K. S. M., Her, Z., Chen, Q. Humanized mice as unique tools for human-specific studies. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 66 (4), 245-266 (2018).
  67. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025 (2020).
  68. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  69. Puente, B. N., et al. The oxygen-rich postnatal environment induces cardiomyocyte cell-cycle arrest through DNA damage response. Cell. 157 (3), 565-579 (2014).
  70. Colton, C. K. Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplantation. 4 (4), 415-436 (1995).
  71. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Xenograft Alu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved