Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Zusammenfassung

Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAVK) ist eine signifikante Ursache für Morbidität, die sich aus einer chronischen Exposition gegenüber atherosklerotischen Risikofaktoren ergibt. Patienten, die an ihrer schwersten Form, der chronischen gliedmaßenbedrohlichen Ischämie (CLTI), leiden, haben erhebliche Beeinträchtigungen des täglichen Lebens, einschließlich chronischer Schmerzen, begrenzter Gehstrecke ohne Schmerzen und nicht heilender Wunden. Präklinische Modelle wurden an verschiedenen Tieren entwickelt, um PAD zu untersuchen, aber die Ischämie der Maus-Hinterbeine bleibt die am weitesten verbreitete. Es kann in diesen Modellen signifikante Unterschiede in der Reaktion auf ischämische Beleidigung geben, abhängig von der verwendeten Mausbelastung und der Stelle, Anzahl und Art der arteriellen Störung. Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode, die die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickoxid-Synthase-Inhibitors (NOS) kombiniert, um bei FVB-Mäusen (Friend Virus B) zuverlässig Fußpolstergangrän zu induzieren, das dem Gewebeverlust von CLTI ähnelt. Während traditionelle Mittel zur Beurteilung der Reperfusion wie die Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung (LDPI) weiterhin empfohlen werden, wird die intrakardiale Perfusion des lipophilen Farbstoffs 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) zur Markierung des Gefäßsystems verwendet. Die anschließende konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für die gesamte Montierung ermöglicht eine hochauflösende, dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Fußpolster-Gefäßnetzwerken, die traditionelle Mittel zur Beurteilung der Reperfusion in Hindlimb-Ischämiemodellen ergänzt.

Einleitung

Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAVK), die durch einen verminderten Blutfluss zu den Extremitäten aufgrund von Atherosklerose gekennzeichnet ist, betrifft 6,5 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und 200 Millionen Menschen ^weltweit1. Patienten mit PAD erleben eine verminderte Gliedmaßenfunktion und Lebensqualität, und diejenigen mit CLTI, der schwersten Form von PAVK, haben ein erhöhtes Risiko für Amputation und Tod mit einer 5-Jahres-Sterblichkeitsrate von fast 50%^2. In der klinischen Praxis wird bei Patienten mit Knöchel-Arm-Indizes (ABI) <0,9 PAD und bei Patienten mit ABI <0,4, die entweder mit Ruheschmerzen oder Gewebeverlust assoziiert sind^{, CLTI3} angesehen. Die Symptome variieren bei Patienten mit ähnlichen ABIs in Abhängigkeit von der täglichen Aktivität, der Muskeltoleranz gegenüber Ischämie, anatomischen Variationen und Unterschieden in der Kollateralentwicklung4^. Digit- und Gliedmaßengangrän ist die schwerste Manifestation aller vaskulären Verschlusserkrankungen, die zu CLTI führen. Es ist eine Form der trockenen Nekrose, die die Weichteile mumifiziert. Neben dem atherosklerotischen PAD kann es auch bei Patienten mit Diabetes, Vaskulitiden wie Morbus Buerger und Raynaud-Phänomen oder Calciphylaxie im Endstadium beobachtet ^werden5,6.

