JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذجا فريدا ذا صلة سريرية لأمراض الشرايين الطرفية يجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك للحث على الغرغرينا الخلفية في فئران FVB. ثم يتم استخدام التروية DiI داخل القلب للتصوير عالي الدقة ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية لوسادة القدم.

Abstract

يعد مرض الشرايين المحيطية (PAD) سببا مهما للمراضة الناتجة عن التعرض المزمن لعوامل الخطر لتصلب الشرايين. يواجه المرضى الذين يعانون من أشد أشكاله ، نقص التروية المزمن الذي يهدد الأطراف (CLTI) ، إعاقات كبيرة في الحياة اليومية ، بما في ذلك الألم المزمن ، ومسافة المشي المحدودة دون ألم ، والجروح غير الشافية. تم تطوير نماذج ما قبل السريرية في مختلفة لدراسة PAD ، لكن نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران لا يزال الأكثر استخداما. يمكن أن يكون هناك تباين كبير في الاستجابة للإهانة الإقفارية في هذه النماذج اعتمادا على سلالة الماوس المستخدمة وموقع ورقم ووسائل تعطيل الشرايين. يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة تجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك (NOS) للحث بشكل موثوق على غرغرينا وسادة القدم في الفئران Friend Virus B (FVB) التي تشبه فقدان الأنسجة من CLTI. في حين أن الوسائل التقليدية لتقييم التروية مثل التصوير بالليزر دوبلر التروية (LDPI) لا تزال موصى بها ، فإن التروية داخل القلب للصبغة المحبة للدهون 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) تستخدم لتسمية الأوعية الدموية. يسمح الفحص المجهري اللاحق بالليزر متحد البؤرة كامل التركيب بإعادة بناء عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) لشبكات الأوعية الدموية في وسادة القدم التي تكمل الوسائل التقليدية لتقييم التروية في نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية.

Introduction

يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD)، الذي يتميز بانخفاض تدفق الدم إلى الأطراف بسبب تصلب الشرايين، على 6.5 مليون شخص في الولايات المتحدة و200 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. المرضى الذين يعانون من PAD يعانون من انخفاض وظائف الأطراف ونوعية الحياة ، وأولئك الذين يعانون من CLTI ، وهو أشد أشكال PAD ، معرضون لخطر متزايد للبتر والوفاة بمعدل وفيات لمدة 5 سنوات يقترب من 50٪ 2. في الممارسة السريرية ، يعتبر المرضى الذين يعانون من مؤشرات الكاحل العضدي (ABI) <0.9 لديهم PAD ، وأولئك الذين يعانون من ABI <0.4 المرتبطة إما بألم الراحة أو فقدان الأنسجة على أنهم مصابون ب CLTI3. تختلف الأعراض بين المرضى الذين يعانون من ABIs مماثلة اعتمادا على النشاط اليومي ، وتحمل العضلات لنقص التروية ، والاختلافات التشريحية ، والاختلافات في التطور الجانبي4. الغرغرينا الرقمية والأطراف هي أشد مظاهر جميع أمراض انسداد الأوعية الدموية التي تؤدي إلى CLTI. وهو شكل من أشكال النخر الجاف الذي يحنط الأنسجة الرخوة. بالإضافة إلى PAD تصلب الشرايين ، يمكن ملاحظته أيضا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري ، والأوعية الدموية مثل مرض بورغر وظاهرة رينود ، أو التأق التكلسي في وضع مرض الكلى في المرحلة النهائية5,6.

