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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation und Identifizierung von menschlichen Zellsphäroiden in Hühnerembryonen. Dieses Xenotransplantat-Modell nutzt die embryonale Mikroumgebung als Quelle für instruktive Signale, um Zellmigration, Differenzierung und Tropismus zu testen, und eignet sich besonders für die Untersuchung von primären und/oder heterogenen Zellpopulationen.

Zusammenfassung

Xenotransplantate sind wertvolle Methoden, um das Verhalten menschlicher Zellen in vivo zu untersuchen. Insbesondere die embryonale Umgebung liefert Hinweise auf Zellmigration, Differenzierung und Morphogenese, mit einzigartigen instruktiven Signalen und Keimblattidentität, die in adulten Xenotransplantatmodellen oft fehlen. Darüber hinaus können embryonale Modelle nicht zwischen Selbst- und Nicht-Selbstgewebe unterscheiden, wodurch das Risiko einer Abstoßung des Transplantats und die Notwendigkeit einer Immunsuppression des Wirts eliminiert werden. In diesem Artikel wird eine Methodik zur Transplantation von Sphäroiden menschlicher Zellen in Hühnerembryonen vorgestellt, die zugänglich und manipulierbar sind und sich bei 37 °C entwickeln.

Sphäroide ermöglichen die Auswahl einer bestimmten Region des Embryos für die Transplantation. Nach der Transplantation werden die Zellen in das Wirtsgewebe integriert, so dass ihre Migration, ihr Wachstum und ihre Differenzierung verfolgt werden können. Dieses Modell ist flexibel genug, um die Nutzung verschiedener adhärenter Populationen zu ermöglichen, einschließlich heterogener primärer Zellpopulationen und Krebszellen. Um die Notwendigkeit einer vorherigen Zellmarkierung zu umgehen, wird auch ein Protokoll zur Identifizierung von Spenderzellen durch Hybridisierung von humanspezifischen Alu-Sonden beschrieben, was besonders bei der Untersuchung heterogener Zellpopulationen wichtig ist. Darüber hinaus können DNA-Sonden leicht angepasst werden, um andere Spenderarten zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die allgemeinen Methoden zur Präparation von Sphäroiden, zur Transplantation in Hühnerembryonen, zur Fixierung und Verarbeitung von Gewebe für die Paraffinsektion und schließlich zur Identifizierung der menschlichen Zellen durch DNA-in-situ-Hybridisierung . Vorgeschlagene Kontrollen, Beispiele für die Interpretation von Ergebnissen und verschiedene Zellverhaltensweisen, die getestet werden können, werden zusätzlich zu den Einschränkungen dieser Methode diskutiert.

Einleitung

Xenotransplantate sind nützliche Werkzeuge, um das Verhalten menschlicher Zellen in vivo zu untersuchen. Diese Modelle haben unschätzbare Informationen für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Themen geliefert, wie z.B. die Biologie menschlicher Stammzellen1, die Beobachtung zellulärer Ereignisse in Echtzeit2 und die Untersuchung der Tumorangiogenese und Metastasierung3. Darüber hinaus wurden verschiedene Aspekte der Krebsbiologie, einschließlich der Tumorgenese von patientenspezifischen Xenotransplantaten, untersucht 4,5. Jedes dieser Xenotransplantatmodelle hat seine Vor- und Nachteile und ist daher besser für spezifische wissenschaftliche Fragestellungen geeignet. Hühnerembryonen sind ein beliebtes Modell der Entwicklungsbiologie, da es sich um ein zugängliches Amniotenmodell handelt, das chirurgischen Manipulationen zugänglich ist. Heterologe Transplantate haben es den Forschern ermöglicht, präzise Schicksalskartenzu erstellen 6 oder zu untersuchen, ob ein Merkmal zellautonom oder von der Umwelt angewiesen ist 7,8. Eine ähnliche Logik ermöglicht es, den Hühnerembryo als Xenotransplantatmodell zu verwenden, um das Verhalten menschlicher Zellen zu untersuchen.

Die embryonale Umgebung orchestriert aktiv die Morphogenese des Gewebes mit Migrations- und Differenzierungssignalen sowie Zell-Zell-Interaktionen. Im Vergleich zu adulten Xenotransplantatmodellen bietet der Embryo somit ein lehrreicheres Milieu, um das Verhalten transplantierter Zellen zu testen, z. B. durch Nachahmung von Signalen, die in adulten Stammzellnischen vorhanden sind (z. B. BMPs, WNTs, NOTCH und SHH9). Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen eines adaptiven Immunsystems während der frühen Entwicklung die Durchführung von Xenotransplantaten ohne das Risiko einer Immunantwort oder einer Abstoßung des Spendergewebes10. Frühere Studien haben zu diesem Zweck Xenotransplantate von menschlichen Zellen in Hühnerembryonen untersucht. Das neurogene Potential menschlicher Stammzellen wurde nach Injektion in das Neuralrohr oder die Blutgefäße11 zusätzlich zur Integration embryonaler Stammzellen12 und induzierter pluripotenter Stammzellen13 in den Embryo untersucht. Menschliche Melanomzellen wurden auch anhand der embryonalen Umgebung des Kükens untersucht, was Zusammenhänge zwischen ihrer Tumorgenese und dem Verhalten von Neuralleistenzellenaufdeckte 14 sowie die Reprogrammierung der Tumorzellen mit den Informationen aus dem Embryo15. In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, das sich besonders für die Untersuchung des Verhaltens von primären und heterogenen Zellpopulationen des Menschen eignet.

In den letzten Jahrzehnten wurde die stromale Komponente verschiedener Gewebe als autologe Quelle von Vorläufer-/Stammzellen und auf ihre proangiogenen und immunregulatorischen Eigenschaften untersucht, die früher als "mesenchymale Stammzellen" bekannt waren16,17,18. Die erste dieser Zellpopulationen, die charakterisiert wurde, war die Knochenmark-Stroma-/Stammzellpopulation (BMSCs), die in vivo ein osteo-, adipo- und in geringerem Maße chondrogenes Potenzial aufweisen 19,20. Aus Fett gewonnene Stromazellen (ADSCs) sind eine heterogene Population, die durch enzymatische Verdauung der Lipoaspirat- oder Dermolipektomieproben gewonnen wird, gefolgt von der Isolierung der stroma-vaskulären Fraktion (SVF) und schließlich der Expansion in Kultur21. In Kultur sind diese Zellen phänotypisch gekennzeichnet durch Marker, die mit anderen mesenchymalen Populationen geteilt werden, wie CD90, CD73, CD105 und CD44, einzigartige Marker wie CD36 und das Fehlen von hämatopoetischen (CD45) oder endothelialen (CD31) Markern22. Darüber hinaus haben ADSCs in vitro ein osteo-, adipo- und chondrogenes Potenzial, und die Anzahl der Stamm-/Vorläuferzellen in dieser Population kann durch den Fibroblastoid colony-forming unit (CFU-F) Assay22 bestimmt werden. In vivo wurde berichtet, dass Zellen mit dem ADSC-Phänotyp in stromalen23 und/oder perivaskulären24 Kompartimenten existieren. Es wird immer deutlicher, dass trotz der gemeinsamen Marker nach der In-vitro-Kultur das Stromakompartiment verschiedener Gewebe die intrinsischen Eigenschaften eines bestimmten Organs widerspiegelt, und diese Zellpopulationen haben je nach Herkunft unterschiedliche Eigenschaften 17,25,26,27. Da diese Zellen aufgrund ihrer Adhäsion an eine Zellkulturschale isoliert werden, können sie außerdem aus Zellen aus verschiedenen Keimblättern zusammengesetzt sein28. Daher kann der Einsatz einer Xenotransplantat-Methode zur unvoreingenommenen Untersuchung des Differenzierungspotenzials und des Tropismus von Stromazellen wertvolle Informationen über diese Zellpopulationen liefern, um die Entwicklung zukünftiger Zelltherapien zu leiten.

Bei dem hier beschriebenen Protokoll (Abbildung 1) handelt es sich um eine Xenotransplantat-Methode, die sich die geringen Kosten und die einfache Manipulation von Hühnerembryonen zunutze macht. Es wurde zuvor verwendet, um das Verhalten von humanen ADSC29, Hautfibroblasten29, aus Menstruationsblut gewonnenen Stromazellen30 und Glioblastomzellen31 zu untersuchen. Dieses Verfahren wird die Transplantation von Zellen als Sphäroide32 umfassen, die aus jeder Population adhärenter Zellen hergestellt werden können (Abbildung 2). Chirurgische Verfahren und die Herstellung von kundenspezifischen chirurgischen Materialien - den Mikroskalpellen und Glaskapillaren - werden ebenfalls beschrieben (Abbildung 3). Humane Zellen werden in histologischen Schnitten durch Hybridisierung humanspezifischer Alu-Sonden nachgewiesen (Abbildung 4), wodurch eine vorherige Markierung der transplantierten Zellen überflüssig wird. Die repräsentativen Ergebnisse beschreiben das Verhalten von humanen ADSC-Transplantaten, die sowohl in der somitischen Region auf Ebene der Flügelknospen (Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7) als auch im ersten Pharynxbogen (Abbildung 8) transplantiert wurden, sowie von humanen primären Glioblastom-Sphäroiden, die in das Prosencephalon transplantiert wurden (Abbildung 8). Die Zellmigration, Differenzierung und Interaktion mit embryonalem Hühnergewebe werden beschrieben, sowie vorgeschlagene Assays zur weiteren Untersuchung des Zellverhaltens durch Co-Färbung oder Färbung benachbarter Schnitte.

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Protokoll

Alle in vivo-Verfahren , die in dieser Studie angewandt wurden, entsprachen allen einschlägigen Versuchsrichtlinien für Tierversuche und Forschung gemäß den brasilianischen Leitlinien zur Verwendung von Versuchstieren (L11794). Die Protokolle, die für den Umgang mit Hühnerembryonen verwendet werden, wurden alle von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in wissenschaftlichen Versuchen (Zentrum für Gesundheitswissenschaften der Bundesuniversität von Rio de Janeiro) genehmigt. Die Verwendung menschlicher Zellen wurde von der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses Clementino Fraga Filho genehmigt (Nummern 043/09 und 088/04). Es wurden spezifische pathogenfreie (LSF) Eier von Weißem Leghornhuhn (Gallus gallus) verwendet.

1. Präparation von Zellsphäroiden

HINWEIS: Zellsphäroide können mit einer Vielzahl von Zelltypen hergestellt werden, solange sie adhärent sind. Für dieses Protokoll wurden humane aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ADSCs) isoliert, wie zuvor beschrieben;21,27 wird verwendet (Abbildung 2A). Die Zellen wurden durch Verdauung von Fettgewebsfragmenten oder Lipoaspiraten mit Kollagenase IA für 1 h bei 37 °C unter Rühren gewonnen, gefolgt von einer Plattierung bei 1-2 × 104 Zellen/cm2 und einer Inkubation über Nacht. Nicht adhärente Zellen wurden verworfen und die adhärenten Zellen wurden für 3-6 Passagen expandiert. Die ADSCs waren homogen für die Expression der Oberflächenantigene CD105, CD90, CD13 und CD44 und negativ für die hämatopoetischen Antigene CD45, CD14, CD34, CD3 und CD1927. Während das hier beschriebene Verfahren leicht mit minimalem Material durchgeführt werden kann, das über das hinausgeht, was routinemäßig für die Zellkultur verwendet wird, sollten die optimale Aggregationszeit und die Notwendigkeit einer partiellen Dissoziation empirisch bestimmt werden. Alternative Verfahren zur Herstellung von Zellsphäroiden können verwendet werden, wie z. B. das Hanging-Drop-Verfahren33 oder mit Agarose beschichtete Vertiefungen34; Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion. Alle Eingriffe sollten auf einer Reinbank mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.

  1. Erwärmen Sie steriles PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), Kulturmedium und Trypsinlösung auf 37 °C, bevor Sie die Zellen manipulieren.
  2. Kultivierte ADSCs in DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Verwenden Sie einen konfluenten 25 cm2 Kolben mit ADSCs für die Herstellung von zwei Platten mit Sphäroiden . Entsorgen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Kulturschale dreimal mit einer angemessenen Menge sterilem PBS (5 ml PBS für jede Wäsche, wenn ein 25cm großer 2-Zell-Kulturkolben verwendet wird).
  3. Geben Sie genügend Trypsinlösung (mit 0,78 mM EDTA) hinzu, um die Zellen zu bedecken (1 ml Trypsinlösung, wenn ein 25cm 2-Zell-Kulturkolben verwendet wird) und lassen Sie den Kulturkolben 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
  4. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig auf und ab, um sie zu dissoziieren. Fügen Sie die gleiche Menge an Kulturmedium hinzu, das FBS enthält, um das Trypsin zu inaktivieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  5. 10 min bei 180 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und klopfen Sie auf das Rohr, um das Kügelchen zu lösen.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl-2 ml Kulturmedium, das für den Zelltyp geeignet ist (siehe Schritt 1.2).
    HINWEIS: Die Mindestkonzentration beträgt 5 × 105 Zellen/ml für adhärente Zellen wie ADSCs und Fibroblasten. Ein konfluenter 25-cm-2-Kolben mit ADSCs sollte in 2 mL Medium resuspendiert und in 2 Petrischalen mit je 1 mL plattiert werden. Weniger adhärente Zellen, wie z. B. Gliazellen, können von einer Beschichtung bei ~2 × 106 Zellen/ml in einem geringeren Volumen profitieren.
  7. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig auf eine Seite einer sterilen 60-mm-Petrischale (unbeschichtet und unbehandelt, wie sie z. B. zur Herstellung von Agarplatten verwendet wird). Versuchen Sie, das Nährmedium auf den kleinstmöglichen Bereich zu beschränken (Abbildung 1B), indem Sie die Schale über ein Stück gefaltete, saubere Gaze stützen, um sie im Inkubator gekippt zu halten.
  8. Die Zellsuspension wird bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert, bis sich Zellaggregate bilden (6-8 h nach dem Plattieren der ADSCs).
    HINWEIS: Die Aggregationszeit der Sphäroide kann je nach Zelltyp variieren.
  9. Falls erforderlich (siehe Diskussion), dissoziieren Sie große Zellaggregate teilweise, indem Sie sie vorsichtig mit 1000-μl-Spitzen auf und ab pipettieren. Dissoziieren Sie ADSC-Sphäroide 6-8 h nach dem Plattieren.
  10. Legen Sie die Platte in den Inkubator, bis die Sphäroide zur Transplantation bereit sind: rund mit definierten Rändern und nicht leicht dispergierbar (Abbildung 1C,D).
    HINWEIS: ADSC-Sphäroide sind 2 Tage nach der teilweisen Dissoziation bereit.

2. Transplantation von Sphäroiden in Hühnerembryonen

  1. Präparat
    1. Bereiten Sie Hühnereier vor, indem Sie 15-30 Eier in einem feuchten Inkubator bei 37,5 °C inkubieren, bis das gewünschte Hamburger-Hamilton (HH)-Stadium erreicht ist.35: 40-45 h für Transplantate in Somiten auf Höhe der Gliedmaßenknospen (HH11-12 oder 13-19 Somiten) oder 29-33 h für Transplantate im Kopfbereich (HH8-9 oder 5-8 Somiten). Positionieren Sie die Eier horizontal und zeichnen Sie vor der Inkubation mit einem Bleistift eine Linie auf die Oberseite der Eier (Abbildung 3D).
      HINWEIS: Die Inkubationszeiten können je nach Inkubator leicht variieren. Das Zeichnen einer Linie stellt sicher, dass der obere Teil der Eizelle, in dem sich der Embryo befindet, leicht identifiziert werden kann, wenn die Eizelle vor dem Experiment gedreht wird.
    2. Bereiten Sie scharfe Nadeln ("Mikroskalpelle") vor, indem Sie eine Nähnadel an einem Nadelhalter aus Metall befestigen (Abbildung 3B). Schärfen Sie die Nadel mit einem geölten Schleifstein, bis sie einem kleinen Skalpell mit dünnem Rand ähnelt (Abbildung 3C). Alternativ kann eine scharfe Wolframnadel durch Elektrolyse36 hergestellt werden.
    3. Bereiten Sie Glaskapillaren mit der Flamme eines Bunsenbrenners vor, um den dünnen Teil einer Pasteurpipette aus Glas kurz zu schmelzen. Entferne den geschmolzenen Teil von den Flammen und dehne ihn, um eine dünne Kapillare zu bilden. Teilen Sie die Kapillare vorsichtig in zwei Teile, indem Sie sie mit einer Mikrozange aufbrechen. Bereiten Sie eine dünne Kapillare für die Injektion von Tusche und eine dicke Kapillare für die Übertragung von Sphäroiden vor (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Durch Variieren der Zugkraft ist es möglich, unterschiedliche Kapillarstärken zu erzeugen. Die Kapillaren sollten kurz vor der Operation vorbereitet werden.
    4. Bereiten Sie die Arbeitsfläche und andere Materialien für die Manipulation der Eier vor (Abbildung 3A). Sterilisieren Sie alle chirurgischen Materialien über Nacht in einem 100 °C heißen Ofen oder unmittelbar vor der Verwendung mit 70 % Ethanol. Steriles PBS auf 37 °C erwärmen. Befestigen Sie eine 200-μl-Spitze (mit Barriere) an der Aspiratorröhrchenbaugruppe für die Injektion von Tusche und die Übertragung von Sphäroiden.
      HINWEIS: Verwenden Sie Spitzen mit Barrieren, wenn Sie Sphäroide von menschlichen Zellen übertragen.
    5. Geben Sie kurz vor dem Experiment 2 Tropfen Tusche-Stofflösung in die 30-mm-Petrischale und mischen Sie sie mit 1 ml sterilem PBS. Nehmen Sie die Sphäroidplatte aus dem Inkubator und legen Sie sie für den Rest des Experiments über eine Eisbox.
  2. Zubereitung jedes Eies
    1. Nehmen Sie ein Ei aus dem Brutkasten und legen Sie es über einen Eierhalter. Machen Sie ein kleines Loch in das scharfe Ende des Eies (Abbildung 2D) und aspirieren Sie 1,5 ml Albumin mit einer Spritze und einer Nadel. Führen Sie die Nadel senkrecht zum Ei ein, um das Eigelb nicht zu beschädigen. Verschließen Sie das Loch mit Klebeband. Wiederholen Sie diesen Schritt optional für alle Eier vor dem Experiment und bebrüten Sie die restlichen Eier erneut.
    2. Schneiden Sie vorsichtig mit einer Schere ein Fenster auf der Oberseite des Eies auf (Abbildung 3D). Mit der Pipette 1-2 Tropfen PBS über das Eigelb geben. Entfernen Sie bei Bedarf große Eiweißblasen (wie die in Abbildung 3F gezeigten) mit der Pipette.
    3. Befestigen Sie die dünne Kapillare an der Absaugrohrbaugruppe. Füllen Sie die Glaskapillare teilweise mit der Tuschelösung durch Aspiration. Injizieren Sie so viel Tinte in das Eigelb unter dem Embryo, bis die embryonalen Strukturen zu sehen sind (Abbildung 3E,F).
    4. Zählen Sie mit dem Stereomikroskop die Anzahl der Somiten (Abbildung 4A). Nummerieren Sie die Eier einzeln mit einem Bleistift (Abbildung 4B).
  3. Sphäroid-Transplantation
    1. Identifizieren Sie die Region des Transplantats: paraxiales Mesoderm auf der Ebene der Flügelknospen (präsomitisches Mesoderm der präsumtiven 15. bis 20. Somiten37) (Abbildung 3G und Abbildung 5A) oder präsumtive Region des ersten Pharynxbogens (zwischen dem Ektoderm und dem Endoderm lateral des hinteren Mesencephalons/ersten Rhombimers38) (Abbildung 8A).
    2. Schneiden Sie die Vitellinmembran mit einem Mikroskalpell über die Zielregion.
    3. Machen Sie mit einem Paar Mikroskalpelle einen flachen Schnitt in dem Bereich, in den das Sphäroid implantiert wird (Abbildung 3H).
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine Beschädigung des darunter liegenden Endoderms; Andernfalls läuft das Eigelb aus (in diesem Fall das Ei wegwerfen).
    4. Entfernen Sie die dünne Kapillare aus dem Aspirator und ersetzen Sie sie durch die dicke Kapillare. Beobachten Sie die Sphäroide unter dem Stereomikroskop und wählen Sie ein Sphäroid, das ungefähr die gleiche Größe wie das Somite hat (Abbildung 2D). Aspirieren Sie dieses Sphäroid in die Kapillare.
    5. Platzieren Sie das Sphäroid vorsichtig neben dem Schnittbereich (Abbildung 3H). Schieben Sie das Sphäroid mit den scharfen Nadeln in den Schnittbereich (Abbildung 3I,J).
    6. Geben Sie 1-2 Tropfen PBS mit der Pipette über den Embryo, um sicherzustellen, dass das Sphäroid fest eingeführt wird.
      HINWEIS: Wenn das Transplantat entfernt wird, sollte ein neues Sphäroid transplantiert werden (Schritte 2.3.4 und 2.3.5).
    7. Reinigen Sie jedes Albuminleck aus der Eierschale mit Seidenpapier, um sicherzustellen, dass das Ei vollständig versiegelt werden kann und eine Kontamination vermieden wird. Verschließe das Fenster im Ei mit Klebeband.
    8. Achten Sie auf die transplantierte Region (Abbildung 4A). Legen Sie das Ei vorsichtig wieder in den feuchten Brutkasten bei 37,5 °C, um ein Lösen des eingelegten Sphäroids zu vermeiden.
    9. Inkubieren Sie das Ei bis zum gewünschten Stadium.
      HINWEIS: Wenn das Xenotransplantat in Somiten auf der Ebene der Gliedmaßenknospen durchgeführt wird, wurden Migration und Zelltod erfolgreich an 3,5 Tage alten Embryonen (HH21) getestet, und Zelldifferenzierung und Tropismus wurden an 6 Tage alten Embryonen (HH29) beobachtet (Abbildung 5A). Die Integration in das Wirtsgewebe wurde auch bei 8 Tage alten Embryonen durchgeführt (HH33). Spenderzellen, die in den Rachenbogen transplantiert wurden, wurden an 4,5 Tage alten Embryonen (HH25) untersucht (Abbildung 8A).

3. Gewebedissektion, Fixierung, Verarbeitung und Vorbereitung histologischer Schnitte

  1. Präparieren und Fixieren
    1. Bereiten Sie das Fixiermittel (mindestens 1 ml/Embryo) vor: Ethanol 100%-Formaldehyd 37%-Eisessig im Verhältnis 6:3:1. Reinige die Arbeitsfläche, eine Mikrozange, eine chirurgische Schere oder eine Irisschere und einen Schaumlöffel. Füllen Sie eine 60 mm Glas-Petrischale mit kaltem PBS und legen Sie sie unter ein Stereomikroskop.
    2. Öffne das Ei, indem du das Klebeband ausschneidest.
    3. Schneiden Sie die Membranen um den Embryo herum und entfernen Sie sie mit dem Schaumlöffel.
    4. Übertragen Sie den Embryo in die Petrischale. Wenn der Embryo 5 Tage alt (HH26) oder älter ist, enthaupten Sie ihn sofort, bevor Sie ex ovo manipulieren.
    5. Entfernen Sie alle verbleibenden Membranen mit einer Mikrozange und einer Schere. Rühren Sie die Probe vorsichtig in PBS um, um alle verbleibenden Dottertröpfchen wegzuspülen.
    6. Wenn das Xenotransplantat auf Flügelhöhe durchgeführt wurde, ist der Kopf zu verwerfen. Wenn Zellen in die Kopfregion transplantiert wurden, schneiden Sie die untere Körperhälfte ab und entsorgen Sie sie, um sicherzustellen, dass die Herzregion intakt bleibt.
    7. Übertragen Sie jede Probe in ein separates 2,0-ml-Röhrchen, das 1 ml des Fixiermittels enthält. Identifizieren Sie die Röhrchen einzeln wie zuvor (Abbildung 4B). Über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubieren.
    8. Verwenden Sie ein Pellet aus Zellen oder Sphäroiden (Abbildung 4F) als Positivkontrolle. Zentrifugieren Sie dazu eine Zellsuspension (Schritt 1.5) oder Zellsphäroide (Schritt 1.10) bei 180 × g für 10 min in einem 1,5-ml-Röhrchen, verwerfen Sie das Nährmedium und fügen Sie 1 ml des Fixiermittels hinzu, ohne das Pellet zu stören. Das Röhrchen über Nacht bei 4 °C ohne Rühren inkubieren und auf die gleiche Weise wie bei den Kükenproben verfahren.
  2. Dehydrierung und Einbettung
    1. Dehydrieren Sie die Embryonen durch aufeinanderfolgende Wäschen von 1 ml 70%, 80%, 90% und 100% Ethanol in 1x PBS für jeweils mindestens 1 h unter Rühren.
    2. Die Proben werden über Nacht in 1 ml 100 % Ethanol bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert.
    3. Die Proben werden 1 h lang in 1 ml 100 % Xylol in einem Abzug inkubiert. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei Mal.
    4. Übertragen Sie den Inhalt des Röhrchens in den Färbeblock und entsorgen Sie das Xylol. Füge genug geschmolzenes Paraffin hinzu, um den Embryo zu bedecken, und bedecke den Färbeblock mit seinem Glasdeckel. Über Nacht in einem 65 °C heißen Ofen inkubieren.
    5. Bereiten Sie eine warme Platte und eine Form für Paraffinblöcke zum Einbetten vor.
      HINWEIS: Ein Paar ausgestreckte Büroklammern sind nützlich, um den Embryo zu positionieren.
    6. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Paraffin und übertragen Sie den Embryo darauf. Positionieren Sie den Embryo so, dass er einen Querschnitt des Rumpfes (Abbildung 5A) oder einen koronalen Abschnitt des Kopfes (Abbildung 8A) erhält.
    7. Führen Sie ein Namensschild aus Papier in das Paraffin ein, das der zu schneidenden Oberfläche gegenüberliegt, um den Embryo in die richtige Ausrichtung zu schneiden (Abbildung 4C).
    8. Falls verwendet, legen Sie die Einbettkassette über die Probe. Lassen Sie den Block vollständig abkühlen, bevor Sie ihn aus der Form nehmen. Alternativ können Sie den ausgehärteten Paraffinblock mit geschmolzenem Paraffin an der Kassette oder einem anderen Blockhalter befestigen und wieder abkühlen lassen.
  3. Schnittdarstellung
    1. Bereiten Sie die Materialien für das Trennen vor. Eine Kochplatte auf 42 °C erwärmen und eine Papp- oder Styroporplatte mit sauberer Alufolie ca. 30 cm x 20 cm abdecken. Reinigen Sie alle Oberflächen vor dem Gebrauch.
      HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe, um eine Kontamination mit Nukleasen zu vermeiden, insbesondere wenn einige Abschnitte für die RNA-in-situ-Hybridisierung verwendet werden. Vermeiden Sie aus dem gleichen Grund die Verwendung eines Histologiebades, um die Paraffinabschnitte zu dehnen, es sei denn, das Wasser und die Oberflächen können vorher gründlich gereinigt werden.
    2. Schneiden Sie das überschüssige Paraffin mit einer Mikrotomklinge ab. Erstellen Sie auf beiden Seiten eine Abschrägung in trapezförmiger Form, um die einzelnen Abschnitte in einem späteren Schritt mit einer Skalpellklinge leicht trennen zu können (Abbildung 3A).
    3. Befestigen Sie den Block am Mikrotom. Positionieren Sie den Block vorsichtig so, dass die linke und rechte Seite parallel zueinander sind. Führen Sie eine feinere Einstellung durch, nachdem Sie einige Abschnitte der Probe geschnitten und unter einem Mikroskop betrachtet haben.
    4. Wenn die Zielregion erreicht ist (entweder die Knospe der Gliedmaßen oder der erste Rachenbogen), schneiden Sie 7 μm lange Abschnitte ab und legen Sie die Paraffinbänder über die mit Alufolie bedeckte Platte. Schnitt der gesamten Zielregion (Abbildung 4C).
    5. Für die Vorbereitung von Serienschnitten ist die ausreichende Anzahl von Objektträgergläsern mit Tropfen sterilem entionisiertem Wasser zu bedecken. Übertragen Sie einzelne Abschnitte nacheinander mit Pinseln und einem Skalpell auf die Folien. Übertragen Sie benachbarte Abschnitte auf verschiedene Folien, um serielle Abschnitte zu erstellen (Abbildung 4D). Bereiten Sie eine Serie von 3 Objektträgern für 3,5 Tage alte Embryonen, 4 Objektträger für 4,5 Tage alte und 5 Objektträger für 6 Tage alte Embryonen vor. Färben Sie benachbarte Schnitte mit unterschiedlichen Sonden, Antikörpern oder klassischen histologischen Färbungen.
      HINWEIS: Dieselbe Serie kann mehrere benachbarte Objektträger enthalten, wenn ein großer Teil des Embryos geschnitten wird. Auf jede Folie können mehrere Abschnitte übertragen werden, wobei zwischen den Abschnitten etwas Abstand bleibt, damit sie sich dehnen können. Legen Sie die Folie noch nicht auf die Warmhalteplatte.
    6. Nachdem alle Abschnitte auf die Rutschen übertragen wurden, fügen Sie mehr Wasser hinzu, bis alle Abschnitte über einem einzigen Wassertropfen schweben. Legen Sie die Folie auf eine warme Platte und lassen Sie die Abschnitte dehnen. Nehmen Sie den Objektträger von der warmen Platte und entfernen Sie das Wasser, indem Sie das Objektträgerglas vorsichtig gegen Seidenpapier kippen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte den Glasschieber nicht direkt berühren, bevor sie sich dehnen.
    7. Lassen Sie die Objektträger über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator trocknen.

4. Synthese von Digoxigenin-markierten Alu-Sonden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

  1. Herstellen einer Stammlösung der folgenden humanspezifischen Grundierungen39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' und AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Bereiten Sie 50 μl der folgenden PCR-Reaktion40 vor: 1x PCR-Puffer, 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dATP, 0,065 mM dTTP, 0,035 mM dig-11-dUTP, 0,4 μM AluFw-Primer, 0,4 μM AluRev-Primer, 0,05 U/μl Taq-Polymerase und 1 ng/μl humangenomische DNA.
  3. Führen Sie die PCR mit den folgenden Einstellungen durch: Erstdenaturierung bei 94 °C für 4 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 94 °C für 20 s, 60 °C für 20 s und 72 °C für 20 s, gefolgt von einer abschließenden Denaturierung von 72 °C für 5 Minuten.
  4. Messen Sie die Sondenkonzentration mit einem Spektralphotometer. Lagern Sie die Sonden bei -20 °C.
    HINWEIS: Das PCR-Produkt sollte 200-300 bp lange nach der Elektrophorese in einem 2%igen Agarosegelvorliegen 29.

5. Schnitt in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden

  1. Tag 1: Permeabilisierung und Hybridisierung
    HINWEIS: Für alle Schritte, die an Tag 1 durchgeführt werden, sollte ein sterilisiertes Objektträgerglas verwendet werden.
    1. Eine Wäsche PBT (0,1 % Tween 20 in PBS) in einem 37 °C warmen Wasserbad vorheizen und eine feuchte Kammer mit 50 % Formamid/50 % deionisiertem Wasser vorbereiten.
      HINWEIS: Berechnen Sie das Volumen aller Wäschen basierend auf der Größe des Glases. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Waschgänge durch Eintauchen der Objektträger in die Lösung durchgeführt.
    2. Entfernen Sie das Paraffin durch drei aufeinanderfolgende Wäschen in Xylol, jeweils 5 Minuten, in einem Abzug.
    3. Rehydrieren Sie die Serie durch zwei Wäschen in 100 % Ethanol für jeweils 5 Minuten, gefolgt von 90/70/30 % Ethanol-Wäschen in PBS für jeweils 2 Minuten.
    4. In PBT (0,1 % Tween 20 in PBS) dreimal für jeweils 5 min waschen.
    5. Für die Permeabilisierung fügen Sie dem vorgewärmten PBT 2 μg/ml Proteinase K hinzu, tauchen Sie die Objektträger in die Lösung und inkubieren Sie sie 14 Minuten lang in einem 37 °C heißen Wasserbad.
    6. Fixieren Sie die Schnitte durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd/PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
    7. 5 Min. mit PBS waschen.
    8. Nachdem Sie überschüssiges PBS von jedem Objektträger abgewischt haben, bedecken Sie die Schnitte mit 300 μl Hybridisierungspuffer (50 % deionisiertes Formamid, 4x SSC pH 5,0, 1x Denhardt-Lösung, 5 % Dextransulfat, 100 μg/ml Lachsspermien-DNA) (Tabelle 1). 1 h bei 42 °C in der Formamidkammer inkubieren.
    9. Bereiten Sie eine Lösung von 0,2 ng/ml Alu-Sonde in Hybridisierungspuffer vor. Kippen Sie den Objektträger, um den Hybridisierungspuffer zu entfernen, und fügen Sie 120 μl der Alu-Sondenlösung über die Schnitte hinzu. Decken Sie es mit einem Glasdeckglas ab und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Parafilm sollte in diesem Schritt nicht zum Abdecken der Objektträger verwendet werden, da er bei Temperaturen über 70 °C schmilzt.
    10. Die Dias auf einer heißen Platte bei 95 °C 5 Min. erhitzen.
      HINWEIS: Atmen Sie die Formamiddämpfe nicht ein.
    11. Inkubieren Sie die Objektträger bei 42 °C in der Formamidkammer über Nacht.
  2. Tag 2: Stringenzwaschungen und Immunhistochemie
    1. Bereiten Sie 20x SSC-Puffer (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,5) vor (Tabelle 1). Zwei Wäschen mit 0,1x Kochsalz-Natriumcitrat (SSC)-Puffer, pH 7,5, auf 42 °C vorheizen.
    2. Füllen Sie ein Objektträgerglas mit 2x SSC-Puffer, pH 7,5. Legen Sie die Objektträger vorsichtig in die Lösung und warten Sie, bis sich die Deckgläser gelöst haben. Entfernen Sie die Deckgläser mit einer Zange und inkubieren Sie die Objektträger in 2x SSC-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Waschen Sie die Objektträger erneut mit 2x SSC-Puffer, pH 7,5, für 5 min bei Raumtemperatur.
    4. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit 0,1x SSC-Puffer, pH 7,5, bei 42 °C für jeweils 5 min.
    5. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit MABT (Maleinsäurepuffer mit Tween; 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M Natriumchlorid, 0,1 % Tween 20, pH 7,5) (Tabelle 1) für jeweils 30 min bei Raumtemperatur.
    6. Wischen Sie überschüssigen Puffer von jedem Objektträger ab und bedecken Sie die Abschnitte mit 400 μl Blockierungslösung (10 % inaktiviertes normales Ziegenserum, 2 % Blockierungsreagenz in MABT). 2 h in einer feuchten Kammer (mit entionisiertem Wasser vorbereitet) bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Kippen Sie die Objektträger, um die Flüssigkeit zu entfernen, und fügen Sie 150 μl Fab Anti-DIG-Fragmente hinzu, die an alkalische Phosphatase konjugiert sind, in einer Verdünnung von 1:2.000 in Blockierungslösung. Mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken und in der Feuchtkammer bei 4 °C 16 h inkubieren.
  3. Tag 3: Farbentwicklung
    1. Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser oder den Parafilm in einem Glas mit MABT (wie in Schritt 5.2.2) und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in MABT.
    2. Noch dreimal für jeweils 30 min mit MABT waschen.
    3. Mit MAB (Maleinsäurepuffer; 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5) (Tabelle 1) 30 min lang waschen.
    4. Zweimal mit NTM (NaCl-Tris-MgCl2 Puffer; 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM Natriumchlorid, 50 mM Magnesiumchlorid) (Tabelle 1) für jeweils 10 min waschen.
    5. Geben Sie die Färbelösung (0,45 μL/ml, 4-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid, 3,5 μL/ml, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, p-Toluidin in NTM) (Tabelle 1) in das Färbegefäß und tauchen Sie die Objektträger in die Lösung. Decken Sie das Glas mit Alufolie ab und lassen Sie die Farbe über Nacht bei 37 °C entstehen.
  4. Tag 4: Gegenfärbung und Montage
    1. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Färbelösung ordnungsgemäß als Halogenabfall entsorgt wird.
    2. Montieren Sie die Objektträger so, wie sie sind, indem Sie Tropfen eines wässrigen Eindeckmediums hinzufügen und die Abschnitte mit einem Glasdeckglas abdecken. Alternativ können Sie entweder mit der Gegenfärbung von Nuclear Fast Red oder Alcian Blue fortfahren.
    3. Wischen Sie überschüssiges PBS ab und geben Sie 500 μl einer nuklearen Gegenfärbelösung von 0,1 % nuclear fastred 41 (Tabelle 1) über die Schnitte und inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 10 min. Tipp, um überschüssiges nukleares Rot zu entfernen und mit der Dehydrierung fortzufahren (Schritt 5.4.5).
    4. Tauchen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in 0,5%ige Alcianblau-Lösung (Knorpel-Gegenfärbung)42 ; In destilliertem Wasser abspülen und 10 min in 1%iger Phosphomolybdsäure inkubieren. Erneut mit Wasser abspülen und mit der Dehydrierung fortfahren.
      HINWEIS: Wenn die Phosphomolybdsäurewäsche weggelassen wird, wird Alcianblau zu einem nuklearen Gegenfleck.
    5. Dörren Sie in 70/95/100/100% Ethanol für jeweils 5 Minuten.
    6. Mit Xylol dreimal für jeweils 5 Minuten in einem Abzug waschen.
    7. Montage mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis und Glasabdeckgläsern.
    8. Lassen Sie die Dias mindestens 16 h in einem Abzug trocknen.

6. Bilderfassung

  1. Nachdem die montierten Objektträger gründlich getrocknet sind, untersuchen Sie alle Schnitte mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop auf das Vorhandensein transplantierter menschlicher Zellen (Abbildung 4E). Suchen Sie nach blau-violetten Alu-positiven Zellen (Abbildung 4F,G) und markieren Sie die Abschnitte mit Alu-positiven Zellen mit einem Markierungsstift (Abbildung 4E).
    HINWEIS: Das Markieren der Abschnitte mit Alu-positiven Zellen erleichtert das Auffinden beim Fotografieren und Vergleichen benachbarter Dias mit anderen Markierungen.
  2. Achten Sie darauf, die Schnitte, die das Xenotransplantat enthalten, in der gleichen Reihenfolge zu fotografieren, in der sie auf dem Objektträger platziert sind (antero-posteriore Richtung). Benennen Sie jedes Foto mit allen relevanten Informationen, wie z. B. [Datum des Xenotransplantats]_[Zelltyp]_[Embryonalalter]_[Sondentyp]_[Schnittnummer]_001. Fügen Sie Metadatendateien hinzu, um die Maßstabsleiste später hinzuzufügen.
  3. Wenn andere Objektträger aus derselben Serie mit einem anderen Marker gefärbt werden, z. B. RNA-in-situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie, fotografieren und benennen Sie benachbarte Abschnitte (Abbildung 6) auf die gleiche Weise.

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Ergebnisse

Identifizierung von Alu-positiven ADSCs in histologischen Schnitten
Alu-Sequenzen sind repetitive Elemente, die ~10% des menschlichen Genoms ausmachen und daher hervorragende Ziele für die artspezifische Identifizierung menschlicher Zellen darstellen43. Die In-situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden kann verwendet werden, um genomische Elemente in histologischen Schnitten zu identifizier...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1) stellt eine praktikable Option für das Screening des Verhaltens von Primärpopulationen menschlicher Zellen in vivo dar, wobei Hühnerembryonen als Modell verwendet werden. Diese Arbeit beschreibt die Bildung von Zellsphäroiden (Abbildung 2), die Transplantation des Sphäroids in den Hühnerembryo (Abbildung 3), die Verarbeitung von Proben und...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universidade Federal de Rio de Janeiro (UFRJ für J.B.), dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq für J.B.) und der Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ für J.B.). Wir danken T. Jaffredo (CNRS, Paris, Frankreich) für die Untersuchung Runx2 (Cbfa1). Der HNK1-Antikörper wurde von der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und von der University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242 USA, gepflegt wird. Wir danken V. Moura-Neto für die Gewährung des Zugangs zum Mikrotom und R. Lent für die Gewährung des Zugangs zum Mikroskop. Wir danken E. Steck für die Hilfe bei der Synthese von Alu-Sonden .

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Gallus gallus eggsGranja TolomeiSPF-freeWhite leghorn chicken
Reagents
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev primersSigma-aldrichOLIGO5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
Aluminum sulphateSigma-aldrich368458For Nuclear fast red solution preparation
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910Antibody Registry ID: AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 antibody (HNK1, CD57)Developmental Studies Hybridoma Bank3H5Antibody Registry ID: AB_2314644
Anti-mouse, goat IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2973Antibody Registry ID: AB_650513
Anti-mouse, goat IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Antibody Registry ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 antibodyDakoM085129Antibody Registry ID: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Aqueous mounting agent
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Blocking ReagentRoche11096176001
Citric acidVETEC238For SSC buffer preparation
Collagenase type IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt solution 50XInvitrogen750018For hybridization buffer preparation
Dextran sulphate sodium saltThermo Scientific15885118For hybridization buffer preparation
DIG RNA Labeling MixRoche11277073910Contains Dig-11-dUTP
DMEM low-glucoseSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056For NBT and BCIP solution preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-aldrichE6758For trypsin solution preparation
Entellan newMerck107961Non-aqueous mounting medium
EthanolProquímiosN/A
Fetal bovine serumThermoFisher12657029Inactivate at 56 °C before use
Formaldehyde 37% solutionProquímiosN/A
FormamideVetecV900064
Glacial acetic acidProquímiosN/A
India inkPelikan221143
L-glutamine solution (200 mM)Gibco25030-149
Magnesium chlorideMerck8147330100For NTM buffer preparation
Maleic acidSigma-aldrichM0375-500GFor MAB buffer preparation
MethanolProquímios
Normal Goat SerumSigma-aldrichNS02LInactivate at 56 °C before use
4-Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11585029001
Nuclear fast redSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicillin G sodium saltSigma-aldrichP3032
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-aldrichP3813
Phosphomolybdic acidMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
Salmon sperm DNAInvitrogen15632011For hybridization buffer preparation
Sodium chlorideSigma-aldrichS9888For SSC, MAB and NTM buffer preparation
Streptomycin SulfateSigma-aldrichS6501
Taq Polymerase kitCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquímiosN/A
Microscope and equipments
Axioplan upright microscopeCarl Zeiss MicroscopyN/A
Axiovision softwareCarl Zeiss MicroscopyN/A
Cell incubatorThermoForma3110
Egg incubator- 50 eggsGP
Gooseneck lampBiocamN/AFor egg manipulation
Fiji software; Cell Counter pluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminar flow hoodTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Rotary microtomeLeica BiosystemsRM2125 RTSFor sectioning
StereomicroscopeLabomedLuxeo 4DFor egg manipulation
Sterilization ovenREALIS7261690For sterelization of surgical materials
Consumables
0.2 mL (PCR) polypropylene centrifuge tubesEppendorf30124707
15 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430791
1.5 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-150-C
2 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-200-C
50 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μL sizeInvitrogenAM12655For egg manipulation
Excavated Glass Block (Staining Block) with Cover GlassHecht Karl42020010
Embedding cassettesSimportM480Used as a paraffin block holder
Glass coverslides, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Glass Pasteur pipettes 230 mmNORMAX5426023For preparation of glass capillaries
Microtome bladesLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818For sectioning
Parafilm MParafilmP7793
Plastic Petri dish, 30 mmKasviK13-0035For egg manipulation
Plastic Petri dish, 60 mmProlab0303-8For cell spheroids preparation. Should not be treated for cell adhesion. 
Silanized glass slides (Starfrost)Knittel Glass198For sectioning
Syringe 1 mL , Needles 26 G (0.45 x 13 mm)Descarpack32972For egg manipulation (albumen aspiration)
Surgical tools
Aspirator tubeDrummond2-000-000For egg manipulation
Dissection scissorsFine Science Tools14061-11For egg manipulation
Microforceps (tweezers)Fine Science Tools00108-11For egg manipulation and preparation of glass capillaries
Needle holder (adjustable dissection needle chuck)Fisherbrand8955For egg manipulation
Oil whetstone, 10.000 gritN/AN/AFor sharpening needles
Pair of small paint brushesN/AN/AFor handling paraffin sections. Any brand may be used.
Sewing needlesN/AN/AFor sharpening into microscalpels. Any brand may be used.
Sterile disposable scalpel No. 23Swann-Norton110For sectioning
Surgical scalpel handleSwann-Norton914For sectioning
Wecker iris scissors, sharp/sharpSurtexSS-641-11For egg manipulation

Referenzen

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