Mehrere präklinische Modelle wurden entwickelt, um die Pathogenese von PAVK / CLTI zu untersuchen und die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen zu testen, von denen die häufigste nach wie vor eine Ischämie der Maus-Hintergliedmaßen ist. Die Induktion einer Ischämie der Hintergliedmaßen bei Mäusen wird typischerweise durch die Behinderung des Blutflusses aus den Becken- oder Oberschenkelarterien erreicht, entweder durch Nahtligatur, Elektrokoagulation oder andere Mittel zur Verengung des gewünschten ^Gefäßes7. Diese Techniken reduzieren die Durchblutung der Hinterbeine drastisch und stimulieren die Neovaskularisation in der Oberschenkel- und Wadenmuskulatur. Es gibt jedoch wesentliche murine stammabhängige Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber ischämischer Beleidigung, die teilweise auf anatomische Unterschiede in der Kollateralverteilung zurückzuführen ^sind8,9. Zum Beispiel sind C57BL/6-Mäuse relativ resistent gegen Ischämie der Hinterbeine und zeigen eine verminderte Gliedmaßenfunktion, aber im Allgemeinen keine Hinweise auf Gangrän im Fußpolster. Auf der anderen Seite haben BALB / c-Mäuse eine von Natur aus schlechte Fähigkeit, sich von einer Ischämie zu erholen und entwickeln typischerweise eine Autoamputation des Fußes oder des Unterschenkels nach der Ligatur der Oberschenkelarterie allein. Diese schwere Reaktion auf Ischämie verengt das therapeutische Fenster und kann eine longitudinale Beurteilung der Reperfusion und Funktion der Gliedmaßen ausschließen. Interessanterweise wurden genetische Unterschiede in einem einzigen quantitativen Merkmalslocus auf dem murinen Chromosom 7 mit diesen differentiellen Anfälligkeiten von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen für Gewebenekrose und Gliedmaßenreperfusion in Verbindung ^gebracht10.

Im Vergleich zu C57BL/6- und BALB/c-Stämmen zeigen FVB-Mäuse eine intermediäre, aber inkonsistente Reaktion auf die Ligatur der Oberschenkelarterie allein. Einige Tiere entwickeln Fußpolstergangrän in Form von schwarzen ischämischen Nägeln oder mumifizierten Ziffern, wieder andere ohne offensichtliche Anzeichen von ^Ischämie11. Die gleichzeitige Gabe von Nω-Nitro-L-arginininmethylesterhydrochlorid (L-NAME), einem Stickstoffmonoxidsynthase (NOS^{)-Inhibitor12,} verhindert kompensatorische vasodilatatorische Mechanismen und erhöht den oxidativen Stress im Hinterbeingewebe weiter. In Kombination mit der Ligatur oder Koagulation der Oberschenkelarterie führt dieser Ansatz bei FVB-Mäusen konsequent zu einem Verlust von Fußpolstergewebe, der den atrophischen Veränderungen von CLTI ähnelt, aber selten zu einer Selbstamputation der Gliedmaßen ^{fortschreitet11.} Oxidativer Stress ist eines der Markenzeichen von PAD/CLTI und wird durch endotheliale Dysfunktion und verminderte Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO)^13,14 verbreitet. NO ist ein pluripotentes Molekül, das in der Regel positive Auswirkungen auf den arteriellen und kapillaren Blutfluss, die Adhäsion und Aggregation von Blutplättchen sowie die Rekrutierung und Aktivierung von Leukozyten ^ausübt13. Es wurde auch gezeigt, dass reduzierte NOS-Spiegel das Angiotensin-Converting-Enzym aktivieren, das oxidativen Stress induziert und das Fortschreiten der Atherosklerose ^{beschleunigt15.}