تم تطوير العديد من النماذج قبل السريرية لدراسة التسبب في PAD / CLTI واختبار فعالية العلاجات المحتملة ، وأكثرها شيوعا لا يزال نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران. عادة ما يتم تحقيق نقص تروية الأطراف الخلفية في الفئران عن طريق عرقلة تدفق الدم من الشرايين الحرقفية أو الفخذية، إما عن طريق ربط الخياطة أو التخثر الكهربائي أو غيرها من الوسائل لتضييق الوعاء المطلوب7. هذه التقنيات تقلل بشكل كبير من التروية إلى الطرف الخلفي وتحفز الأوعية الدموية الجديدة في عضلات الفخذ والساق. ومع ذلك ، هناك اختلافات أساسية تعتمد على سلالة الفئران في الحساسية للإهانة الإقفارية جزئيا بسبب الاختلافات التشريحية في التوزيع الجانبي8,9. على سبيل المثال، الفئران C57BL/6 مقاومة نسبيا لنقص تروية الأطراف الخلفية، مما يدل على انخفاض وظيفة الأطراف ولكن عموما لا يوجد دليل على وجود الغرغرينا في وسادة القدم. من ناحية أخرى ، فإن الفئران BALB / c لديها قدرة ضعيفة بطبيعتها على التعافي من نقص التروية وعادة ما تتطور إلى البتر التلقائي للقدم أو أسفل الساق بعد ربط الشريان الفخذي وحده. هذه الاستجابة الشديدة لنقص التروية تضيق النافذة العلاجية ويمكن أن تمنع التقييم الطولي لتروية الأطراف ووظيفتها. ومن المثير للاهتمام أن الاختلافات الجينية في موضع سمة كمية واحدة تقع على كروموسوم الفئران الفئران 7 قد تورطت في هذه الحساسيات التفاضلية للفئران C57BL/6 و BALB / c لنخر الأنسجة وتروية الأطراف10.

بالمقارنة مع سلالات C57BL/6 و BALB / c ، تظهر فئران FVB استجابة وسيطة ولكنها غير متسقة لربط الشريان الفخذي وحده. تصاب بعض الحيوانات بغرغرينا وسادة القدم في شكل أظافر إقفارية سوداء أو أرقام محنطة ، ولكن البعض الآخر دون أي علامات علنية على نقص التروية11. الإدارة المصاحبة لهيدروكلوريد ميثيل استر Nω-Nitro-L-arginine (L-NAME) ، وهو مثبط لأكسيد النيتريك (NOS) 12 ، يمنع آليات توسيع الأوعية التعويضية ويزيد من الإجهاد التأكسدي في أنسجة الأطراف الخلفية. بالاقتران مع ربط الشريان الفخذي أو تخثره ، ينتج عن هذا النهج باستمرار فقدان أنسجة وسادة القدم في فئران FVB التي تشبه التغيرات الضمورية في CLTI ولكنها نادرا ما تتطور إلى البتر التلقائي للأطراف11. الإجهاد التأكسدي هو أحد السمات المميزة ل PAD / CLTI وينتشر عن طريق الخلل البطاني وانخفاض التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك (NO) 13,14. NO هو جزيء متعدد القدرات يمارس عادة تأثيرات مفيدة على تدفق الدم الشرياني والشعري ، والتصاق الصفائح الدموية وتجميعها ، وتجنيد الكريات البيض وتنشيطها 13. كما ثبت أن المستويات المنخفضة من NOS تنشط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، والذي يحفز الإجهاد التأكسدي ويسرع تطور تصلب الشرايين15.

بمجرد إنشاء نموذج لنقص تروية الأطراف الخلفية ، هناك حاجة أيضا إلى مراقبة إعادة تروية الأطراف اللاحقة والتأثير العلاجي لأي علاجات محتملة. في نموذج غرغرينا الفئران المقترح ، يمكن أولا تحديد درجة فقدان الأنسجة باستخدام درجة Faber لتقييم المظهر الإجمالي للقدم (0: طبيعي ، 1-5: فقدان الأظافر حيث تمثل النتيجة عدد الأظافر المتأثرة ، 6-10: ضمور الأرقام حيث تمثل النتيجة عدد الأرقام المتأثرة ، 11-12: ضمور القدم الجزئي والكامل ، على التوالي)9. ثم يتم إجراء القياسات الكمية لتروية الأطراف الخلفية عادة باستخدام LDPI ، والذي يعتمد على تفاعلات دوبلر بين ضوء الليزر وخلايا الدم الحمراء للإشارة إلى التروية على مستوى البكسل في منطقة ذات أهمية (ROI)16. في حين أن هذه التقنية كمية وغير غازية ومثالية للقياسات المتكررة، إلا أنها لا توفر تفاصيل تشريحية دقيقة للأوعية الدموية للأطراف الخلفية16. أما طرائق التصوير الأخرى، مثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، وتصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي (MRA)، وتصوير الأوعية بالأشعة السينية، فتثبت أنها إما مكلفة، وتتطلب أجهزة متطورة، أو أنها تشكل تحديا تقنيا16. في عام 2008 ، وصف لي وآخرون تقنية لوضع العلامات على الأوعية الدموية داخل شبكية العين باستخدام صبغة الكربوسيانين المحبة للدهون DiI17. يدمج DiI في الخلايا البطانية ، وعن طريق الانتشار المباشر ، يصبغ هياكل الأغشية الوعائية مثل البراعم الوعائية والعمليات الزائفة17،18. نظرا لتوصيله المباشر إلى الخلايا البطانية والطبيعة الفلورية العالية للصبغة ، يوفر هذا الإجراء وضع علامات مكثفة وطويلة الأمد على الأوعية الدموية. في عام 2012 ، قام Boden et al. بتكييف تقنية تروية DiI مع نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية الفئران عبر تصوير كامل لعضلات الفخذ المقربة التي تم حصادها بعد ربط الشريان الفخذي 19.

