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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo per trapiantare e identificare sferoidi cellulari umani in embrioni di pollo. Questo modello di xenotrapianto utilizza il microambiente embrionale come fonte di segnali istruttivi per il saggio della migrazione, della differenziazione e del tropismo cellulare ed è particolarmente adatto per lo studio di popolazioni cellulari primarie e/o eterogenee.

Abstract

Gli xenotrapianti sono metodi preziosi per studiare il comportamento delle cellule umane in vivo. In particolare, l'ambiente embrionale fornisce spunti per la migrazione cellulare, la differenziazione e la morfogenesi, con segnali istruttivi unici e identità dello strato germinale che sono spesso assenti nei modelli di xenotrapianto adulto. Inoltre, i modelli embrionali non sono in grado di discriminare i tessuti self da quelli non-self, eliminando il rischio di rigetto del trapianto e la necessità di soppressione immunitaria dell'ospite. Questo articolo presenta una metodologia per il trapianto di sferoidi di cellule umane in embrioni di pollo, che sono accessibili, suscettibili di manipolazione e si sviluppano a 37 °C.

Gli sferoidi consentono la selezione di una regione specifica dell'embrione per il trapianto. Dopo essere state innestate, le cellule si integrano nel tessuto ospite, consentendo il follow-up della loro migrazione, crescita e differenziazione. Questo modello è sufficientemente flessibile da consentire l'utilizzo di diverse popolazioni aderenti, comprese le popolazioni eterogenee di cellule cellulari primarie e le cellule tumorali. Per aggirare la necessità di una preventiva marcatura cellulare, viene descritto anche un protocollo per l'identificazione delle cellule del donatore attraverso l'ibridazione di sonde Alu specifiche per l'uomo, che è particolarmente importante quando si studiano popolazioni cellulari eterogenee. Inoltre, le sonde di DNA possono essere facilmente adattate per identificare altre specie di donatori. Questo protocollo descriverà i metodi generali per la preparazione degli sferoidi, l'innesto in embrioni di pollo, il fissaggio e l'elaborazione dei tessuti per il sezionamento in paraffina e infine l'identificazione delle cellule umane utilizzando l'ibridazione del DNA in situ . Oltre ai limiti di questo metodo, verranno discussi i controlli suggeriti, gli esempi di interpretazione dei risultati e i vari comportamenti cellulari che possono essere analizzati.

Introduzione

Gli xenotrapianti sono strumenti utili per studiare il comportamento delle cellule umane in vivo. Questi modelli hanno fornito informazioni preziose per un'ampia gamma di argomenti scientifici, come la biologia delle cellule staminali umane1, l'osservazione di eventi cellulari in tempo reale2 e lo studio dell'angiogenesi tumorale e delle metastasi3. Inoltre, sono stati studiati diversi aspetti della biologia del cancro, tra cui la tumorigenesi di xenotrapianti paziente-specifici 4,5. Ognuno di questi modelli di xenotrapianto ha i suoi vantaggi e svantaggi e, quindi, ognuno è più adatto a specifiche domande scientifiche. Gli embrioni di pollo sono un modello popolare di biologia dello sviluppo in quanto sono un modello di amniote accessibile che è suscettibile di manipolazione chirurgica. Gli innesti eterologhi hanno permesso ai ricercatori di creare mappe precise del destino6 o di esplorare se un tratto è autonomo dalla cellula o istruito dall'ambiente 7,8. Un razionale simile consente di utilizzare l'embrione di pollo come modello di xenotrapianto per studiare il comportamento delle cellule umane.

L'ambiente embrionale orchestra attivamente la morfogenesi dei tessuti con segnali di migrazione e differenziazione, nonché le interazioni cellula-cellula. Pertanto, rispetto ai modelli di xenotrapianto adulto, l'embrione fornisce un ambiente più istruttivo per testare il comportamento delle cellule trapiantate, ad esempio, imitando i segnali presenti nelle nicchie di cellule staminali adulte (ad esempio, BMP, WNT, NOTCH e SHH9). Inoltre, l'assenza di un sistema immunitario adattativo durante lo sviluppo precoce consente di eseguire xenotrapianti senza il rischio di una risposta immunitaria o di rigetto del tessuto del donatore10. Studi precedenti hanno studiato xenotrapianti di cellule umane in embrioni di pollo per questo scopo. Il potenziale neurogeno delle cellule staminali umane è stato analizzato dopo l'iniezione nel tubo neurale o nei vasi sanguigni11 , oltre all'integrazione di cellule staminali embrionali12 e cellule staminali pluripotenti indotte13 nell'embrione. Le cellule di melanoma umano sono state studiate anche utilizzando l'ambiente embrionale del pulcino, che ha rivelato collegamenti tra la loro tumorigenesi e il comportamento delle cellule della cresta neurale14, nonché la riprogrammazione delle cellule tumorali con le informazioni provenienti dall'embrione15. Questo articolo descrive un protocollo particolarmente adatto per studiare il comportamento di popolazioni cellulari primarie ed eterogenee umane.

Negli ultimi decenni, la componente stromale di diversi tessuti è stata studiata come fonte autologa di cellule progenitrici/staminali e per le sue proprietà proangiogeniche e immunoregolatorie, precedentemente note come "cellule staminali mesenchimali"16,17,18. La prima di queste popolazioni cellulari ad essere caratterizzata è stata la popolazione di cellule stromali/staminali del midollo osseo (BMSC), che hanno un potenziale osteo-, adipo- e, in misura minore, condrogenico in vivo19,20. Le cellule stromali di derivazione adiposa (ADSC) sono una popolazione eterogenea ottenuta mediante digestione enzimatica dei campioni di lipoaspirato o dermolipectomia, seguita dall'isolamento della frazione stromale-vascolare (SVF) e infine dall'espansione in coltura21. In coltura, queste cellule sono fenotipicamente caratterizzate da marcatori condivisi con altre popolazioni mesenchimali, come CD90, CD73, CD105 e CD44, marcatori unici come CD36 e dall'assenza di marcatori ematopoietici (CD45) o endoteliali (CD31)22. Inoltre, le ADSC hanno un potenziale osteo-, adipogenico e condrogenico in vitro e il numero di cellule staminali/progenitrici in questa popolazione può essere definito dal saggio22 dell'unità formante colonie fibroblastoidi (CFU-F). In vivo, è stata segnalata l'esistenza di cellule con fenotipo ADSC nei compartimenti stromali23 e/o perivascolari24. Sta diventando sempre più chiaro che, nonostante condividano marcatori dopo la coltura in vitro, il compartimento stromale di diversi tessuti riflette le caratteristiche intrinseche di un dato organo e queste popolazioni cellulari hanno proprietà distinte a seconda della loro fonte 17,25,26,27. Inoltre, poiché queste cellule vengono isolate in base alla loro adesione a un piatto di coltura cellulare, possono essere composte da cellule provenienti da diversi strati germinali28. Pertanto, l'impiego di un metodo di xenotrapianto per studiare il potenziale di differenziazione e il tropismo delle cellule stromali in modo imparziale può fornire informazioni preziose su queste popolazioni cellulari per guidare lo sviluppo di future terapie cellulari.

Il protocollo qui descritto (Figura 1) è un metodo di xenotrapianto che sfrutta il basso costo e la facilità di manipolazione degli embrioni di pollo. È stato precedentemente utilizzato per studiare il comportamento dell'ADSC29 umano, dei fibroblasti cutanei29, delle cellule stromali derivate dal sangue mestruale30 e delle cellule di glioblastoma31. Questo metodo includerà il trapianto di cellule come sferoidi32, che possono essere preparati da qualsiasi popolazione di cellule aderenti (Figura 2). Verranno inoltre descritte le procedure chirurgiche e la preparazione di materiali chirurgici personalizzati, i microbisturi e i capillari in vetro (Figura 3). Le cellule umane vengono rilevate nelle sezioni istologiche ibridando sonde Alu specifiche per l'uomo (Figura 4), eliminando così la necessità di una marcatura preventiva delle cellule innestate. I risultati rappresentativi descrivono il comportamento delle ADSC umane innestate sia nella regione somitica a livello della gemma alare (Figura 5, Figura 6 e Figura 7) che del primo arco faringeo (Figura 8), sia degli sferoidi di glioblastoma primario umano innestati nel prosencefalo (Figura 8). Verranno descritte la migrazione cellulare, la differenziazione e l'interazione con i tessuti embrionali di pollo, nonché saggi suggeriti per indagare ulteriormente il comportamento cellulare utilizzando la co-colorazione o la colorazione di sezioni adiacenti.

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Protocollo

Tutte le procedure in vivo utilizzate in questo studio sono state conformi a tutte le linee guida sperimentali pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali, in conformità con le linee guida brasiliane sull'uso sperimentale degli animali (L11794). I protocolli utilizzati per la manipolazione degli embrioni di pollo sono stati tutti approvati dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali nella Sperimentazione Scientifica (Centro di Scienze della Salute dell'Università Federale di Rio de Janeiro). L'utilizzo di cellule umane è stato approvato dal Comitato Etico dell'Azienda Ospedaliera Universitaria Clementino Fraga Filho (numeri 043/09 e 088/04). Sono state utilizzate uova prive di patogeni specifici (SPF) di gallina livornese bianca (Gallus gallus).

1. Preparazione degli sferoidi cellulari

NOTA: Gli sferoidi cellulari possono essere preparati con un'ampia gamma di tipi di cellule, purché siano aderenti. Per questo protocollo, sono state isolate cellule stromali umane di derivazione adiposa (ADSC) come descritto in precedenza,verranno utilizzate 21,27 (Figura 2A). Le cellule sono state ottenute digerendo frammenti di tessuto adiposo o lipoaspirati con collagenasi IA per 1 ora a 37 °C sotto agitazione, seguita da piastratura a 1−2 × 104 cellule/cm2 e incubazione notturna. Le cellule non aderenti sono state scartate e le cellule aderenti sono state espanse per 3-6 passaggi. Le ADSC erano omogenee per l'espressione degli antigeni di superficie CD105, CD90, CD13 e CD44 e negative per gli antigeni ematopoietici CD45, CD14, CD34, CD3 e CD1927. Sebbene il metodo qui descritto possa essere eseguito facilmente con materiali minimi oltre a quelli utilizzati abitualmente per la coltura cellulare, il tempo di aggregazione ottimale e la necessità di dissociazione parziale dovrebbero essere determinati empiricamente. Possono essere impiegati metodi alternativi per la preparazione di sferoidi cellulari, come il metodo della goccia sospesa33 o i pozzetti rivestiti di agarosio34; Vedi la discussione per maggiori dettagli. Tutte le procedure devono essere eseguite su un banco pulito utilizzando tecniche asettiche.

  1. Riscaldare la PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato), il terreno di coltura e la soluzione di tripsina a 37 °C prima della manipolazione cellulare.
  2. ADSC di coltura in DMEM a basso contenuto di glucosio integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Utilizzare un pallone confluente da 25 cm2 di ADSC per la preparazione di due piastre di sferoidi. Eliminare il terreno di coltura e lavare la piastra di coltura tre volte con una quantità appropriata di PBS sterile (5 ml di PBS per ogni lavaggio se si utilizza un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 ).
  3. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di tripsina (contenente 0,78 mM di EDTA) per coprire le cellule (1 mL di soluzione di tripsina se si utilizza un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 ) e lasciare riposare il pallone per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Pipettare delicatamente le cellule su e giù per dissociarle. Aggiungere la stessa quantità di terreno di coltura contenente FBS per inattivare la tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  5. Centrifugare per 10 min a 180 × g. Eliminare il surnatante e picchiettare il tubo per allentare il pellet.
  6. Risospendere le cellule in 500 μL-2 mL di terreno di coltura adeguato al tipo di cellula (vedere punto 1.2).
    NOTA: La concentrazione minima è di 5 × 105 cellule/mL per le cellule aderenti come ADSC e fibroblasti. Un pallone confluente di 25 cm2 di ADSC deve essere risospeso in 2 mL di terreno e impiattato in 2 piastre di Petri, utilizzando 1 mL ciascuna. Le cellule meno aderenti, come la glia, possono trarre beneficio dalla placcatura a ~2 × 106 cellule/mL in un volume inferiore.
  7. Trasferire con cautela la sospensione cellulare su un lato di una piastra di Petri sterile da 60 mm (non rivestita e non trattata, come quelle utilizzate per la preparazione delle piastre di agar). Cercare di limitare il terreno di coltura alla più piccola area possibile (Figura 1B) appoggiando il piatto su un pezzo di garza piegata e pulita per mantenerlo inclinato nell'incubatrice.
  8. Incubare la sospensione cellulare a 37 °C, 5% CO2, fino alla formazione di aggregati cellulari (6-8 ore dopo la placcatura delle ADSC).
    NOTA: Il tempo di aggregazione degli sferoidi può variare in base al tipo di cellula.
  9. Se necessario (vedere la discussione), dissociare parzialmente gli aggregati di grandi cellule pipettando delicatamente su e giù utilizzando puntali da 1000 μl. Dissociare gli sferoidi ADSC 6-8 ore dopo la placcatura.
  10. Posizionare la piastra nell'incubatrice fino a quando gli sferoidi non sono pronti per essere trapiantati: rotondi con bordi definiti e non facilmente dispersi (Figura 1C,D).
    NOTA: Gli sferoidi ADSC sono pronti 2 giorni dopo la dissociazione parziale.

2. Trapianto di sferoidi in embrioni di pollo

  1. Preparazione
    1. Preparare le uova di gallina incubando 15-30 uova in un'incubatrice umida a 37,5 °C fino a raggiungere lo stadio di Hamburger-Hamilton (HH) desiderato35: 40-45 h per gli innesti in somiti a livello delle gemme degli arti (HH11-12 o 13-19 somiti) o 29-33 h per gli innesti nella regione cefalica (HH8-9 o 5-8 somiti). Posizionare le uova orizzontalmente e tracciare una linea con una matita sulla parte superiore delle uova prima dell'incubazione (Figura 3D).
      NOTA: I tempi di incubazione possono variare leggermente a seconda delle singole incubatrici. Tracciare una linea assicurerà che la parte superiore dell'uovo, dove si trova l'embrione, possa essere facilmente identificata se l'uovo viene ruotato prima dell'esperimento.
    2. Preparare aghi affilati ("microbisturi") attaccando un ago da cucito a un portaaghi in metallo (Figura 3B). Usando una pietra per affilare oliata, affila l'ago fino a farlo assomigliare a un piccolo bisturi con un bordo sottile (Figura 3C). In alternativa, preparare un ago di tungsteno affilato mediante elettrolisi36.
    3. Preparare i capillari di vetro utilizzando la fiamma di un bruciatore Bunsen per sciogliere brevemente la parte sottile di una pipetta di vetro Pasteur. Togliete la parte fusa dalle fiamme e allungatela fino a formare un sottile capillare. Dividere accuratamente il capillare in due parti rompendolo con una micropinza. Preparare un capillare sottile per l'iniezione di inchiostro di china e un capillare spesso per il trasferimento degli sferoidi (Figura 3B).
      NOTA: Variando la forza di trazione, è possibile creare diversi capillari. I capillari devono essere preparati appena prima dell'intervento.
    4. Preparare la superficie di lavoro e altri materiali per la manipolazione delle uova (Figura 3A). Sterilizzare tutto il materiale chirurgico in un forno a 100 °C per una notte o con etanolo al 70% immediatamente prima dell'uso. PBS sterile caldo a 37 °C. Collegare una punta da 200 μl (con barriera) al gruppo del tubo di aspirazione per l'iniezione di inchiostro di china e il trasferimento degli sferoidi.
      NOTA: Utilizzare punte con barriere durante il trasferimento di sferoidi di cellule umane.
    5. Poco prima dell'esperimento, aggiungere 2 gocce di soluzione madre di inchiostro di china alla piastra di Petri da 30 mm e mescolarla con 1 ml di PBS sterile. Rimuovi la piastra sferoidale dall'incubatrice e posizionala sopra una ghiacciaia per il resto dell'esperimento.
  2. Preparazione di ogni uovo
    1. Togliete un uovo dall'incubatrice e posizionatelo sopra un portauova. Praticare un piccolo foro nell'estremità affilata dell'uovo (Figura 2D) e aspirare 1,5 mL di albume utilizzando una siringa e un ago. Inserire l'ago perpendicolarmente all'uovo per evitare di danneggiare il tuorlo d'uovo. Sigillare il foro con del nastro adesivo. Facoltativamente, ripetere questo passaggio per tutte le uova prima dell'esperimento e incubare nuovamente il resto delle uova.
    2. Tagliare con cautela una finestra sulla parte superiore dell'uovo usando le forbici (Figura 3D). Usando la pipetta, aggiungere 1-2 gocce di PBS sul tuorlo. Se necessario, rimuovere le bolle di albume di grandi dimensioni (come quelle mostrate nella Figura 3F) utilizzando la pipetta.
    3. Fissare il capillare sottile al gruppo del tubo di aspirazione. Riempire parzialmente il capillare di vetro con la soluzione di inchiostro di china per aspirazione. Iniettare una quantità sufficiente di inchiostro di china nel tuorlo sotto l'embrione fino a quando non si vedono le strutture embrionali (Figura 3E, F).
    4. Usando lo stereomicroscopio, contare il numero di somiti (Figura 4A). Numerare individualmente le uova usando una matita (Figura 4B).
  3. Trapianto di sferoidi
    1. Identificare la regione dell'innesto: mesoderma parassiale a livello della gemma alare (mesoderma presomitico dei presunti somitidal 15° al 20° 3 7) (Figura 3G e Figura 5A) o presunta regione del primo arco faringeo (tra l'ectoderma e l'endoderma lateralmente al mesencefalo posteriore/primo rombomero38) (Figura 8A).
    2. Tagliare la membrana vitellina sulla regione target utilizzando un microbisturi.
    3. Utilizzando un paio di microbisturi, praticare un taglio superficiale nella regione in cui verrà impiantato lo sferoide (Figura 3H).
      NOTA: Evitare di danneggiare l'endoderma sottostante; In caso contrario, il tuorlo perderà (se ciò accade, scartare l'uovo).
    4. Rimuovere il capillare sottile dall'aspiratore e sostituirlo con il capillare spesso. Osservate gli sferoidi allo stereomicroscopio e scegliete uno sferoide approssimativamente della stessa dimensione del somite (Figura 2D). Aspirare questo sferoide nel capillare.
    5. Depositare delicatamente lo sferoide vicino alla regione tagliata (Figura 3H). Usando gli aghi affilati, spingere lo sferoide nella regione tagliata (Figura 3I, J).
    6. Aggiungere 1-2 gocce di PBS sull'embrione utilizzando la pipetta per assicurarsi che lo sferoide sia inserito saldamente.
      NOTA: Se l'innesto viene spostato, è necessario trapiantare un nuovo sferoide (passaggi 2.3.4 e 2.3.5).
    7. Pulisci eventuali perdite di albumina dal guscio dell'uovo utilizzando carta velina per assicurarti che l'uovo possa essere completamente sigillato, evitando contaminazioni. Sigilla la finestra nell'uovo usando del nastro adesivo.
    8. Prendere nota della regione innestata (Figura 4A). Rimettere con cura l'uovo nell'incubatrice umida a 37,5 °C per evitare di spostare lo sferoide inserito.
    9. Incubare l'uovo fino allo stadio desiderato.
      NOTA: Quando lo xenotrapianto viene eseguito nei somiti a livello delle gemme degli arti, la migrazione e la morte cellulare sono state analizzate con successo in embrioni di 3,5 giorni (HH21) e la differenziazione cellulare e il tropismo sono stati osservati in embrioni di 6 giorni (HH29) (Figura 5A). L'integrazione nei tessuti dell'ospite è stata eseguita anche in embrioni di 8 giorni di età (HH33). Le cellule del donatore innestate nel territorio dell'arco faringeo sono state studiate in embrioni di 4,5 giorni (HH25) (Figura 8A).

3. Dissezione tissutale, fissazione, elaborazione e preparazione di sezioni istologiche

  1. Dissezione e fissazione
    1. Preparare il fissativo (almeno 1 ml/embrione): etanolo 100%-formaldeide 37%-acido acetico glaciale in rapporto 6:3:1. Pulisci il piano di lavoro, un paio di micropinze, forbici chirurgiche o forbici per l'iride e una schiumarola. Riempire una capsula di Petri in vetro da 60 mm con PBS freddo e metterla sotto uno stereomicroscopio.
    2. Aprire l'uovo ritagliando il nastro adesivo.
    3. Taglia le membrane intorno all'embrione e rimuovilo usando la schiumarola.
    4. Trasferire l'embrione nella capsula di Petri. Se l'embrione ha 5 giorni (HH26) o più, decapitarlo prontamente prima di qualsiasi manipolazione ex ovo.
    5. Rimuovere eventuali membrane rimanenti utilizzando micropinze e forbici. Agitare delicatamente il campione in PBS per lavare via eventuali goccioline di tuorlo rimanenti.
    6. Se lo xenotrapianto è stato eseguito a livello dell'ala, scartare la testa. Se le cellule sono state innestate nella regione cefalica, tagliare e scartare la metà inferiore del corpo, assicurandosi che la regione cardiaca sia mantenuta intatta.
    7. Trasferire ciascun campione in una provetta separata da 2,0 mL contenente 1 mL di fissativo. Identificare i tubi singolarmente come prima (Figura 4B). Incubarli per una notte a 4 °C con agitazione.
    8. Utilizzare un pellet di celle o sferoidi (Figura 4F) come controllo positivo. A tal fine, centrifugare una sospensione cellulare (fase 1.5) o sferoidi cellulari (fase 1.10) a 180 × g per 10 minuti in una provetta da 1,5 mL, scartare il terreno di coltura e aggiungere 1 mL di fissativo senza disturbare il pellet. Incubare la provetta per una notte a 4 °C senza agitazione e procedere come per i campioni di pollo.
  2. Disidratazione e inclusione
    1. Disidratare gli embrioni mediante lavaggi successivi di 1 mL di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% in 1x PBS per almeno 1 ora ciascuno con agitazione.
    2. Incubare i campioni per una notte in 1 mL di etanolo al 100% a temperatura ambiente con agitazione.
    3. Incubare i campioni in 1 mL di xilene al 100% per 1 ora in una cappa aspirante. Ripeti altre due volte.
    4. Trasferire il contenuto della provetta nel blocco colorante ed eliminare lo xilene. Aggiungere abbastanza paraffina fusa per coprire l'embrione e coprire il blocco colorante con il suo coperchio di vetro. Incubare per una notte in forno a 65 °C.
    5. Preparare una piastra calda e uno stampo per blocchi di paraffina per l'inclusione.
      NOTA: Un paio di graffette allungate sono utili per posizionare l'embrione.
    6. Riempi lo stampo con paraffina fusa e trasferisci l'embrione su di esso. Posizionare l'embrione per ottenere una sezione trasversale del tronco (Figura 5A) o una sezione coronale della testa (Figura 8A).
    7. Inserire una targhetta di carta nella paraffina, di fronte alla superficie da sezionare, per aiutare a tagliare l'embrione nel corretto orientamento (Figura 4C).
    8. Se utilizzata, posizionare la cassetta di inclusione sopra il campione. Lasciare raffreddare completamente il blocco prima di rimuoverlo dallo stampo. In alternativa, fissare il blocco di paraffina indurito alla cassetta o a un altro supporto del blocco utilizzando paraffina fusa e lasciarlo raffreddare di nuovo.
  3. Taglio
    1. Preparare i materiali per il sezionamento. Riscaldare una piastra calda a 42 °C e coprire una piastra di cartone o polistirolo con un foglio di alluminio pulito di circa 30 cm x 20 cm. Pulire tutte le superfici prima dell'uso.
      NOTA: Utilizzare guanti per evitare la contaminazione con nucleasi, soprattutto se alcune sezioni verranno utilizzate per l'ibridazione dell'RNA in situ . Evitare l'uso di un bagno istologico per allungare le sezioni di paraffina per lo stesso motivo, a meno che l'acqua e le superfici non possano essere pulite accuratamente in anticipo.
    2. Tagliare la paraffina in eccesso con una lama per microtomo. Creare uno smusso su entrambi i lati, di forma trapezoidale, per una facile separazione di ogni sezione utilizzando una lama di bisturi in un passaggio successivo (Figura 3A).
    3. Attacca il blocco al microtomo. Posizionare il blocco con attenzione per assicurarsi che i lati sinistro e destro siano paralleli tra loro. Eseguire una regolazione più precisa dopo aver tagliato alcune sezioni del campione e averle osservate al microscopio.
    4. Quando la regione target è stata raggiunta (la gemma dell'arto o il primo arco faringeo), tagliare sezioni di 7 μm e posizionare i nastri di paraffina sopra la piastra ricoperta con un foglio di alluminio. Sezionare l'intera regione target (Figura 4C).
    5. Per la preparazione di sezioni seriali, coprire il numero adeguato di vetrini con gocce di acqua deionizzata sterile. Trasferisci le singole sezioni sulle diapositive in sequenza, utilizzando spazzole e bisturi. Trasferisci le sezioni adiacenti su diapositive diverse per creare sezioni seriali (Figura 4D). Preparare una serie di 3 vetrini per i bambini di 3,5 giorni, 4 vetrini per i bambini di 4,5 giorni e 5 vetrini per gli embrioni di 6 giorni. Colorare le sezioni adiacenti con diverse sonde, anticorpi o colorazioni istologiche classiche.
      NOTA: La stessa serie può contenere più vetrini adiacenti se viene sezionata una grande porzione dell'embrione. È possibile trasferire più sezioni su ciascuna diapositiva, mantenendo un po' di spazio tra le sezioni per consentirne l'allungamento. Non posizionare ancora il vetrino sulla piastra calda.
    6. Dopo che tutte le sezioni sono state trasferite sugli scivoli, aggiungere altra acqua fino a quando tutte le sezioni galleggiano su una singola goccia d'acqua. Posiziona il vetrino su un piatto caldo e lascia che le sezioni si allunghino. Rimuovere il vetrino dalla piastra calda e rimuovere l'acqua inclinando con cautela il vetro del vetrino contro la carta velina.
      NOTA: Non lasciare che le sezioni tocchino direttamente lo scivolo di vetro prima che si allunghino.
    7. Lasciare asciugare i vetrini per una notte in un'incubatrice a 37 °C.

4. Sintesi di sonde in alluminio marcate con digossigenina mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)

  1. Preparare una soluzione madre dei seguenti primer specifici per l'uomo39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' e AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Preparare 50 μl della seguente reazione PCR40: 1x tampone PCR, 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dATP, 0,065 mM dTTP, 0,035 mM dig-11-dUTP, 0,4 μM AluFw primers, 0,4 μM AluRev primers, 0,05 U/μL Taq polimerasi e 1 ng/μL di DNA genomico umano.
  3. Eseguire la PCR utilizzando le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale a 94 °C per 4 minuti seguita da 40 cicli di 94 °C per 20 s, 60 °C per 20 s e 72 °C per 20 s, seguita da una denaturazione finale di 72 °C per 5 min.
  4. Misurare la concentrazione della sonda utilizzando uno spettrofotometro. Conservare le sonde a -20 °C.
    NOTA: Il prodotto della PCR deve essere 200-300 bp molto tempo dopo l'elettroforesi in un gel di agarosioal 2% 29.

5. Ibridazione in situ di sezioni con sonde in alluminio

  1. Giorno 1: Permeabilizzazione e ibridazione
    NOTA: È necessario utilizzare un barattolo di vetro scorrevole sterilizzato per tutti i passaggi eseguiti il giorno 1.
    1. Preriscaldare una lavata di PBT (0,1% Tween 20 in PBS) a bagnomaria a 37 °C e preparare una camera umida con il 50% di formammide e il 50% di acqua deionizzata.
      NOTA: Calcolare il volume di tutti i lavaggi in base alle dimensioni del barattolo di vetro. Se non diversamente specificato, tutti i lavaggi vengono eseguiti per immersione dei vetrini nella soluzione.
    2. Rimuovere la paraffina con tre lavaggi successivi in xilene, 5 minuti ciascuno, in una cappa aspirante.
    3. Reidratare la serie con due lavaggi in etanolo al 100% per 5 minuti ciascuno, seguiti da lavaggi con etanolo al 90/70/30% in PBS per 2 minuti ciascuno.
    4. Lavare in PBT (0,1% Tween 20 in PBS) tre volte per 5 minuti ciascuna.
    5. Per la permeabilizzazione, aggiungere 2 μg/mL di proteinasi K al PBT preriscaldato, immergere i vetrini nella soluzione e incubarli per 14 minuti in un bagno d'acqua a 37 °C.
    6. Fissare le sezioni per immersione in paraformaldeide/PBS al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
    7. Lavare con PBS per 5 min.
    8. Dopo aver rimosso l'eccesso di PBS da ciascun vetrino, coprire le sezioni con 300 μL di tampone di ibridazione (50% di formammide deionizzata, 4x SSC pH 5.0, 1x soluzione di Denhardt, 5% destrano solfato, 100 μg/mL di DNA spermatico di salmone) (Tabella 1). Incubare per 1 ora a 42 °C nella camera di formammide.
    9. Preparare una soluzione di sonda Alu 0,2 ng/mL in tampone di ibridazione. Inclinare il vetrino per rimuovere il tampone di ibridazione e aggiungere 120 μl della soluzione della sonda Alu sulle sezioni. Coprire con un vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non formare bolle.
      NOTA: Il parafilm non deve essere utilizzato per coprire i vetrini in questa fase, poiché si scioglierà a temperature superiori a 70 °C.
    10. Scaldare i vetrini su una piastra calda a 95 °C per 5 minuti.
      NOTA: Non respirare i fumi della formammide.
    11. Incubare i vetrini a 42 °C nella camera di formamide per una notte.
  2. Giorno 2: Lavaggi di rigore e immunoistochimica
    1. Preparare 20 tamponi SSC (NaCl 3 M, citrato di sodio 0,3 M, pH 7,5) (Tabella 1). Preriscaldare due lavaggi di tampone salino citrato di sodio (SSC) 0,1x, pH 7,5, a 42 °C.
    2. Riempire un barattolo di vetro scorrevole con 2 tamponi SSC, pH 7,5. Posizionare delicatamente i vetrini nella soluzione e attendere che i vetrini coprioggetti si stacchino da soli. Rimuovere i vetrini coprioggetti utilizzando una pinza e incubare i vetrini in 2 tamponi SSC per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Rilavare i vetrini con 2 tamponi SSC, pH 7,5, per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Lavare i vetrini due volte con tampone SSC 0,1x, pH 7,5, a 42 °C per 5 minuti ciascuno.
    5. Lavare i vetrini due volte con MABT (tampone di acido maleico con Tween; 0,1 M di acido maleico, 0,15 M di cloruro di sodio, 0,1% Tween 20, pH 7,5) (Tabella 1) per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
    6. Eliminare il tampone in eccesso da ciascun vetrino e coprire le sezioni con 400 μL di soluzione bloccante (10% siero normale di capra inattivato, 2% reagente bloccante in MABT). Incubare per 2 ore in camera umida (preparata con acqua deionizzata) a temperatura ambiente.
    7. Inclinare i vetrini per rimuovere il liquido e aggiungere 150 μl di frammenti Fab anti-DIG coniugati alla fosfatasi alcalina a una diluizione 1:2.000 in soluzione bloccante. Coprire con un vetrino coprioggetti o una parapellicola e incubare nella camera umida a 4 °C per 16 ore.
  3. Giorno 3: Sviluppo del colore
    1. Rimuovere delicatamente i vetrini coprioggetti o il parafilm all'interno di un barattolo con MABT (come al punto 5.2.2) e incubare i vetrini in MABT per 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Lavare con MABT altre tre volte per 30 minuti ciascuna.
    3. Lavare con MAB (tampone acido maleico; 0,1 M di acido maleico, 0,15 M di cloruro di sodio, pH 7,5) (Tabella 1) per 30 min.
    4. Lavare due volte con tampone NTM (NaCl-Tris-MgCl2 ; 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM di cloruro di sodio, 50 mM di cloruro di magnesio) (Tabella 1) per 10 minuti ciascuna.
    5. Aggiungere la soluzione colorante (0,45 μL/mL di cloruro di 4-nitro blu tetrazolio, 3,5 μL/mL di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina in NTM) (Tabella 1) nel barattolo di colorazione e immergere i vetrini nella soluzione. Coprite il barattolo con un foglio di alluminio e lasciate che il colore si sviluppi per una notte a 37 °C.
  4. Giorno 4: Controcolorazione e montaggio
    1. Lavare i vetrini tre volte con PBS a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno.
      NOTA: Assicurarsi che la soluzione colorante sia smaltita correttamente come rifiuto alogeno.
    2. Montare i vetrini così come sono aggiungendo gocce di un mezzo di montaggio acquoso e coprendo le sezioni con un vetrino coprioggetti. In alternativa, procedere alla controcolorazione nucleare rapida rossa o blu alciana.
    3. Eliminare l'eccesso di PBS e aggiungere 500 μl di una soluzione di controcolorazione nucleare allo 0,1% di rosso nucleare rapido41 (Tabella 1) sulle sezioni e incubare i vetrini in una camera umida per 10 minuti. Suggerimento per rimuovere l'eccesso di rosso nucleare veloce e procedere alla disidratazione (passaggio 5.4.5).
    4. Immergere le sezioni in soluzione di blu di Alcia allo 0,5% (controcolorante di cartilagine)42 per 10 min; Sciacquare in acqua distillata e incubare in acido fosfomolibdico all'1% per 10 minuti. Risciacquare nuovamente con acqua e procedere alla disidratazione.
      NOTA: Se il lavaggio con acido fosfomolibdico viene omesso, il blu di Alcian diventa una controcolorazione nucleare.
    5. Disidratare in etanolo 70/95/100/100% per 5 min ciascuno.
    6. Lavare con xilene tre volte per 5 minuti ogni volta in una cappa aspirante.
    7. Montare con un mezzo di montaggio a base di xilene e vetrini coprioggetti.
    8. Lasciare asciugare i vetrini per almeno 16 ore in una cappa aspirante.

6. Acquisizione delle immagini

  1. Dopo che i vetrini montati sono stati completamente asciugati, esaminare tutte le sezioni per la presenza di cellule umane innestate utilizzando un microscopio verticale a campo chiaro (Figura 4E). Cerca le celle Alu-positive blu-viola (Figura 4F, G) e contrassegna le sezioni contenenti celle Alu-positive usando un pennarello (Figura 4E).
    NOTA: Contrassegnare le sezioni con celle Alu-positive renderà più facile trovarle mentre le si fotografa e si confrontano vetrini adiacenti macchiati con altri marcatori.
  2. Fare attenzione a fotografare le sezioni contenenti lo xenotrapianto nello stesso ordine in cui sono state posizionate sul vetrino (direzione antero-posteriore). Nomina ogni foto con tutte le informazioni pertinenti, come [data dello xenotrapianto]_[tipo di cellula]_[età embrionale]_[tipo di sonda]_[numero di sezione]_001. Includi i file di metadati per aggiungere la barra di scala in un secondo momento.
  3. Se altri vetrini della stessa serie sono colorati con un altro marcatore, ad esempio ibridazione in situ dell'RNA o immunoistochimica, fotografare e denominare le sezioni adiacenti (Figura 6) allo stesso modo.

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Risultati

Identificazione di ADSC Alu-positive nelle sezioni istologiche
Le sequenze Alu sono elementi ripetitivi che comprendono ~10% del genoma umano e quindi sono ottimi bersagli per identificare le cellule umane in modo specie-specifico43. L'ibridazione in situ con sonde di DNA può essere utilizzata per identificare elementi genomici su sezioni istologiche, comprese le cellule umane prima...

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Discussione

Il protocollo qui descritto (Figura 1) presenta un'opzione fattibile per lo screening del comportamento di popolazioni primarie di cellule umane in vivo, utilizzando embrioni di pollo come modello. Questo articolo descrive la formazione di sferoidi cellulari (Figura 2), il trapianto dello sferoide nell'embrione di pollo (Figura 3), l'elaborazione dei campioni e l'ibridazione in situ

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Universidade Federal de Rio de Janeiro (UFRJ per J.B.), dal Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq per J.B.) e dalla Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ per J.B.). Ringraziamo T. Jaffredo (CNRS, Parigi, Francia) per la sonda Runx2 (Cbfa1). L'anticorpo HNK1 è stato ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppata sotto l'egida del NICHD e gestita dall'Università dell'Iowa, Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA 52242 USA. Ringraziamo V. Moura-Neto per aver concesso l'accesso al microtomo e R. Lent per aver concesso l'accesso al microscopio. Ringraziamo E. Steck per l'aiuto nella sintesi delle sonde Alu .

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Gallus gallus eggsGranja TolomeiSPF-freeWhite leghorn chicken
Reagents
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev primersSigma-aldrichOLIGO5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
Aluminum sulphateSigma-aldrich368458For Nuclear fast red solution preparation
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910Antibody Registry ID: AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 antibody (HNK1, CD57)Developmental Studies Hybridoma Bank3H5Antibody Registry ID: AB_2314644
Anti-mouse, goat IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2973Antibody Registry ID: AB_650513
Anti-mouse, goat IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Antibody Registry ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 antibodyDakoM085129Antibody Registry ID: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Aqueous mounting agent
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Blocking ReagentRoche11096176001
Citric acidVETEC238For SSC buffer preparation
Collagenase type IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt solution 50XInvitrogen750018For hybridization buffer preparation
Dextran sulphate sodium saltThermo Scientific15885118For hybridization buffer preparation
DIG RNA Labeling MixRoche11277073910Contains Dig-11-dUTP
DMEM low-glucoseSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056For NBT and BCIP solution preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-aldrichE6758For trypsin solution preparation
Entellan newMerck107961Non-aqueous mounting medium
EthanolProquímiosN/A
Fetal bovine serumThermoFisher12657029Inactivate at 56 °C before use
Formaldehyde 37% solutionProquímiosN/A
FormamideVetecV900064
Glacial acetic acidProquímiosN/A
India inkPelikan221143
L-glutamine solution (200 mM)Gibco25030-149
Magnesium chlorideMerck8147330100For NTM buffer preparation
Maleic acidSigma-aldrichM0375-500GFor MAB buffer preparation
MethanolProquímios
Normal Goat SerumSigma-aldrichNS02LInactivate at 56 °C before use
4-Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11585029001
Nuclear fast redSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicillin G sodium saltSigma-aldrichP3032
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-aldrichP3813
Phosphomolybdic acidMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
Salmon sperm DNAInvitrogen15632011For hybridization buffer preparation
Sodium chlorideSigma-aldrichS9888For SSC, MAB and NTM buffer preparation
Streptomycin SulfateSigma-aldrichS6501
Taq Polymerase kitCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquímiosN/A
Microscope and equipments
Axioplan upright microscopeCarl Zeiss MicroscopyN/A
Axiovision softwareCarl Zeiss MicroscopyN/A
Cell incubatorThermoForma3110
Egg incubator- 50 eggsGP
Gooseneck lampBiocamN/AFor egg manipulation
Fiji software; Cell Counter pluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminar flow hoodTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Rotary microtomeLeica BiosystemsRM2125 RTSFor sectioning
StereomicroscopeLabomedLuxeo 4DFor egg manipulation
Sterilization ovenREALIS7261690For sterelization of surgical materials
Consumables
0.2 mL (PCR) polypropylene centrifuge tubesEppendorf30124707
15 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430791
1.5 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-150-C
2 mL polypropylene centrifuge tubesAxygenMCT-200-C
50 mL polypropylene conical centrifuge tubesCorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μL sizeInvitrogenAM12655For egg manipulation
Excavated Glass Block (Staining Block) with Cover GlassHecht Karl42020010
Embedding cassettesSimportM480Used as a paraffin block holder
Glass coverslides, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Glass Pasteur pipettes 230 mmNORMAX5426023For preparation of glass capillaries
Microtome bladesLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818For sectioning
Parafilm MParafilmP7793
Plastic Petri dish, 30 mmKasviK13-0035For egg manipulation
Plastic Petri dish, 60 mmProlab0303-8For cell spheroids preparation. Should not be treated for cell adhesion. 
Silanized glass slides (Starfrost)Knittel Glass198For sectioning
Syringe 1 mL , Needles 26 G (0.45 x 13 mm)Descarpack32972For egg manipulation (albumen aspiration)
Surgical tools
Aspirator tubeDrummond2-000-000For egg manipulation
Dissection scissorsFine Science Tools14061-11For egg manipulation
Microforceps (tweezers)Fine Science Tools00108-11For egg manipulation and preparation of glass capillaries
Needle holder (adjustable dissection needle chuck)Fisherbrand8955For egg manipulation
Oil whetstone, 10.000 gritN/AN/AFor sharpening needles
Pair of small paint brushesN/AN/AFor handling paraffin sections. Any brand may be used.
Sewing needlesN/AN/AFor sharpening into microscalpels. Any brand may be used.
Sterile disposable scalpel No. 23Swann-Norton110For sectioning
Surgical scalpel handleSwann-Norton914For sectioning
Wecker iris scissors, sharp/sharpSurtexSS-641-11For egg manipulation

Riferimenti

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