Sobald ein Modell der Ischämie der Hintergliedmaßen etabliert ist, ist auch die Überwachung der nachfolgenden Reperfusion der Gliedmaßen und der therapeutischen Wirkung potenzieller Behandlungen erforderlich. Im vorgeschlagenen murinen Gangränmodell kann der Grad des Gewebeverlusts zunächst mit dem Faber-Score quantifiziert werden, um das grobe Erscheinungsbild des Fußes zu beurteilen (0: normal, 1-5: Verlust von Nägeln, wobei der Score die Anzahl der betroffenen Nägel darstellt, 6-10: Atrophie der Ziffern, wobei der Score die Anzahl der betroffenen Ziffern darstellt, 11-12: teilweise und vollständige Fußatrophie, (⁹) Quantitative Messungen der Perfusion der Hinterbeine werden dann typischerweise mit LDPI durchgeführt, das auf Doppler-Wechselwirkungen zwischen Laserlicht und roten Blutkörperchen beruht, um eine Perfusion auf Pixelebene in einer Region von Interesse (ROI) ^anzuzeigen16. Während diese Technik quantitativ, nicht-invasiv und ideal für wiederholte Messungen ist, liefert sie keine granularen anatomischen Details des Gefäßsystems der ^{Hinterbeine16.} Andere Bildgebungsmodalitäten wie die Mikrocomputertomographie (Mikro-CT), die Magnetresonanzangiographie (MRA) und die Röntgenmikroangiographie erweisen sich entweder als kostspielig, erfordern eine ausgeklügelte Instrumentierung oder sind anderweitig technisch ^{anspruchsvoll16.} Im Jahr 2008 beschrieben Li et al. eine Technik zur Markierung von Blutgefäßen innerhalb der Netzhaut mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff ^DiI17. DiI integriert sich in Endothelzellen und färbt durch direkte Diffusion vaskuläre Membranstrukturen wie angiogene Sprossen und pseudopodale ^{Prozesse17,18}. Aufgrund seiner direkten Abgabe in Endothelzellen und der stark fluoreszierenden Natur des Farbstoffs ermöglicht dieses Verfahren eine intensive und lang anhaltende Markierung der Blutgefäße. Im Jahr 2012 passten Boden et al. die Technik der DiI-Perfusion an das Modell der murinen Hinterbein-Ischämie an, indem sie die geernteten Oberschenkeladduktorenmuskeln nach der Ligatur der Oberschenkelarterie vollständig ^aufnahmen19.

Die aktuelle Methode bietet eine relativ kostengünstige und technisch machbare Möglichkeit, die Neovaskularisation als Reaktion auf eine Ischämie der Hintergliedmaßen und gen- oder zellbasierte Therapeutika zu beurteilen. In einer weiteren Anpassung beschreibt dieses Protokoll die Anwendung der DiI-Perfusion, um das Gefäßsystem des Fußpolsters in hoher Auflösung und 3D in einem murinen Modell von Hinterbeingangrän abzubilden.

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Protokoll

Alle im Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Miami genehmigt. FVB-Mäuse, sowohl männliche als auch weibliche, im Alter von 8-12 Wochen, wurden für die Studie verwendet.

1. Herstellung der L-NAME-Lösung

1. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube eine L-NAME-Stammlösung vor, indem Sie 1 g L-NAME-Pulver (siehe Materialtabelle) mit 20 ml sterilem Wasser auflösen, um eine Lösung von 50 mg/ml herzustellen. Lagern Sie die Stammlösung in 300-500 μL Aliquots bei -20 °C für bis zu 3 Monate.
2. Um eine funktionierende L-NAME-Lösung herzustellen, tauen Sie ein Aliquot L-NAME-Stammlösung auf und verdünnen Sie es mit PBS (1:4) unter sterilen Bedingungen, um eine endgültige Konzentration von 10 mg/ml zu erhalten.
3. Zur Herstellung von PBS (pH 7,4) werden 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,23 g NaH2PO4 in 800 ml destilliertem Wasser gelöst. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein. Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1.000 ml hinzufügen und durch einen 0,22 μm Flaschenverschlussfilter filtern.
   HINWEIS: Die intraperitoneale (IP) Injektion von 4 μL/g L-NAME-Arbeitslösung entspricht der gewünschten Dosis von 40 mg/kg L-NAME. Die L-NAME-Arbeitslösung sollte während des Gebrauchs auf Eis gehalten werden, und täglich sollten neue Verdünnungen mit frisch aufgetauten Aliquoten der Stammlösung vorgenommen werden.