توفر الطريقة الحالية طريقة غير مكلفة نسبيا وممكنة تقنيا لتقييم الأوعية الدموية الجديدة استجابة لنقص تروية الأطراف الخلفية والعلاجات القائمة على الجينات أو الخلايا. في مزيد من التكيف ، يصف هذا البروتوكول تطبيق تروية DiI لتصوير الأوعية الدموية وسادة القدم بدقة عالية و 3D في نموذج الفئران من الغرغرينا الخلفية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في البروتوكول من قبل لجنة جامعة ميامي المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC). تم استخدام فئران FVB ، من الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ، للدراسة.

1. إعداد حل L-NAME

  1. في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بإعداد محلول مخزون L-NAME عن طريق إذابة 1 جم من مسحوق L-NAME (انظر جدول المواد) مع 20 مل من الماء المعقم لصنع 50 مجم / مل من المحلول. قم بتخزين محلول المخزون في 300-500 ميكرولتر من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. لصنع محلول L-NAME يعمل ، قم بإذابة أليكوت من محلول مخزون L-NAME وتخفيفه باستخدام PBS (1: 4) تحت ظروف معقمة للحصول على تركيز نهائي 10 mg / mL.
  3. لإعداد PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، قم بإذابة 8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.2 جم من KCl ، و 1.44 جم من Na2HPO4 ، و 0.23 جم من NaH2PO4 في 800 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl. أضف الماء إلى حجم إجمالي قدره 1000 مل وقم بالتصفية من خلال فلتر أعلى زجاجة 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: الحقن داخل الصفاق (IP) من 4 ميكرولتر / غرام من محلول العمل L-NAME يعادل الجرعة المطلوبة 40 ملغم / كغم من L-NAME. يجب أن يبقى حل العمل L-NAME على الجليد أثناء الاستخدام ، ويجب إجراء تخفيفات جديدة يوميا باستخدام أليكوتس مذاب طازج من محلول المخزون.

2. الحث الكيميائي والجراحي للغرغرينا الخلفية

  1. الحصول على الفئران FVB ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ، إما من مربي أو تربى في المنشأة (انظر جدول المواد). 2 ساعة قبل الجراحة ، قم بإعطاء جرعة IP 40 مجم / كجم من L-NAME.
  2. تخدير الفئران مع حقن IP من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من زيلازين (انظر جدول المواد) المخفف في PBS. تأكد من التخدير الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم واستمر في مراقبة معدل التنفس أثناء الإجراء.
    1. إزالة الشعر من الأطراف الخلفية الثنائية والفخذين باستخدام المقصات و / أو كريم مزيل الشعر. وضع الحيوان تحت المجهر الجراحي supine ؛ تمديد وشريط الأطراف في مكانها. تعقيم المجال الجراحي عن طريق تطبيق محلول البوفيدون واليود محيطيا على الموقع الجراحي.
  3. تحت تكبير 10-20x ، استخدم مقص أو مشرط لإجراء شق 1 سم على طول تجعد الفخذ أقل شأنا من الرباط الأربي. استخدم ملقطا ناعما وقضيب طرف قطني معقم لتشريح وسادة الدهون الإربية بشكل صريح أفقيا من الرباط الإربي وفضح غمد الفخذ الأساسي بحيث يتم تحديد الشريان الفخذي والوريد والعصب بوضوح (الشكل 1).
  4. باستخدام ملقط ناعم ، اخترق غمد الفخذ. قم بتنظيف العصب الفخذي بعناية بعيدا عن الشريان الفخذي. تحديد إقلاع الفرع الجانبي المحيطي للشريان الفخذي (LCFA) في عمق العصب الفخذي (الشكل 1).
    1. المضي قدما في التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد القريب فقط من LCFA عن طريق تنشيط جهاز الكي (انظر جدول المواد) وملامسة الأوعية بلطف بحركة من جانب إلى آخر ، مما يضمن أن العصب الفخذي معزول جيدا ويظل محميا من الإصابة الحرارية. قسم جزء السفينة المتخثر بمقص.
  5. المضي قدما في التعرض للشريان الفخذي البعيد والوريد عن طريق تعبئة وسادة الدهون الإربية عن طريق الإنسي. تحديد الشريان الشرسوفي السطحي والتقاطع saphenopopliteal بشكل أكثر بعدا.
    1. اخترق غمد الفخذ بين هذين الموقعين وتشريح العصب الفخذي بعناية بعيدا عن الأوعية الفخذية. المضي قدما في تخثر وتحويل الشريان الفخذي والوريد كما هو موضح في الخطوة 2.4.1.
  6. قم بري المجال الجراحي باستخدام حقنة مملوءة ب PBS معقمة. احصل على الإرقاء عن طريق تطبيق ضغط لطيف باستخدام قضيب طرف القطن لمدة 3-5 دقائق على أي مناطق من النزيف.
    1. المضي قدما في إغلاق الشق باستخدام خياطة 5-0 قابلة للامتصاص بطريقة بسيطة مستمرة. إعطاء جرعة 1 مغ/كغ تحت الجلد من البوبرينورفين المستدام الإطلاق (انظر جدول المواد) لتخفيف الآلام بعد العملية الجراحية.
  7. تأكد من فقدان تروية وسادة القدم في الطرف الخلفي المربوط بواسطة LDPI (انظر جدول المواد). أثناء التخدير ، ضع الحيوان على وسادة رغوة داكنة في وضع عرضة أسفل آلة LDPI واستخدم حلقات من الشريط الكهربائي لتثبيت القدمين في مكانهما.
    1. المضي قدما مع LDPI من القدمين الثنائية. بمجرد اكتمال المسح الضوئي ، ارسم عائد استثمار حول كل لوحة قدم واحصل على قيم التدفق المتوسطة.
    2. احسب مؤشر التروية كنسبة متوسط قيم التدفق من وسادة القدم المربوطة إلى غير المربوطة. تأكد من أن مؤشر التروية أقل من 0.1.
  8. انقل الحيوان مرة أخرى إلى قفص نظيف باستخدام وسادة تدفئة أو مصباح علوي للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية. ضمان الشفاء التام من التخدير قبل نقل الفئران مرة أخرى إلى منشأة الحيوانات.

3. إدارة ما بعد الجراحة من L-NAME ومراقبة الغرغرينا الخلفية

  1. في أيام ما بعد الجراحة 1-3 ، قم بإعطاء جرعة IP إضافية من 40 مجم / كجم من L-NAME لكل. في الوقت نفسه ، قم بتقييم القدم بعناية من الطرف الإقفاري.
  2. حدد درجة نقص تروية الأطراف الخلفية والغرغرينا باستخدام درجة نقص تروية الطرف الخلفي من فابر9. الدرجات 1-5: عدد الأظافر الإقفارية. الدرجات 6-10: 1-5 أرقام نقص تروية ؛ الدرجات 11 و 12: ضمور القدم الجزئي والكامل. سجل درجات Faber في أيام ما بعد الجراحة 1-3 ثم أسبوعيا.

4. إعداد DiI وحلول العمل لتروية الحيوانات

  1. لإعداد محلول مخزون DiI ، قم بإذابة 100 ملغ من بلورات DiI (انظر جدول المواد) في 16.7 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. يغطى بورق الألمنيوم ويترك على منصة هزازة طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  2. لتحضير المخفف ، قم بإذابة 50 جم من الجلوكوز في 1000 مل من الماء المقطر لإنتاج محلول جلوكوز بنسبة 5٪. تصفية من خلال مرشح أعلى زجاجة 0.22 ميكرومتر. امزج محاليل PBS والجلوكوز بنسبة 5٪ بنسبة 1: 4 لإعداد محلول مخفف يعمل.

5. إعداد المعدات والتروية DiI

  1. اجعل حل DiI يعمل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول مخزون DiI إلى 10 مل من محلول مخفف العمل (تم إعداده في الخطوة 4.2) مباشرة قبل الاستخدام. رجه باليد حتى يمتزج جيدا.
  2. قم بتوصيل اثنين أو ثلاثة من أجهزة التوقف في 3 اتجاهات وإبرة فراشة 25 G في سلسلة. قم بإعداد محاقن سعة 10 مل مع 4 مل من PBS و 10 مل من محلول DiI و 10 مل من الفورمالين المخزن مؤقتا المحايد بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد).
  3. قم بتوصيل المحقنة بالفورمالين بمنفذ التدفق القريب وحقن المحلول لطرد الهواء من الخط ؛ أدر مفتاح التوقف لإغلاق المنفذ. كرر نفس الإجراء بالتتابع ، مع توصيل المحاقن ب DiI ثم PBS بمنافذ التدفق المتوسطة والبعيدة ، على التوالي ، مع الحرص على طرد جميع فقاعات الهواء من خلال مجموعة stopcock.
    ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في أي جزء من مجموعة أو أنابيب السداد. يمكن لفقاعات الهواء أن تسد الشرايين الصغيرة أثناء التروية مما يؤدي إلى سوء توزيع DiI داخل الأوعية الدموية ونتائج التصوير المعرضة للخطر.
  4. بمجرد اكتمال الإعداد ، قم بالقتل الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من CO2 في غرفة الحث.
  5. ضع الحيوان ليتم ارتداؤه في وضع ضعيف على وسادة ماصة وقم بتأمين الإبطين والأطراف السفلية بالإبر.
  6. باستخدام المقص ، قم بعمل شق عرضي لفتح تجويف البطن. كشف ثم تقسيم الحجاب الحاجز الأيسر والأيمن للوصول إلى التجويف الصدري.
    1. قطع جدار الصدر على جانبي القص من الأضلاع السفلية إلى الضلعين الأول أو الثاني ، وتجنب الشرايين الصدرية الداخلية (الثديية) بشكل إنسي. استخدم مرقئ (انظر جدول المواد) للإمساك بالطرف السفلي من القص وعكسه نحو رأس الحيوان لفضح التجويف الصدري.
  7. حدد البطين الأيسر، الذي يبدو أفتح لونا من البطين الأيمن. أمسك القلب بلطف باستخدام ملقط حاد وأدخل إبرة الفراشة في البطين الأيسر.
    1. استخدم مقص أو إبرة 18 جم لثقب الأذين الأيمن ، مما يسمح لمحاليل الدم والتروية بالعودة إلى القلب لتصريفها. قم بتثبيت الإبرة بيد واحدة أو اثنتين ، مع الحرص على عدم ثقب البطين الأيمن عن غير قصد واختراق الدورة الدموية الرئوية بدلا من الدورة الدموية الجهازية.
  8. افتح المنفذ إلى المحقنة باستخدام PBS وقم بحقن 2-4 مل يدويا بمعدل 1-2 مل / دقيقة لمدة 1-2 دقيقة لطرد الدم من نظام الأوعية الدموية. ضمان التروية الناجحة من خلال مراقبة النزيف من الأذين الأيمن. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة PBS.
  9. افتح المنفذ إلى المحقنة باستخدام DiI وحقن 5-10 مل بمعدل 1-2 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. راقب الأذنين والأنف وراحة اليد التي يجب أن تتحول إلى اللون الوردي قليلا مع حقن محلول DiI. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة DiI وانتظر لمدة 2 دقيقة للسماح بدمج الصبغة قبل حقن المثبت.
  10. افتح المنفذ إلى المحقنة بالفورمالين وحقن 5-10 مل بمعدل 1-2 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة من البطين الأيسر والمضي قدما في حصاد الأنسجة ذات الاهتمام.
  11. باستخدام مقص ثقيل ، قم بخلع الساق عند الكاحل ، وفصل القدمين اليسرى واليمنى تماما عن أسفل الساقين. ضع القدمين المحصودين في طبق من 6 أو 12 بئرا مع 1-2 مل من محلول الفورمالين بنسبة 10٪. لف الطبق بورق القصدير وخزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.

6. إعداد أنسجة وسادة القدم للمجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري

  1. في اليوم التالي ، استبدل المحلول المثبت في لوحة 6 أو 12 بئرا ب 1-2 مل من PBS لكل بئر.
  2. لجلد القدم ، أولا ، قم بعمل شق طولي باستخدام مشرط على الجوانب الأخمصية والظهرية للقدم. ثم ، باستخدام ملقط مسنن ومرقئ صغير ، قم بإزالة جميع الجلد بعناية من القدم والأرقام ، دون إتلاف الأنسجة الرخوة الكامنة.
  3. المضي قدما في تركيب وتصوير الأنسجة ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 1-2 أيام من التروية والحصاد. بدلا من ذلك ، قم بإعادة منصات القدم إلى لوحات 6 أو 12 بئرا مع 1-2 مل من PBS ؛ تغطي مع احباط وتخزينها في 4 درجة مئوية للحفاظ على التألق لمدة تصل إلى 1 شهر.
  4. لتركيب الأنسجة، ضع القدمين بشكل فردي بين شريحتين من المجهر الزجاجي مع وسادة خزعة رغوية مطوية فوق نفسها (مرة أو مرتين اعتمادا على سمك الأنسجة) في كل طرف (انظر جدول المواد). استخدم مشبكين صغيرين لضغط الشرائح الزجاجية معا في كل طرف (السماكة النهائية حوالي 1 مم).
    ملاحظة: تتطلب الأنسجة الأكثر سمكا أوقات مسح أطول. يمكن ضغط وسادة القدم الجلدية بين الشرائح الزجاجية قبل يوم واحد من التصوير لتقليل سمك الأنسجة.

7. المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري

  1. الاستعداد لجلسة التصوير: قم بتشغيل نظام التصوير وابدأ برنامج الاقتناء (انظر جدول المواد). استخدم هدف تكبير منخفض/فتحة رقمية منخفضة (على سبيل المثال، x5/0.15) لالتقاط الصور لأن عدسات التكبير الأقل عادة ما يكون لها مسافات عمل أطول مطلوبة لهذه التجربة.
  2. انقر فوق نعم إلى مربع الحوار تنشيط المرحلة. قم بتنشيط ليزر 561 نانومتر في علامة التبويب تكوين. على الشاشة الرئيسية ، قم بتنشيط مسار شعاع مرئي بالنقر فوق الزر مرئي . قم بتعيين كاشف إلى نطاق 570-600 نانومتر بالنقر فوق خانة الاختيار نشط المقابلة.
  3. حدد أيقونة مسح البلاط ضوئيا في علامة التبويب اكتساب > وقم بتعيين الدقة المطلوبة (512 × 512 أو 1024 × 1024).
  4. ضع عينة الأنسجة المثبتة على الجاف (بدون ماء أو إضافة PBS) المضغوطة بين الشرائح الزجاجية على مرحلة المجهر وجلب الأنسجة إلى التركيز.
  5. لتعيين حدود المسح الضوئي، انتقل إلى الزاوية العلوية اليسرى أو اليمنى من العينة. في علامة التبويب اكتساب ، ضمن قائمة مسح البلاط ، انقر فوق الزر وضع علامة على الموضع . انتقل إلى الزاوية المقابلة (أسفل اليمين أو اليسار ، على التوالي) وانقر فوق الزر "وضع علامة على الموضع " مرة أخرى.
  6. لتعيين عمق مكدس Z ، انقر فوق الزر Live في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة وانتقل إلى وسط العينة. استخدم مقبض المحور z للتمرير إلى أسفل العينة.
  7. في علامة التبويب الاستحواذ ، ضمن قائمة Z-Stack ، انقر فوق الزر "ابدأ ". مرر إلى أعلى العينة وانقر على زر إنهاء . انقر فوق حجم الخطوة Z واضبطه على القيمة المطلوبة (على سبيل المثال ، 50 ميكرومتر).
  8. في الزاوية السفلية اليمنى من الشاشة ، انقر فوق ابدأ لبدء الحصول على الصور.

8. التحليل الكمي وإعادة بناء 3D للأوعية الدموية وسادة القدم

  1. قم بتنزيل وتثبيت أحدث إصدار من فيجي (ImageJ) بالإضافة إلى المكون الإضافي لتحليل السفن20. افتح ملفات صور المجهر في فيجي ، والتي ستجمع بين سلسلة Z الفردية في مكدسات Z التي يمكن عرضها في المحور z باستخدام شريط التمرير الموجود أسفل الصورة.
  2. حدد صورة مكدس Z المركب، ثم ضمن القائمة صورة، اختر مكدسات > Z Project لإنشاء إسقاط ثنائي الأبعاد. بعد ذلك، قم بتحويل الإسقاط Z إلى ثنائي ضمن عملية > ثنائي > جعل ثنائي.
  3. قم بتشغيل المكون الإضافي "كثافة الأوعية الدموية" ضمن المكونات الإضافية > كثافة الأوعية الدموية. عند المطالبة، استخدم المؤشر لتتبع عائد استثمار حول محيط لوحة القدم والأرقام. لاحظ كثافة الأوعية التي يتم الإبلاغ عنها ، والتي يتم التعبير عنها كنسبة مئوية من عائد الاستثمار (جزء منطقة الأوعية الدموية).
  4. لإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد في فيجي ، حدد Stacks > 3D Project وقم بتعيين محور الدوران المطلوب والزاوية والسرعة ضمن القائمة Image. بدلا من ذلك، حدد عارض مستوى الصوت ضمن قائمة المكونات الإضافية لتصور الصور كشرائح أو معالجة إعادة البناء في المحاور المطلوبة.
  5. لمزيد من المشاركة في تقديم 3D ، استخدم برامج بديلة لتحليل الصور ومعالجتها (انظر جدول المواد). قم بتحويل الملفات إلى تنسيق البرنامج المطلوب وقم بخياطة عمليات مسح البلاط الفردية باستخدام وظيفة خياطة البلاط.
  6. بعد خياطة عمليات مسح البلاط الفردية معا ، افتح الملف المركب وتابع عرض سطح وحدة التخزين. انقر فوق إضافة سطح جديد لفتح معالج إنشاء Surface واستخدام الأسهم للتبديل بين القوائم ، ولا سيما تعيين عائد الاستثمار وكثافة العتبة. بمجرد الرضا عن عرض السطح ، استخدم وظيفة الرسوم المتحركة لإنشاء مقاطع فيديو للصورة المعالجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يفصل هذا البروتوكول وسيلة موثوقة للحث على نقص التروية وفقدان الأنسجة في وسادة القدم الفئرانية باستخدام مزيج من تخثر الشريان الفخذي والوريد مع إدارة L-NAME ، وهو مثبط سينثاز أكسيد النيتريك ، في الفئران FVB الحساسة. يفصل الشكل 1 تشريح الأوعية الدموية للطرف الخلفي الفئراني ويشير...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في حين أن نقص تروية الأطراف الخلفية للفأر هو النموذج قبل السريري الأكثر استخداما على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية الجديدة في PAD و CLTI ، هناك تباين كبير في شدة نقص التروية والانتعاش اعتمادا على سلالة الفأر المحددة المستخدمة وموقع وعدد وطريقة تعطيل الشرايين. يمكن أن يؤدي الجمع بين ربط ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى Z-J L و OC V من المعاهد الوطنية للصحة [R01HL149452 و VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. كما نشكر مرفق الفحص المجهري والتصوير التابع لمشروع ميامي لعلاج الشلل في كلية الطب بجامعة ميامي على توفير إمكانية الوصول إلى برامج تحليل الصور ومعالجتها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Binder clips (small)Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)VWR10148-584
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)InvitrogenD282
Electrocautery deviceGemini Cautery System5917
Ethanol (100%)VWR89370-084
Fiji (ImageJ) softwareNIHUsed version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy padsFisher Scientific22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)VWR89370-094
FVB miceJackson Laboratory001800
GlucoseSigma-AldrichG7528
HCl (1 M)Sigma-Aldrich13-1700
Imaris softwareOxford InstrumentsUsed version 9.6.0.
IsofluranePivetalNDC 46066-755-04
KClSigma-AldrichP9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)Sigma-AldrichN5751
Laser Doppler perfusion imagerMoorLDImoorLDI2-HIRUsed moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)VWR48311-703
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaOHSigma-AldrichS8263
Needles (27 G)BD305109
Povidone-iodine swabstick (10%)MedlineMDS093901ZZ
Surgical instrumentsRoboz SurgicalFine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)DemeTECHG275017B0P
Syringes (10 mL)BD305482
Three-way stopcocksCole-Parmer19406-49
Vascular Analysis PluginFree download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine

References

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  2. Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
  3. Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
  4. Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
  5. Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
  6. Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
  7. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035(2009).
  8. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  9. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  10. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  11. Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
  12. Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
  13. Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
  14. McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
  15. Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
  16. Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
  17. Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
  19. Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
  20. Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106(2015).
  21. Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  22. Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
  23. Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
  24. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166(2016).
  25. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
  26. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
  27. Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047(2013).
  28. Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 L NAME DiI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved