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要約

ここでは、ヒト細胞スフェロイドをニワトリの胚に移植し、同定する方法について述べます。この異種移植モデルは、細胞の移動、分化、および親和性を測定するための有益なシグナルの供給源として胚の微小環境を使用し、初代および/または不均一な細胞集団の研究に特に適しています。

要約

異種移植片は、 生体内でのヒト細胞の挙動を調べるための貴重な方法です。特に、胚環境は、細胞の移動、分化、形態形成の手がかりを提供し、成体異種移植モデルにはしばしば存在しない独自の有益なシグナルと胚葉の同一性を備えています。さらに、胚モデルは自己組織と非自己組織を区別することができないため、移植片の拒絶反応のリスクや宿主の免疫抑制の必要性が排除されます。この論文では、ヒト細胞のスフェロイドをニワトリ胚に移植する方法を示しており、ニワトリ胚はアクセス可能で、操作が容易で、37°Cで発育します。

スフェロイドは、移植のために胚の特定の領域を選択することを可能にする。移植後、細胞は宿主組織に統合され、移動、増殖、分化の追跡が可能になります。このモデルは、不均一な初代細胞集団やがん細胞など、さまざまな接着集団を利用できる柔軟性を備えています。事前の細胞標識の必要性を回避するために、ヒト特異的 なAlu プローブのハイブリダイゼーションによるドナー細胞の同定のためのプロトコールについても説明されていますが、これは不均一な細胞集団を調査する際に特に重要です。さらに、DNAプローブは、他のドナー種を同定するために容易に適合させることができます。このプロトコルでは、スフェロイドの調製、ニワトリ胚への移植、パラフィン切片化のための組織の固定と処理、そして最後に DNAin situ ハイブリダイゼーションを使用したヒト細胞の同定のための一般的な方法について説明します。この方法の限界に加えて、推奨されるコントロール、結果の解釈の例、およびアッセイ可能なさまざまな細胞挙動について説明します。

概要

異種移植片は、生体内でのヒト細胞の挙動を調べるのに便利なツールです。これらのモデルは、ヒト幹細胞の生物学1、細胞イベントのリアルタイム観察2、腫瘍の血管新生と転移3の研究など、幅広い科学的トピックに貴重な情報を提供してきました。さらに、患者特異的異種移植片の腫瘍形成を含む、がん生物学のいくつかの側面が研究されています4,5。これらの異種移植モデルにはそれぞれ長所と短所があるため、それぞれが特定の科学的問題により適しています。ニワトリの胚は、外科的操作に適したアクセス可能な羊膜モデルであるため、人気のある発生生物学モデルです。異種移植片により、研究者は正確な運命マップ6を作成したり、形質が細胞自律的であるか、環境によって指示されているか7,8を調査したりすることができました。同様の理論的根拠により、ニワトリの胚をヒト細胞の挙動を研究するための異種移植モデルとして使用できます。

胚環境は、移動シグナルや分化シグナル、細胞間相互作用など、組織の形態形成を積極的に調整します。したがって、成体異種移植モデルと比較して、胚は、例えば、成体幹細胞ニッチ(例えば、BMP、WNT、NOTCH、およびSHH9)に存在するシグナルを模倣することにより、移植された細胞の挙動をアッセイするためのより有益な環境を提供する。さらに、初期発生期には適応免疫系が存在しないため、免疫応答またはドナー組織の拒絶のリスクなしに異種移植を行うことができる10。これまでの研究では、この目的のためにヒト細胞をニワトリの胚に移植する異種移植が研究されてきた。ヒト幹細胞の神経原性能は、神経管または血管11 への注入後にアッセイされ、さらに胚性幹細胞12 および人工多能性幹細胞13 の胚への統合も行われている。ヒト黒色腫細胞は、ニワトリの胚環境を用いても研究されており、これにより、ニワトリの腫瘍形成と神経堤細胞の挙動との関連が明らかになった14、また、胚からの情報による腫瘍細胞の再プログラミング15も明らかになった。この論文では、ヒトの初代細胞集団および不均一な細胞集団の挙動を研究するのに特に適したプロトコールについて説明します。

過去数十年にわたり、多様な組織の間質成分は、前駆細胞/幹細胞の自家供給源として、また、以前は「間葉系幹細胞」として知られていたその血管新生および免疫調節特性について研究されてきた16,17,18。これらの細胞集団のうち最初に特徴づけられたのは骨髄間質/幹細胞集団(BMSC)であり、これらは骨髄、脂肪細胞、そして程度は低いがin vivoで軟骨形成能を有する19,20。脂肪由来間質細胞(ADSC)は、脂肪吸引または皮膚球切除サンプルの酵素消化、続いて間質血管画分(SVF)の単離、そして最後に培養21での拡大によって得られる不均一な集団です。培養において、これらの細胞は、CD90、CD73、CD105、およびCD44などの他の間葉系集団と共通のマーカー、CD36などのユニークなマーカー、および造血(CD45)または内皮(CD31)マーカー22の不在によって表現型的に特徴付けられる。さらに、ADSCはin vitroで骨形成、脂肪形成、および軟骨形成の可能性があり、この集団の幹細胞/前駆細胞の数は、線維芽細胞コロニー形成ユニット(CFU-F)アッセイ22によって定義できます。インビボでは、ADSC表現型を有する細胞は、間質23および/または血管周囲24コンパートメントに存在することが報告されています。in vitro培養後にマーカーを共有しているにもかかわらず、異なる組織の間質コンパートメントは特定の臓器の固有の特性を反映しており、これらの細胞集団はその供給源に応じて異なる特性を持っていることがますます明らかになっています17,25,26,27.さらに、これらの細胞は、細胞培養皿への接着に基づいて単離されるため、多様な胚葉28の細胞で構成されていてもよい。したがって、異種移植法を使用して間質細胞の分化の可能性と親和性を偏りなく研究することで、これらの細胞集団に関する貴重な情報を提供し、将来の細胞治療の開発を導くことができます。

ここで記載するプロトコール(図1)は、ニワトリ胚の低コストおよび操作の容易さを利用した異種移植法である。これは、ヒトADSC29、皮膚線維芽細胞29、月経血由来間質細胞30、および膠芽腫細胞31の挙動を研究するために以前に使用されてきた。この方法は、細胞をスフェロイド32として移植することを含み、これは、任意の接着細胞集団から調製することができる(図2)。外科的処置とカスタム手術材料(マイクロメスとガラス毛細血管)の準備についても説明します(図3)。ヒト細胞は、ヒト特異的なAluプローブをハイブリダイズすることにより組織切片で検出されるため(図4)、移植された細胞を事前に標識する必要がなくなります。代表的な結果は、翅芽レベルの体節領域(図5、図6、および図7)と最初の咽頭弓(図8)の両方で移植されたヒトADSCと、前脳に移植されたヒト原発性神経膠芽腫スフェロイド(図8).細胞の移動、分化、およびニワトリの胚組織との相互作用、および共染色または隣接切片の染色を使用して細胞の挙動をさらに調査するための提案されたアッセイについて説明します。

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プロトコル

この研究で使用されたすべての in vivo 手順は、ブラジルの実験動物使用ガイドライン(L11794)に従って、動物試験および研究に関連するすべての実験ガイドラインに準拠していました。ニワトリの胚の取り扱いに使用されたプロトコルは、すべて科学実験における動物の使用に関する倫理委員会(リオデジャネイロ連邦大学健康科学センター)によって承認されました。ヒト細胞の使用は、大学病院クレメンティーノ・フラガ・フィーリョ(番号043/09および088/04)の倫理委員会によって承認されました。ホワイトレグホーンチキン(Gallus gallus)の特定の病原体を含まない(SPF)卵を使用しました。

1. 細胞スフェロイドの調製

注:細胞スフェロイドは、接着性がある限り、幅広い種類の細胞で調製できます。このプロトコルでは、ヒト脂肪由来間質細胞(ADSC)を、前述の21,27と同様に単離した(図2A)。細胞は、脂肪組織断片または脂肪吸引物をコラゲナーゼIAで37°Cで1時間撹拌しながら消化し、続いて1-2×104細胞/cm2でプレーティングし、一晩インキュベートすることによって得られました。非接着細胞を廃棄し、接着細胞を3〜6継代増殖させた。ADSCは、表面抗原CD105、CD90、CD13、およびCD44の発現について均一であり、造血抗原CD45、CD14、CD34、CD3、およびCD19に対して陰性であった27。ここで説明する方法は、細胞培養に日常的に使用されるもの以外の最小限の材料で簡単に実行できますが、最適な凝集時間と部分的な解離の必要性は経験的に決定する必要があります。細胞スフェロイドを調製するための代替方法、例えば、吊り下げ法33またはアガロース被覆ウェル34などを採用してもよい。詳細については、ディスカッションを参照してください。すべての手順は、無菌技術を採用したクリーンベンチで実行する必要があります。

  1. 無菌PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、培地、およびトリプシン溶液を細胞操作前に37°Cにウォームアップします。
  2. 10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した低グルコース DMEM で ADSC を培養します。2枚のスフェロイドプレートの調製には、ADSCのコンフルエント25cm2フラスコを使用します。培地を廃棄し、適切な量の滅菌PBS(25 cm2細胞培養フラスコを使用する場合は、各洗浄に5 mL PBS)で培養皿を3回洗浄します。
  3. 細胞を覆うのに十分なトリプシン溶液(0.78 mM EDTAを含む)を加え(25 cm2 細胞培養フラスコを使用する場合は1 mLのトリプシン溶液)、培養フラスコを室温で5分間放置します。
  4. 細胞をゆっくりと上下にピペットで動かして解離させます。同量のFBSを含む培地を添加してトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移します。
  5. 180 × gで10分間遠心分離します。上澄みを捨て、チューブを軽くたたいてペレットを緩めます。
  6. 細胞の種類に適した500 μL-2 mLの培地に細胞を再懸濁します(ステップ1.2を参照)。
    注:ADSCや線維芽細胞などの接着細胞の最小濃度は5×105 細胞/ mLです。ADSCのコンフルエントな25 cm2 フラスコを2 mLの培地に再懸 ?? し、それぞれ1 mLを使用して2つのシャーレに播種する必要があります。.グリアなどの接着性の低い細胞は、少量で ~2 × 106 細胞/mL でプレーティングすることでメリットが得られる可能性があります。
  7. 細胞懸濁液を滅菌済みの60 mmシャーレ(寒天プレートの調製に使用されるものなど、コーティングされておらず未処理)の片側に慎重に移します。インキュベーター内で傾けたまま、折りたたまれた清潔なガーゼの上に皿を支えて、培地を可能な限り小さな領域に制限してみてください(図1B)。
  8. 細胞懸濁液を37°C、5%CO2で細胞凝集体が形成されるまでインキュベートします(ADSCをプレーティングしてから6〜8時間後)。
    注:スフェロイド凝集時間は細胞の種類によって異なる場合があります。
  9. 必要に応じて(ディスカッションを参照)、1000 μLチップを使用して静かにピペッティングして、大きな細胞凝集体を部分的に解離します。めっき後6〜8時間でADSCスフェロイドを解離します。
  10. スフェロイドを移植する準備ができるまで、プレートをインキュベーターに置きます:明確なエッジで丸く、簡単に分散しません(図1C、D)。
    注:ADSCスフェロイドは、部分解離の2日後に準備が整います。

2. ニワトリ胚へのスフェロイド移植

  1. 準備
    1. 所望のハンバーガー-ハミルトン(HH)段階が35に達するまで、湿度の高いインキュベーターで37.5°Cの湿ったインキュベーターで15〜30個の卵をインキュベートすることにより、鶏の卵を準備します:四肢芽レベルの体節の移植片の場合(HH11-12または13-19体節)または頭蓋領域の移植片の場合29〜33時間(HH8-9または5-8体節)。卵を水平に置き、孵化する前に卵の上に鉛筆で線を引きます(図3D)。
      注:インキュベーション時間は、個々のインキュベーターによって若干異なる場合があります。線を引くと、実験前に卵子を回転させた場合に、胚が見つかる卵子の上部を簡単に識別できるようになります。
    2. 金属製のニードルホルダーに縫い針を取り付けて、鋭い針(「マイクロメス」)を準備します(図3B)。油を塗った砥石を使用して、針を細いエッジの小さなメスのようになるまで研ぎます(図3C)。あるいは、電気分解36により鋭利なタングステン針を調製する。
    3. ブンゼンバーナーの炎を使用してガラスキャピラリーを準備し、ガラスパスツールピペットの薄い部分を短時間溶かします。溶融部分を炎から取り出し、伸ばして細い毛細管を形成します。毛細血管をマイクロ鉗子で壊して慎重に2つの部分に分割します。インドインク注入用の細いキャピラリーと、スフェロイドを転写するための厚いキャピラリーを準備します(図3B)。
      注:引っ張り強度を変えることで、異なるキャピラリーゲージを作成することができます。毛細血管は手術の直前に準備する必要があります。
    4. 卵の操作のために作業面と他の材料を準備します(図3A)。すべての手術材料を100°Cのオーブンで一晩滅菌するか、使用直前に70%エタノールで滅菌します。滅菌PBSを37°Cに温めます。 200 μLのチップ(バリア付き)をアスピレーターチューブアセンブリに取り付けて、インドインク注入およびスフェロイドの転写を行います。
      注:ヒト細胞のスフェロイドを移すときは、バリア付きのチップを使用してください。
    5. 実験の直前に、30 mmのペトリ皿に2滴のインドインク原液を加え、1 mLの滅菌PBSと混合します。スフェロイドプレートをインキュベーターから取り出し、残りの実験の間、アイスボックスの上に置きます。
  2. 各卵の準備
    1. インキュベーターから卵を1つ取り出し、エッグホルダーの上に置きます。卵の鋭い端に小さな穴を開け(図2D)、注射器と針を使用して1.5mLの卵白を吸引します。卵黄の損傷を避けるために、針を卵に対して垂直に挿入します。粘着テープで穴を塞ぎます。必要に応じて、実験前にすべての卵子に対してこの手順を繰り返し、残りの卵子を再インキュベートします。
    2. ハサミを使って卵の上の窓を慎重に切り開きます(図3D)。ピペットを使用して、卵黄の上にPBSを1〜2滴加えます。必要に応じて、ピペットを使用して大きな卵白の泡( 図3Fに示されているものなど)を取り除きます。
    3. 細いキャピラリーをアスピレーターチューブアセンブリに取り付けます。ガラスキャピラリーに墨汁溶液を部分的に充填します。胚の構造が見えるまで、胚の下の卵黄に十分な量のインドインクを注入します(図3E、F)。
    4. 実体顕微鏡を使用して、体節の数を数えます(図4A)。鉛筆を使用して卵に個別に番号を付けます(図4B)。
  3. スフェロイド移植
    1. 移植片の領域を特定します:翼の芽レベルの同軸中胚葉(推定15番目から20番目の体節37の前体節中胚葉)(図3Gおよび図5A)または推定最初の咽頭弓領域(外胚葉と後中脳の外側の内胚葉の間/最初の菱形3 8)(図8A)。
    2. マイクロメスを使用して、標的領域上のビテリン膜を切断します。
    3. 一対のマイクロメスを使用して、スフェロイドが埋め込まれる領域に浅い切り込みを入れます(図3H)。
      注:下にある内胚葉を損傷しないでください。そうしないと、卵黄が漏れます(これが発生した場合は、卵を捨ててください)。
    4. アスピレーターから細いキャピラリーを取り外し、厚いキャピラリーと交換します。実体顕微鏡でスフェロイドを観察し、体節とほぼ同じサイズのスフェロイドを選択します(図2D)。このスフェロイドをキャピラリーに吸引します。
    5. 切断領域の隣にスフェロイドを静かに堆積させます(図3H)。鋭利な針を使用して、スフェロイドを切断領域に押し込みます(図3I、J)。
    6. ピペットを使用して胚にPBSを1〜2滴加え、スフェロイドがしっかりと挿入されていることを確認します。
      注:グラフトが外れた場合は、新しいスフェロイドを移植する必要があります(手順2.3.4および2.3.5)。
    7. 卵殻から漏れたアルブミンをティッシュペーパーできれいにし、卵子が完全に密閉され、汚染を防ぐことができることを確認します。粘着テープを使用して卵の窓を密封します。
    8. 接ぎ木された領域に注意してください(図4A)。挿入されたスフェロイドが外れないように、卵を37.5°Cの湿ったインキュベーターに慎重に戻します。
    9. 希望の段階まで卵を孵化させます。
      注:異種移植片を四肢芽レベルで体節に行うと、3.5日齢の胚(HH21)で遊走と細胞死が成功裏にアッセイされ、6日齢の胚(HH29)で細胞分化と親和性が観察されました(図5A)。宿主組織への組み込みは、生後8日齢の胚でも行われています(HH33)。咽頭弓領域に移植されたドナー細胞は、生後4.5日齢の胚(HH25)で研究されています(図8A)。

3. 組織切片の組織解剖、固定、プロセシング、調製

  1. 解剖と固定
    1. 固定剤(少なくとも1 mL /胚)を準備します:エタノール100%-ホルムアルデヒド37%-氷酢酸6:3:1の比率で。作業面、マイクロ鉗子、手術用ハサミまたは虹彩ハサミ、スロット付きスプーンを清掃します。60 mmのガラスシャーレに冷たいPBSを入れ、実体顕微鏡の下に置きます。
    2. 粘着テープを切り抜いて卵を開けます。
    3. 胚の周りの膜を切り取り、スロット付きスプーンを使用してそれを取り除きます。
    4. 胚をペトリ皿に移します。胚が生後5日(HH26)以上の場合は、操作 が行われる前にすぐに斬首してください。
    5. マイクロ鉗子とハサミを使用して、残っている膜をすべて取り除きます。標本をPBSで穏やかに攪拌して、残っている卵黄の液滴を洗い流します。
    6. 異種移植が翼レベルで行われた場合は、頭部を廃棄します。細胞が頭側領域に移植された場合は、心臓領域が無傷に保たれるように、体の下半分を切断して廃棄します。
    7. 各検体を、1 mLの固定剤が入った別々の2.0 mLチューブに移します。前と同様に、チューブを個別に識別します(図4B)。攪拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
    8. 細胞またはスフェロイドのペレット(図4F)をポジティブコントロールとして使用します。このためには、細胞懸濁液(ステップ1.5)または細胞スフェロイド(ステップ1.10)を1.5 mLチューブ内で180 × g で10分間遠心分離し、培地を廃棄し、ペレットを乱さずに1 mLの固定液を加えます。チューブを攪拌せずに4°Cで一晩インキュベートし、ひよこサンプルの場合と同じ方法で進めます。
  2. 脱水と埋め込み
    1. 70%、80%、90%、および100%エタノールの1mLを1x PBSで1 mLを攪拌しながらそれぞれ少なくとも1時間連続して洗浄することにより、胚を脱水します。
    2. サンプルを100%エタノール1mLに室温で一晩インキュベートし、攪拌します。
    3. サンプルを100%キシレン1mLでドラフト内で1時間インキュベートします。さらに 2 回繰り返します。
    4. チューブの内容物を染色ブロックに移し、キシレンを廃棄します。胚を覆うのに十分な溶融パラフィンを加え、染色ブロックをガラス蓋で覆います。65°Cのオーブンで一晩インキュベートします。
    5. 埋込用のパラフィンブロック用の温板と型を用意します。
      注:伸ばしたペーパークリップのペアは、胚の位置決めに役立ちます。
    6. 型に溶融パラフィンを充填し、胚をそれに移します。胚を配置して、体幹の横断面(図5A)または頭の冠状切片(図8A)を取得します。
    7. パラフィンに紙のネームタグを切片化する表面の反対側に挿入し、胚を正しい向きで切断します(図4C)。
    8. 使用する場合は、埋め込みカセットをサンプルの上に置きます。ブロックを完全に冷ましてから、型から取り出します。または、硬化したパラフィンブロックを溶融パラフィンを使用してカセットまたは他のブロックホルダーに取り付け、再度冷まします。
  3. セクショニング
    1. 切片化用の材料を準備します。ホットプレートを42°Cに温め、段ボールまたは発泡スチロールプレートを約30 cm x 20 cmのきれいなアルミホイルで覆います。使用する前にすべての表面を清掃してください。
      注:ヌクレアーゼによる汚染を避けるために手袋を使用してください、特に一部の切片が RNAin situ ハイブリダイゼーションに使用される場合は。組織学浴を使用してパラフィン切片を伸ばすことは、水と表面を事前に完全に洗浄できない限り、同じ理由で避けてください。
    2. 余分なパラフィンをミクロトームブレードで切り取ります。両側に台形で斜角を作成し、後のステップでメスの刃を使用して各セクションを簡単に分離できるようにします(図3A)。
    3. ブロックをミクロトームに取り付けます。ブロックを慎重に配置して、左側と右側が互いに平行になるようにします。サンプルのいくつかのセクションをカットし、顕微鏡で観察した後、より細かい調整を行います。
    4. 目標領域(四肢芽または第1咽頭弓)に到達したら、7μm切片を切断し、パラフィンリボンをアルミホイルで覆われたプレートの上に置きます。ターゲット領域全体をセクション化します (図 4C)。
    5. シリアル切片を調製するには、十分な数のスライドグラスを滅菌脱イオン水の滴で覆います。ブラシとメスを使用して、個々のセクションをスライドに順番に転写します。隣接するセクションを別のスライドに転送して、シリアルセクションを作成します(図4D)。生後3.5日用のスライド3枚、生後4.5日用のスライド4枚、生後6日齢の胚用のスライド5枚のシリーズを準備します。隣接する切片を異なるプローブ、抗体、または古典的な組織学的染色で染色します。
      注:胚の大部分が切片化されている場合、同じシリーズに複数の隣接するスライドが含まれる場合があります。複数のセクションを各スライドに転送し、セクション間のスペースを確保してストレッチできるようにすることができます。スライドをまだウォームプレートに置かないでください。
    6. すべてのセクションがスライドに移されたら、すべてのセクションが1つの水滴に浮かぶまで、さらに水を追加します。スライドを温かいプレートに置き、セクションを伸ばします。温めたプレートからスライドを取り出し、スライドグラスをティッシュペーパーに対して慎重に傾けて水分を取り除きます。
      注意: セクションが伸びる前に、セクションがスライドガラスに直接触れないようにしてください。
    7. スライドを37°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。

4. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるジゴキシゲニン標識 Alu プローブの合成

  1. 次のヒト特異的プライマー39のストック溶液を調製します: AluFw:5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'および AluRev:5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'。
  2. 以下のPCR反応40を50 μL調製します:1x PCRバッファー、2.0 mM MgCl2、0.1 mM dCTP、0.1 mM dGTP、0.1 mM dATP、0.065 mM dTTP、0.035 mM dig-11-dUTP、0.4 μM AluFwプライマー、0.4 μM AluRevプライマー、0.05 U/μL Taqポリメラーゼ、および1 ng/μLヒトゲノムDNA。
  3. 最初の変性を94°Cで4分間行い、その後94°Cで20秒間、60°Cで20秒間、72°Cで20秒間のサイクルを40回行い、その後、72°Cで5分間の最終変性を行うという設定でPCRを実行します。
  4. 分光光度計を使用してプローブの濃度を測定します。プローブは-20°Cで保管してください。
    注:PCR産物は、2%アガロースゲル29中で電気泳動した後、200〜300 bpの長い時間でなければならない。

5. Aluプローブによるセクションin situハイブリダイゼーション

  1. 1日目:透過化とハイブリダイゼーション
    注:滅菌したスライドガラスジャーは、1日目に実行されるすべてのステップに使用する必要があります。
    1. PBT(0.1% Tween 20 in PBS)を37°Cの水浴で1回洗浄して予熱し、50%ホルムアミド/50%脱イオン水で湿ったチャンバーを調製します。
      注意: ガラス瓶のサイズに基づいて、すべての洗浄の量を計算します。特に指定がない限り、すべての洗浄はスライドを溶液に浸すことによって行われます。
    2. クライレンで3回連続して洗浄し、それぞれ5分間、ドラフトでパラフィンを除去します。
    3. シリーズを100%エタノールで2回、それぞれ5分間再水和し、続いてPBSで90/70/30%エタノールを各2分間洗浄します。
    4. PBT(0.1%Tween 20 in PBS)で5分間ずつ3回洗浄します。
    5. 透過処理のためには、予熱したPBTに2 μg/mLのプロテイナーゼKを加え、スライドを溶液に浸し、37°Cのウォーターバスで14分間インキュベートします。
    6. 4%パラホルムアルデヒド/PBSに室温で20分間浸漬して切片を固定します。
    7. PBSで5分間洗浄します。
    8. 各スライドから余分なPBSを拭き取った後、切片を300 μLのハイブリダイゼーションバッファー(50%脱イオンホルムアミド、4x SSC pH 5.0、1x デンハルト溶液、5%デキストラン硫酸塩、100 μg/mLサケ精子DNA)で覆います(表1)。ホルムアミドチャンバー内で42°Cで1時間インキュベートします。
    9. 0.2 ng/mL Alu プローブの溶液をハイブリダイゼーションバッファーで調製します。スライドを傾けてハイブリダイゼーションバッファーを取り出し、切片に120 μLの Alu プローブ溶液を加えます。ガラスのカバースリップで覆い、気泡が出ないように注意してください。
      注:パラフィルムは70°Cを超える温度で溶けるため、このステップでスライドを覆うために使用しないでください。
    10. ホットプレート上のスライドを95°Cで5分間加熱します。
      注:ホルムアミドの煙を吸い込まないでください。
    11. スライドをホルムアミドチャンバー内で42°Cで一晩インキュベートします。
  2. 2日目:ストリンジェンシー洗浄と免疫組織化学
    1. 20x SSCバッファー(3 M NaCl、0.3 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.5)を調製します(表1)。0.1倍生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液、pH 7.5を42°Cに2回洗浄して予熱します。
    2. スライドガラスジャーに2x SSCバッファー(pH 7.5)を充填します。スライドを溶液にそっと置き、カバースリップが外れるのを待ちます。ペンチでカバーガラスをはがし、スライドを2x SSCバッファーで室温で5分間インキュベートします。
    3. スライドを2x SSCバッファー(pH 7.5)で室温で5分間再洗浄します。
    4. スライドを0.1x SSCバッファー(pH 7.5)で42°Cで5分間、それぞれ2回洗浄します。
    5. スライドをMABT(マレイン酸緩衝液とTween;0.1 Mマレイン酸、0.15 M塩化ナトリウム、0.1% Tween 20、pH 7.5)(表1)で室温でそれぞれ30分間2回洗浄します。
    6. 各スライドから余分なバッファーを拭き取り、切片を400 μLのブロッキング溶液(10%不活化正常ヤギ血清、2%ブロッキング試薬、MABT溶液)で覆います。湿潤チャンバー(脱イオン水で調製)で室温で2時間インキュベートします。
    7. スライドを傾けて液体を取り出し、ブロッキング溶液中で1:2,000の希釈度でアルカリホスファターゼに結合した150 μLのFab抗DIGフラグメントを加えます。ガラスカバースリップまたはパラフィルムで覆い、4°Cの湿ったチャンバーで16時間インキュベートします。
  3. 3日目:カラーデベロップメント
    1. MABTを入れた瓶の中のカバースリップまたはパラフィルムを静かに取り除き(ステップ5.2.2の場合)、スライドをMABTで室温で30分間インキュベートします。
    2. MABTでさらに3回、それぞれ30分間洗浄します。
    3. MAB(マレイン酸緩衝液;0.1 Mマレイン酸、0.15 M塩化ナトリウム、pH 7.5)(表1)で30分間洗浄します。
    4. NTM(NaCl-Tris-MgCl2 バッファー、100 mM Tris-HCl pH 9.5、100 mM 塩化ナトリウム、50 mM 塩化マグネシウム)(表 1)(表 1)で 2 回、各 10 分間洗浄します。
    5. 染色液(0.45 μL/mL 4-Nitro blue tetrazolium chloride、3.5 μL/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine in NTM)(表1)を染色ジャーに加え、スライド液を溶液に浸します。瓶をアルミホイルで覆い、37°Cで一晩色を現像させます。
  4. 4日目:対比染色と埋没
    1. スライドをPBSで室温で3回、それぞれ10分間洗浄します。
      注意:染色液はハロゲン廃棄物として適切に廃棄してください。
    2. スライドをそのまま取り付けるには、水性封入剤を滴下し、切片をガラスカバースリップで覆います。あるいは、核ファストレッドまたはアルシアンブルーの対比染色に進みます。
    3. 余分なPBSを拭き取り、切片に0.1% nuclear fast red41 (表1)の核対比染色液500 μLを加え、スライドを湿潤チャンバーで10分間インキュベートします。余分な核ファストレッドを取り除き、脱水に進むためのヒント(ステップ5.4.5)。
    4. 切片を0.5%アルシアンブルー溶液(軟骨対比染色)42 に10分間浸漬する。蒸留水ですすぎ、1%ホスホモリブジン酸で10分間インキュベートします。再度水ですすぎ、脱水症状に進みます。
      注:ホスホモリブデン酸洗浄を省略すると、アルシアンブルーは核対比染色になります。
    5. 70/95/100/100%エタノールで各5分間脱水します。
    6. ヒュームフードでキシレンを3回、毎回5分間洗浄します。
    7. キシレンベースの封入用媒体とガラスカバースリップで取り付けます。
    8. スライドをドラフトで少なくとも16時間乾かします。

6. 画像取得

  1. 取り付けたスライドを完全に乾燥させた後、直立明視野顕微鏡を使用して、移植されたヒト細胞の存在についてすべての切片を調べます(図4E)。青紫色のAlu陽性細胞(図4F、G)を探し、マーカーペン(図4E)を使用してAlu陽性細胞を含むセクションをマークします。
    注: Alu陽性細胞で切片をマークすると、写真を撮ったり、他のマーカーで染色された隣接するスライドを比較したりするときに、それらを見つけやすくなります。
  2. 異種移植片を含む切片は、スライド上の配置と同じ順序(前後方向)で撮影するように注意してください。各写真には、[異種移植の日付]_[細胞タイプ]_[胚年齢]_[プローブタイプ]_[セクション番号]_001など、すべての関連情報に名前を付けます。メタデータ ファイルを含めて、後で縮尺記号を追加します。
  3. 同じシリーズの他のスライドが別のマーカー(例:RNA in situ ハイブリダイゼーションや免疫組織化学)で染色されている場合は、同じ方法で隣接する切片(図6)を撮影し、命名します。

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結果

組織切片におけるAlu陽性ADSCの同定
Alu配列は、ヒトゲノムの~10%を占める反復要素であり、したがって、種特異的な方法でヒト細胞を同定するための優れた標的である43。DNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは、初代ヒト細胞29,30,40,44,45,46を含む組織切片上のゲノム要素を同?...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコル(図1)は、ニワトリ胚をモデルとして使用して、 in vivoでヒト細胞の初代集団の挙動をスクリーニングするための実行可能なオプションを提供します。この論文では、細胞スフェロイドの形成(図2)、ニワトリ胚へのスフェロイドの移植(図3)、標本の処理と in situ ?...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、リオデジャネイロ連邦大学(UFRJ for J.B.)、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq for J.B.)、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ for J.B.)の支援を受けました。 Runx2 (Cbfa1) プローブを提供してくれた T. Jaffredo 氏 (CNRS、パリ、フランス) に感謝します。HNK1抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物科学部、アイオワシティ、アイオワ州52242米国によって維持されているDevelopmental Studies Hybridoma Bankから取得されました。ミクロトームへのアクセスを許可してくれたV.Moura-Netoと顕微鏡へのアクセスを許可してくれたR.Lentに感謝します。 Alu プローブの合成にご協力いただいたE. Steckに感謝いたします。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Gallus gallus eggsGranja TolomeiSPF-freeWhite leghorn chicken
Reagents
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev primersSigma-aldrichOLIGO5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
Aluminum sulphateSigma-aldrich368458For Nuclear fast red solution preparation
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910Antibody Registry ID: AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 antibody (HNK1, CD57)Developmental Studies Hybridoma Bank3H5Antibody Registry ID: AB_2314644
Anti-mouse, goat IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2973Antibody Registry ID: AB_650513
Anti-mouse, goat IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Antibody Registry ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 antibodyDakoM085129Antibody Registry ID: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Aqueous mounting agent
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Blocking ReagentRoche11096176001
Citric acidVETEC238For SSC buffer preparation
Collagenase type IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt solution 50XInvitrogen750018For hybridization buffer preparation
Dextran sulphate sodium saltThermo Scientific15885118For hybridization buffer preparation
DIG RNA Labeling MixRoche11277073910Contains Dig-11-dUTP
DMEM low-glucoseSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056For NBT and BCIP solution preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-aldrichE6758For trypsin solution preparation
Entellan newMerck107961Non-aqueous mounting medium
EthanolProquímiosN/A
Fetal bovine serumThermoFisher12657029Inactivate at 56 °C before use
Formaldehyde 37% solutionProquímiosN/A
FormamideVetecV900064
Glacial acetic acidProquímiosN/A
India inkPelikan221143
L-glutamine solution (200 mM)Gibco25030-149
Magnesium chlorideMerck8147330100For NTM buffer preparation
Maleic acidSigma-aldrichM0375-500GFor MAB buffer preparation
MethanolProquímios
Normal Goat SerumSigma-aldrichNS02LInactivate at 56 °C before use
4-Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11585029001
Nuclear fast redSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicillin G sodium saltSigma-aldrichP3032
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-aldrichP3813
Phosphomolybdic acidMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
Salmon sperm DNAInvitrogen15632011For hybridization buffer preparation
Sodium chlorideSigma-aldrichS9888For SSC, MAB and NTM buffer preparation
Streptomycin SulfateSigma-aldrichS6501
Taq Polymerase kitCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquímiosN/A
Microscope and equipments
Axioplan upright microscopeCarl Zeiss MicroscopyN/A
Axiovision softwareCarl Zeiss MicroscopyN/A
Cell incubatorThermoForma3110
Egg incubator- 50 eggsGP
Gooseneck lampBiocamN/AFor egg manipulation
Fiji software; Cell Counter pluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminar flow hoodTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Rotary microtomeLeica BiosystemsRM2125 RTSFor sectioning
StereomicroscopeLabomedLuxeo 4DFor egg manipulation
Sterilization ovenREALIS7261690For sterelization of surgical materials
Consumables
0.2 mL (PCR) polypropylene centrifuge tubesEppendorf30124707
15 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430791
1.5 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-150-C
2 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-200-C
50 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μL sizeInvitrogenAM12655For egg manipulation
Excavated Glass Block (Staining Block) with Cover GlassHecht Karl42020010
Embedding cassettesSimportM480Used as a paraffin block holder
Glass coverslides, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Glass Pasteur pipettes 230 mmNORMAX5426023For preparation of glass capillaries
Microtome bladesLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818For sectioning
Parafilm MParafilmP7793
Plastic Petri dish, 30 mmKasviK13-0035For egg manipulation
Plastic Petri dish, 60 mmProlab0303-8For cell spheroids preparation. Should not be treated for cell adhesion. 
Silanized glass slides (Starfrost)Knittel Glass198For sectioning
Syringe 1 mL , Needles 26 G (0.45 x 13 mm)Descarpack32972For egg manipulation (albumen aspiration)
Surgical tools
Aspirator tubeDrummond2-000-000For egg manipulation
Dissection scissorsFine Science Tools14061-11For egg manipulation
Microforceps (tweezers)Fine Science Tools00108-11For egg manipulation and preparation of glass capillaries
Needle holder (adjustable dissection needle chuck)Fisherbrand8955For egg manipulation
Oil whetstone, 10.000 gritN/AN/AFor sharpening needles
Pair of small paint brushesN/AN/AFor handling paraffin sections. Any brand may be used.
Sewing needlesN/AN/AFor sharpening into microscalpels. Any brand may be used.
Sterile disposable scalpel No. 23Swann-Norton110For sectioning
Surgical scalpel handleSwann-Norton914For sectioning
Wecker iris scissors, sharp/sharpSurtexSS-641-11For egg manipulation

参考文献

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