2. Chemische und chirurgische Induktion von Gangrän der Hinterbeine

1. Erhalten Sie FVB-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen, entweder von einem Züchter oder in der Einrichtung gezüchtet (siehe Materialtabelle). 2 h vor der Operation eine IP-Dosis von 40 mg/kg L-NAME verabreichen.
2. Anästhesien von Mäusen mit IP-Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle), verdünnt in PBS. Bestätigen Sie eine angemessene Sedierung durch das Fehlen eines Zehen-Pinch-Reflexes und überwachen Sie die Atemfrequenz während des Eingriffs weiter.
   1. Entfernen Sie Haare von bilateralen Hinterbeinen und Leisten mit einer Schere und / oder einer Enthaarungscreme. Positionieren Sie das Tier unter einem chirurgischen Mikroskop supine; Verlängern und kleben Sie die Extremitäten an Ort und Stelle. Sterilisieren Sie das Operationsfeld, indem Sie die Povidon-Jod-Lösung umlaufend auf die Operationsstelle auftragen.
3. Verwenden Sie unter 10-20-facher Vergrößerung eine Schere oder ein Skalpell, um einen 1-cm-Schnitt entlang der Leistenfalte zu machen, der dem Leistenband unterlegen ist. Verwenden Sie eine feine Pinzette und einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um das Leistenfettpolster seitlich vom Leistenband zu sezieren und die darunter liegende Oberschenkelscheide freizulegen, so dass die Oberschenkelarterie, die Vene und der Nerv eindeutig identifiziert werden (Abbildung 1).
4. Durchbohren Sie mit einer feinen Pinzette die Oberschenkelscheide. Streichen Sie den Nervus femoralis vorsichtig von der Oberschenkelarterie weg. Identifizieren Sie den Start des lateralen Zirkumflexastes der Oberschenkelarterie (LCFA) tief zum Femurnerv (Abbildung 1).
   1. Fahren Sie mit der Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Vene nur proximal zum LCFA fort, indem Sie das Kauterisationsgerät aktivieren (siehe Materialtabelle) und die Gefäße sanft mit einer seitlichen Bewegung berühren, um sicherzustellen, dass der Femurnerv gut isoliert ist und vor thermischen Verletzungen geschützt bleibt. Teilen Sie das koagulierte Gefäßsegment mit einer Schere.
5. Fahren Sie mit der Freilegung der distalen Oberschenkelarterie und der Vene fort, indem Sie das Leistenfettpolster medial mobilisieren. Identifizieren Sie die oberflächliche epigastrische Arterie und die saphenopopliteale Verbindung disistaler.
   1. Durchbohren Sie die Oberschenkelscheide zwischen diesen beiden Stellen und sezieren Sie den Femurnerv vorsichtig von den Oberschenkelgefäßen weg. Fahren Sie mit der Gerinnung und Durchtrennung der Oberschenkelarterie und der Vene fort, wie in Schritt 2.4.1 beschrieben.
6. Bewässern Sie das Operationsfeld mit einer Spritze, die mit sterilem PBS gefüllt ist. Erhalten Sie Hämostase, indem Sie mit einem Baumwollspitzenapplikator für 3-5 Minuten sanften Druck auf alle Blutungsbereiche ausüben.
   1. Fahren Sie mit dem Verschluss des Einschnitts mit resorbierbarer 5-0-Naht auf einfache kontinuierliche Weise fort. Verabreichen Sie eine subkutane Dosis von 1 mg/kg Dauerfreisetzungsbuprenorphin (siehe Materialtabelle) zur postoperativen Schmerzlinderung.
7. Bestätigen Sie den Verlust der Fußpolsterdurchblutung im ligierten Hinterteil durch LDPI (siehe Materialtabelle). Während der Betäubung legen Sie das Tier auf ein dunkles Schaumstoffpolster in einer Bauchlage unter der LDPI-Maschine und verwenden Sie Schleifen aus elektrischem Klebeband, um die Füße an Ort und Stelle zu sichern.
   1. Fahren Sie mit LDPI der bilateralen Füße fort. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, zeichnen Sie einen ROI um jedes Fußpad und erhalten Sie die mittleren Flusswerte.
   2. Berechnen Sie den Perfusionsindex als Verhältnis der mittleren Flusswerte vom ligierten zu dem nicht ligierten Fußpolster. Stellen Sie sicher, dass der Perfusionsindex kleiner als 0,1 ist.
8. Bringen Sie das Tier zurück in einen sauberen Käfig mit einem Heizkissen oder einer Deckenlampe, um die Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass Sie sich vollständig von der Anästhesie erholen, bevor Sie die Mäuse zurück in die Tiereinrichtung bringen.

3. Postoperative Verabreichung von L-NAME und Überwachung der Gangrän der Hinterbeine

1. An den postoperativen Tagen 1-3 ist jedem Tier eine zusätzliche IP-Dosis von 40 mg/kg L-NAME zu verabreichen. Bewerten Sie gleichzeitig sorgfältig den Fuß von der ischämischen Extremität.
2. Quantifizieren Sie den Grad der Hinterbein-Ischämie und der Gangrän mit dem Faber Hindlimb-Ischämie-Score9. Ergebnisse 1-5: Anzahl der ischämischen Nägel; Ergebnisse 6-10: 1-5 ischämische Ziffern; Punkte 11 und 12: teilweise und vollständige Fußatrophie. Rekord Faber punktet an postoperativen Tagen 1-3 und dann wöchentlich.

4. Herstellung von DiI und Arbeitslösungen für die Tierperfusion

1. Zur Herstellung einer DiI-Stammlösung lösen Sie 100 mg DiI-Kristalle (siehe Materialtabelle) in 16,7 ml 100% Ethanol auf. Mit Alufolie abdecken und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einer Schaukelplattform stehen lassen.
2. Um das Verdünnungsmittel herzustellen, lösen Sie 50 g Glukose in 1.000 ml destilliertem Wasser auf, um eine 5% ige Glukoselösung zu erhalten. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Flaschenverschlussfilter. Mischen Sie PBS und 5% ige Glukoselösungen im Verhältnis 1:4, um eine funktionierende Verdünnungslösung herzustellen.

5. Geräteeinrichtung und DiI-Perfusion

1. Machen Sie DiI-Arbeitslösung, indem Sie 200 μL DiI-Stammlösung zu 10 ml der Arbeitsverdünnungslösung (hergestellt in Schritt 4.2) unmittelbar vor der Verwendung hinzufügen. Von Hand schütteln, um gut zu mischen.
2. Schließen Sie zwei oder drei 3-Wege-Absperrhähne und eine 25 G Schmetterlingsnadel in Reihe an. Bereiten Sie 10 ml Spritzen mit 4 ml PBS, 10 ml DiI-Lösung und 10 ml 10% neutralem gepuffertem Formalin vor (siehe Materialverzeichnis).
3. Schließen Sie die Spritze mit Formalin an den proximalen Zuflussanschluss an und injizieren Sie die Lösung, um Luft aus der Leitung zu spülen; Drehen Sie den Absperrhahn, um den Anschluss zu schließen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang nacheinander, indem Sie die Spritzen mit DiI und dann PBS mit den mittleren bzw. distalen Zuflussanschlüssen verbinden, wobei Sie darauf achten, alle Luftblasen durch die Absperrhahnbaugruppe zu spülen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich in keinem Teil der Absperrhahnbaugruppe oder des Schlauches Luftblasen befinden. Luftblasen können kleine Arterien während der Perfusion verschließen, was zu einer schlechten intravaskulären DiI-Verteilung und beeinträchtigten Bildgebungsergebnissen führt.
4. Sobald der Aufbau abgeschlossen ist, euthanasieren Sie das Tier durch _{CO2-Überdosierung} in einer Induktionskammer.
5. Legen Sie das zu durchblutende Tier in Rückenlage auf ein saugfähiges Pad und sichern Sie die Achselhöhlen und die unteren Extremitäten mit Nadeln.
6. Machen Sie mit einer Schere einen Querschnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen. Belichten und teilen Sie dann die linke und rechte Membran, um Zugang zur Brusthöhle zu erhalten.
   1. Schneiden Sie die Brustwand auf beiden Seiten des Brustbeins von den unteren Rippen bis zur ersten oder zweiten Rippe ab und vermeiden Sie die inneren Brust- (Brust-) Arterien medial. Verwenden Sie einen Hämostat (siehe Tabelle der Materialien), um das untere Ende des Brustbeins zu greifen und es in Richtung des Kopfes des Tieres zu reflektieren, um die Brusthöhle freizulegen.
7. Identifizieren Sie den linken Ventrikel, der heller erscheint als der rechte Ventrikel. Fassen Sie das Herz vorsichtig mit stumpfer Pinzette und führen Sie die Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel ein.
   1. Verwenden Sie eine Schere oder eine 18-G-Nadel, um den rechten Vorhof zu punktieren, so dass Blut und Perfusionslösungen zum Abfluss in das Herz zurückkehren können. Stabilisieren Sie die Nadel mit ein oder zwei Händen und achten Sie darauf, dass Sie nicht versehentlich den rechten Ventrikel durchstechen und den Lungen- und nicht den systemischen Kreislauf durchbluten.
8. Öffnen Sie den Anschluss zur Spritze mit PBS und injizieren Sie manuell 2-4 ml mit einer Rate von 1-2 ml / min für 1-2 Minuten, um Blut aus dem Gefäßsystem zu spülen. Stellen Sie eine erfolgreiche Durchblutung sicher, indem Sie Blutungen aus dem rechten Vorhof beobachten. Schließen Sie nach der Injektion den Anschluss der PBS-Spritze.
9. Öffnen Sie den Anschluss zur Spritze mit DiI und injizieren Sie 5-10 ml mit einer Rate von 1-2 ml / min für 5 min. Überwachen Sie die Ohren, die Nase und die Handflächen, die sich mit der Injektion von DiI-Lösung leicht rosa färben sollten. Schließen Sie nach der Injektion den Anschluss der DiI-Spritze und warten Sie 2 Minuten, um die Aufnahme des Farbstoffs vor der Injektion des Fixiermittels zu ermöglichen.
10. Öffnen Sie den Anschluss zur Spritze mit Formalin und injizieren Sie 5-10 ml mit einer Rate von 1-2 ml / min für 5 min. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel aus dem linken Ventrikel und fahren Sie fort, das Gewebe von Interesse zu ernten.
11. Verteilen Sie mit einer schweren Schere das Schienbein am Knöchel und trennen Sie den linken und rechten Fuß vollständig vom Unterschenkel. Legen Sie die geernteten Füße in eine 6- oder 12-Well-Platte mit 1-2 ml 10% iger Formalinlösung. Den Teller mit Folie umwickeln und über Nacht bei 4 °C lagern.

6. Vorbereitung des Fußpolstergewebes für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

1. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Fixierlösung in einer 6- oder 12-Well-Platte durch 1-2 ml PBS pro Well.
2. Um den Fuß zu häuten, machen Sie zuerst einen Längseinschnitt mit einem Skalpell auf den plantaren und dorsalen Aspekten des Fußes. Entfernen Sie dann mit einer Zahnzange und einem kleinen Hämostat vorsichtig die gesamte Haut vom Fuß und den Fingern, ohne die darunter liegenden Weichteile zu beschädigen.
3. Fahren Sie mit der Montage und Bildgebung von Geweben fort, vorzugsweise innerhalb von 1-2 Tagen nach Perfusion und Ernte. Alternativ können Sie die Fußpolster auf 6- oder 12-Well-Platten mit 1-2 ml PBS zurückführen. mit Folie abdecken und bei 4 °C lagern, um die Fluoreszenz bis zu 1 Monat aufrechtzuerhalten.
4. Um Gewebe zu montieren, platzieren Sie die Füße einzeln zwischen zwei Glasmikroskopobjektträgern mit einem über sich selbst gefalteten Schaumbiopsie-Pad (ein- oder zweimal je nach Gewebedicke) an jedem Ende (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie zwei kleine Bindemittelclips, um die Glasschienen an jedem Ende (Endstärke ca. 1 mm) zu komprimieren.
   HINWEIS: Dickeres Gewebe erfordert längere Scanzeiten. Das gehäutete Fußpolster kann einen Tag vor der Bildgebung zwischen Glasobjektträgern zusammengedrückt werden, um die Gewebedicke zu reduzieren.

7. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

1. Bereiten Sie sich auf die Imaging-Sitzung vor: Schalten Sie das Imaging-System ein und starten Sie die Erfassungssoftware (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung und niedriger numerischer Blende (z. B. x5/0,15), um Bilder aufzunehmen, da Objektive mit geringerer Vergrößerung in der Regel längere Arbeitsabstände aufweisen, die für dieses Experiment erforderlich sind.
2. Klicken Sie im Dialogfenster Bühne aktivieren auf Ja. Aktivieren Sie den 561-nm-Laser auf der Registerkarte Konfiguration. Aktivieren Sie auf dem Hauptbildschirm einen sichtbaren Balkenpfad, indem Sie auf die Schaltfläche Sichtbar klicken. Stellen Sie einen Detektor auf den Bereich von 570-600 nm ein, indem Sie auf das entsprechende Kontrollkästchen Aktiv klicken.
3. Wählen Sie das Symbol Kachelscan auf der Registerkarte > Erfassung erfassen und legen Sie die gewünschte Auflösung fest (512 x 512 oder 1024 x 1024).
4. Positionieren Sie trocken montierte (ohne Wasser oder PBS hinzugefügte) Gewebeprobe, die zwischen Glasobjektträgern komprimiert ist, auf dem Mikroskoptisch und bringen Sie das Gewebe in den Fokus.
5. Um die Scangrenzen festzulegen, navigieren Sie zur oberen linken oder rechten Ecke des Beispiels. Klicken Sie auf der Registerkarte Erfassung im Menü Kachelscan auf die Schaltfläche Position markieren . Navigieren Sie zur gegenüberliegenden Ecke (unten rechts bzw. links) und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Position markieren .
6. Um die Tiefe des Z-Stacks festzulegen, klicken Sie auf die Schaltfläche Live in der unteren linken Ecke des Bildschirms und navigieren Sie zur Mitte des Beispiels. Verwenden Sie den Knopf der z-Achse, um zum Ende des Beispiels durchzublättern.
7. Klicken Sie auf der Registerkarte Akquisition im Menü Z-Stack auf die Schaltfläche Beginn . Scrollen Sie zum Anfang des Beispiels und klicken Sie auf die Schaltfläche Ende . Klicken Sie auf Z-step Size und stellen Sie den gewünschten Wert (z.B. 50 μm) ein.
8. Klicken Sie in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auf Start , um mit der Bildaufnahme zu beginnen.

8. Quantitative Analyse und 3D-Rekonstruktion der Vaskularität des Fußpolsters

1. Laden Sie die neueste Version von Fidschi (ImageJ) sowie das Vessel Analysis ^plugin20 herunter und installieren Sie sie. Öffnen Sie Mikroskopie-Bilddateien in Fidschi, die einzelne Z-Serien zu Z-Stacks kombinieren, die in der Z-Achse mit dem Schieberegler am unteren Rand des Bildes angezeigt werden können.
2. Wählen Sie das zusammengesetzte Z-Stack-Bild aus und wählen Sie dann unter dem Menü Image die Option Stacks > Z-Projekt , um eine zweidimensionale Projektion zu erstellen. Als nächstes konvertieren Sie die Z-Projektion in binär unter Process > Binary > Make Binary.
3. Führen Sie das Vascular Density Plugin unter Plugins > Vascular Density aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, verwenden Sie den Cursor, um einen ROI um den Umfang des Footpads und der Ziffern zu verfolgen. Beachten Sie die gemeldete Gefäßdichte, die als Prozentsatz des ROI (Gefäßflächenfraktion) ausgedrückt wird.
4. Um 3D-Rekonstruktionen in Fidschi zu erstellen, wählen Sie Stapel > 3D-Projekt und legen Sie die gewünschte Rotationsachse, den Winkel und die Geschwindigkeit unter dem Menü Bild fest. Alternativ können Sie im Menü Plugins die Option Volume Viewer auswählen, um Bilder als Slices zu visualisieren oder die Rekonstruktion in den gewünschten Achsen zu bearbeiten.
5. Für ein komplexeres 3D-Rendering verwenden Sie alternative Bildanalyse- und Verarbeitungssoftware (siehe Materialverzeichnis). Konvertieren Sie Dateien in das gewünschte Softwareformat und stitchen Sie einzelne Kachelscans mit der Kachelnähfunktion.
6. Nachdem Sie einzelne Kachelscans zusammengenäht haben, öffnen Sie die zusammengesetzte Datei und fahren Sie mit dem Rendern der Volumenoberfläche fort. Klicken Sie auf Neues Surface hinzufügen , um den Surface Creation Wizard zu öffnen und mit den Pfeilen durch die Menüs zu wechseln, insbesondere durch die Einstellung des ROI und der Schwellenwertintensität. Sobald Sie mit dem Oberflächenrendering zufrieden sind, können Sie die Animationsfunktion nutzen, um Videos des verarbeiteten Bildes zu erstellen.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges Mittel zur Induktion von Ischämie und Gewebeverlust im murinen Fußpolster unter Verwendung einer Kombination aus Oberschenkelarterie und Venenkoagulation mit L-NAME-Verabreichung, einem Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmer, bei anfälligen FVB-Mäusen. Abbildung 1 zeigt die Anatomie der vaskulatur der murinen Hinterbeine und zeigt die Stellen der Oberschenkelarterie und der Venengerinnung (gelbes X), nur proximal zur lateralen zirkumflexen Obersc...

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Diskussion

Während die Ischämie der Maus-Hintergliedmaßen das am weitesten verbreitete präklinische Modell zur Untersuchung der Neovaskularisation bei PAD und CLTI ist, gibt es signifikante Unterschiede in der Schwere und Genesung der Ischämie, abhängig von dem spezifischen verwendeten Mausstamm und der Stelle, Anzahl und Methode der arteriellen Störung. Die Kombination aus Femurarterieligatur und IP-Verabreichung von L-NAME kann bei FVB-Mäusen zuverlässig Gangrän der Hintergliedmaßen ^{induzieren11.}

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binder clips (small)	Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)	VWR	10148-584
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D282
Electrocautery device	Gemini Cautery System	5917
Ethanol (100%)	VWR	89370-084
Fiji (ImageJ) software	NIH		Used version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy pads	Fisher Scientific	22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)	VWR	89370-094
FVB mice	Jackson Laboratory	001800
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HCl (1 M)	Sigma-Aldrich	13-1700
Imaris software	Oxford Instruments		Used version 9.6.0.
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-04
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)	Sigma-Aldrich	N5751
Laser Doppler perfusion imager	MoorLDI	moorLDI2-HIR	Used moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	VWR	48311-703
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaOH	Sigma-Aldrich	S8263
Needles (27 G)	BD	305109
Povidone-iodine swabstick (10%)	Medline	MDS093901ZZ
Surgical instruments	Roboz Surgical		Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)	DemeTECH	G275017B0P
Syringes (10 mL)	BD	305482
Three-way stopcocks	Cole-Parmer	19406-49
Vascular Analysis Plugin			Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine