JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает уникальную, клинически значимую модель заболевания периферических артерий, которая сочетает электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота для индуцирования гангрены задних конечностей у мышей FVB. Внутрисердечная перфузия DiI затем используется для трехмерной визуализации сосудов подножки с высоким разрешением.

Аннотация

Заболевание периферических артерий (PAD) является значительной причиной заболеваемости, возникающей в результате хронического воздействия атеросклеротических факторов риска. Пациенты, страдающие от его наиболее тяжелой формы, хронической угрожающей конечностям ишемии (ХМТ), сталкиваются с существенными нарушениями повседневной жизни, включая хроническую боль, ограниченное расстояние ходьбы без боли и незаживающие раны. Доклинические модели были разработаны на различных животных для изучения PAD, но ишемия задних конечностей мыши остается наиболее широко используемой. В этих моделях могут быть значительные различия в реакции на ишемическое оскорбление в зависимости от используемого штамма мыши, а также от места, количества и средств нарушения артериальной артерии. Этот протокол описывает уникальный метод, сочетающий электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота (NOS) для надежного индуцирования гангрены подножки у мышей Friend Virus B (FVB), что напоминает потерю тканей CLTI. В то время как традиционные средства оценки реперфузии, такие как лазерная допплеровская перфузионная визуализация (LDPI), по-прежнему рекомендуются, внутрисердечная перфузия липофильного красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат (DiI) используется для маркировки сосудистой системы. Последующая конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с высоким разрешением позволяет проводить трехмерную (3D) реконструкцию сосудистых сетей подножки, что дополняет традиционные средства оценки реперфузии в моделях ишемии задних конечностей.

Введение

Заболевание периферических артерий (PAD), характеризующееся снижением притока крови к конечностям из-за атеросклероза, поражает 6,5 миллиона человек в Соединенных Штатах и 200 миллионов человек во всем мире1. Пациенты с PAD испытывают снижение функции конечностей и качества жизни, а пациенты с CLTI, наиболее тяжелой формой PAD, подвергаются повышенному риску ампутации и смерти с 5-летней смертностью, приближающейся к 50%2. В клинической практике пациенты с голеностопно-плечевыми индексами (ABI) <0,9 считаются имеющими PAD, а пациенты с ABI <0,4, связанными либо с болью в покое, либо с потерей тканей, как имеющие CLTI3. Симптомы варьируются среди пациентов с аналогичными ИБИ в зависимости от повседневной активности, мышечной толерантности к ишемии, анатомических вариаций и различий в коллатеральном развитии4. Гангрена пальцев и конечностей является наиболее тяжелым проявлением всех сосудистых окклюзионных заболеваний, которые приводят к ХЛМ. Это форма сухого некроза, которая мумифицирует мягкие ткани. Помимо атеросклеротической PAD, она также может наблюдаться у больных сахарным диабетом, васкулитами, такими как болезнь Бюргера и феномен Рейно, или кальцифилаксией в условиях терминальной стадии почечной недостаточности5,6.

Было разработано несколько доклинических моделей для изучения патогенеза PAD/ CLTI и проверки эффективности потенциальных методов лечения, наиболее распространенным из которых остается ишемия задних конечностей мышей. Индуцирование ишемии задних конечностей у мышей обычно осуществляется путем обструкции кровотока из подвздошных или бедренных артерий, либо путем перевязки швов, электрокоагуляции или других средств сужения желаемого сосуда7. Эти методы резко уменьшают перфузию до задней конечности и стимулируют неоваскуляризацию в мышцах бедра и икр. Однако существуют существенные зависящие от штамма мышей различия в чувствительности к ишемическому инсульту, частично обусловленные анатомическими различиями в коллатеральном распределении8,9. Например, мыши C57BL/6 относительно устойчивы к ишемии задних конечностей, демонстрируя снижение функции конечностей, но, как правило, отсутствие признаков гангрены в подушечке ноги. С другой стороны, мыши BALB/c по своей природе имеют плохую способность восстанавливаться после ишемии и обычно развивают аутоампутацию стопы или голени только после перевязки бедренной артерии. Эта тяжелая реакция на ишемию сужает терапевтическое окно и может препятствовать продольной оценке реперфузии и функции конечностей. Интересно, что генетические различия в одном количественном локусе признака, расположенном на мышиной хромосоме 7, были вовлечены в эти дифференциальные восприимчивости мышей C57BL/6 и BALB/c к некрозу тканей и реперфузии конечностей10.

По сравнению со штаммами C57BL/6 и BALB/c, мыши FVB демонстрируют промежуточный, но непоследовательный ответ только на перевязку бедренной артерии. У некоторых животных развивается гангрена ног в виде черных ишемических ногтей или мумифицированных пальцев, а у других без каких-либо явных признаков ишемии11. Одновременное введение Nω-nitro-L-аргинина метилового эфира гидрохлорида (L-NAME), ингибитора синтазы оксида азота (NOS)12, предотвращает компенсаторные сосудорасширяющие механизмы и еще больше увеличивает окислительный стресс в ткани задних конечностей. В сочетании с перевязкой или коагуляцией бедренной артерии этот подход последовательно вызывает потерю ткани подножки у мышей FVB, которая напоминает атрофические изменения CLTI, но редко прогрессирует до аутоампутации конечностей11. Окислительный стресс является одной из отличительных черт PAD/CLTI и распространяется эндотелиальной дисфункцией и снижением биодоступности оксида азота (NO)13,14. NO представляет собой плюрипотентную молекулу, которая обычно оказывает благотворное влияние на артериальный и капиллярный кровоток, адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также рекрутирование и активацию лейкоцитов13. Было также показано, что пониженные уровни NOS активируют ангиотензинпревращающий фермент, который индуцирует окислительный стресс и ускоряет прогрессирование атеросклероза15.

После того, как модель ишемии задних конечностей установлена, необходим мониторинг последующей реперфузии конечностей и терапевтического эффекта любых потенциальных методов лечения. В предложенной модели гангрены мышей степень потери тканей может быть сначала количественно определена с использованием оценки Фабера для оценки грубого внешнего вида стопы (0: нормальная, 1-5: потеря ногтей, где оценка представляет собой количество пораженных ногтей, 6-10: атрофия пальцев, где оценка представляет количество пораженных цифр, 11-12: частичная и полная атрофия стопы, соответственно)9. Количественные измерения перфузии задних конечностей затем обычно производятся с использованием LDPI, который опирается на доплеровские взаимодействия между лазерным светом и эритроцитами для указания перфузии на уровне пикселей в интересующей области (ROI)16. Хотя этот метод является количественным, неинвазивным и идеально подходит для повторных измерений, он не обеспечивает зернистую анатомическую детализацию сосудистой системы задних конечностей16. Другие методы визуализации, такие как микрокомпьютерная томография (микро-КТ), магнитно-резонансная ангиография (МРА) и рентгеновская микроангиография, оказываются либо дорогостоящими, требующими сложных инструментов, либо иным образом технически сложными16. В 2008 году Li et al. описали технику маркировки кровеносных сосудов в сетчатке липофильным карбоцианиновым красителем DiI17. DiI включается в эндотелиальные клетки и путем прямой диффузии окрашивает сосудистые мембранные структуры, такие как ангиогенные ростки и псевдоподальные процессы17,18. Благодаря его прямой доставке в эндотелиальные клетки и высокофлуоресцентной природе красителя, эта процедура обеспечивает интенсивную и длительную маркировку кровеносных сосудов. В 2012 году Boden et al. адаптировали технику перфузии DiI к модели ишемии задних конечностей мышей с помощью полной визуализации собранных мышц-аддукторов бедра после перевязки бедренной артерии19.

Текущий метод обеспечивает относительно недорогой и технически осуществимый способ оценки неоваскуляризации в ответ на ишемию заднего края и генную или клеточную терапию. В дальнейшей адаптации этот протокол описывает применение перфузии DiI для изображения сосудистой системы подножки в высоком разрешении и 3D в мышиной модели гангрены задних конечностей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных, описанные в протоколе, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Майами (IACUC). Для исследования использовались мыши FVB, как самцы, так и самки, в возрасте 8-12 недель.

1. Приготовление раствора L-NAME

  1. В стерильных условиях в ламинарной проточной вытяжке приготовьте раствор L-NAME, растворив 1 г порошка L-NAME (см. Таблицу материалов) в 20 мл стерильной воды для получения 50 мг/мл раствора. Хранить раствор в 300-500 мкл аликвот при -20 °C до 3 месяцев.
  2. Чтобы получить рабочий раствор L-NAME, разморозьте аликвоту раствора L-NAME и разбавьте PBS (1:4) в стерильных условиях для получения окончательной концентрации 10 мг/мл.
  3. Для приготовления PBS (рН 7,4) растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4 и 0,23 г NaH2PO4 в 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl. Добавьте воду до общего объема 1000 мл и фильтруйте через верхний фильтр бутылки 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрибрюшинная (IP) инъекция 4 мкл/г рабочего раствора L-NAME эквивалентна желаемой дозе L-NAME 40 мг/кг. Рабочий раствор L-NAME следует держать на льду во время использования, а новые разведения следует производить ежедневно, используя свежеотмороженные аликвоты запасного раствора.

2. Химическая и хирургическая индукция гангрены задних конечностей

  1. Получите мышей FVB в возрасте 8-12 недель либо от заводчика, либо выведенных на объекте (см. Таблицу материалов). За 2 ч до операции вводят дозу L-NAME 40 мг/кг IP.
  2. Обезболивать мышей иП-инъекцией 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина (см. Таблицу материалов), разбавленной в PBS. Подтвердите адекватную седацию отсутствием рефлекса защемления пальцев ног и продолжайте контролировать частоту дыхания во время процедуры.
    1. Удалите волосы с двусторонних задних конечностей и паха с помощью ножниц и / или крема для депиляции. Расположите животное под хирургическим микроскопом лежа на спине; вытянуть и заклеить конечности на месте. Стерилизуют хирургическое поле путем окружного нанесения раствора повидона-йода на место операции.
  3. Под 10-20-кратным увеличением используйте ножницы или скальпель, чтобы сделать разрез 1 см вдоль паховой складки, чуть ниже паховой связки. Используйте тонкие щипцы и стерильный аппликатор хлопчатобумажного наконечника, чтобы тупо рассекнуть паховую жировую подушку сбоку от паховой связки и обнажить подлежащую бедренную оболочку, чтобы бедренная артерия, вена и нерв были четко идентифицированы (рисунок 1).
  4. С помощью тонких щипцов проткните бедренную оболочку. Осторожно отмахните бедренный нерв от бедренной артерии. Определите взлет боковой циркумфлексной ветви бедренной артерии (LCFA) глубоко к бедренному нерву (рисунок 1).
    1. Продолжайте электрокоагуляцию бедренной артерии и вены непосредственно проксимально к LCFA, активируя устройство прижигания (см. Таблицу материалов) и осторожно контактируя с сосудами движением из стороны в сторону, гарантируя, что бедренный нерв хорошо изолирован и остается защищенным от термического повреждения. Разделите свернутый сегмент сосуда ножницами.
  5. Приступают к обнажению дистальной бедренной артерии и вены путем мобилизации паховой жировой подушки медиально. Выявляют поверхностную эпигастральную артерию и сафенополитный узел более дистально.
    1. Проткните бедренную оболочку между этими двумя местами и тщательно рассекните бедренный нерв от бедренных сосудов. Продолжайте свертывание и трансекцию бедренной артерии и вены, как описано на этапе 2.4.1.
  6. Орошайте хирургическое поле с помощью шприца, заполненного стерильным PBS. Получить гемостаз можно путем мягкого надавливания аппликатором хлопкового наконечника в течение 3-5 мин на любые участки кровотечения.
    1. Приступайте к закрытию разреза с помощью рассасывающегося шва 5-0 простым непрерывным способом. Вводят 1 мг/кг подкожной дозы бупренорфина с пролонгированным высвобождением (см. Таблицу материалов) для послеоперационного обезболивания.
  7. Подтвердите потерю перфузии подножки в лигированной задней конечности LDPI (см. Таблицу материалов). Пока животное все еще обезболено, поместите животное на темную поролоновую подушку в положение лежа под машиной LDPI и используйте петли электрической ленты, чтобы закрепить ноги на месте.
    1. Приступайте к LDPI двусторонних ног. После завершения сканирования нарисуйте рентабельность инвестиций вокруг каждой подножки и получите средние значения потока.
    2. Рассчитайте индекс перфузии как отношение средних значений потока от лигированной к нелигированной подножке. Убедитесь, что индекс перфузии меньше 0,1.
  8. Переместите животное обратно в чистую клетку с грелкой или верхней лампой для поддержания температуры тела. Обеспечьте полное восстановление после анестезии перед переводом мышей обратно в учреждение для животных.

3. Послеоперационное введение L-NAME и мониторинг гангрены задних конечностей

  1. В послеоперационные дни 1-3 вводят дополнительно 40 мг/кг IP дозы L-NAME каждому животному. При этом внимательно оцените стопу от ишемической конечности.
  2. Количественно оцените степень ишемии заднего конечного сустава и гангрены, используя показатель ишемии заднего конечности Фабера9. Баллы 1-5: количество ишемических ногтей; баллы 6-10: 1-5 ишемических цифр; баллы 11 и 12: частичная и полная атрофия стопы. Записывайте оценки Фабера в послеоперационные дни 1-3, а затем еженедельно.

4. Приготовление DiI и рабочих растворов для перфузии животных

  1. Для приготовления раствора DiI растворите 100 мг кристаллов DiI (см. Таблицу материалов) в 16,7 мл 100% этанола. Накрыть алюминиевой фольгой и оставить на качающейся платформе на ночь в темноте при комнатной температуре.
  2. Для приготовления разбавителя растворите 50 г глюкозы в 1000 мл дистиллированной воды с получением 5% раствора глюкозы. Фильтруйте через верхний фильтр для бутылок толщиной 0,22 мкм. Смешайте PBS и 5% растворы глюкозы в соотношении 1:4 для приготовления рабочего раствора разбавителя.

5. Настройка оборудования и перфузия DiI

  1. Сделайте DiI рабочим раствором, добавив 200 мкл раствора DiI к 10 мл рабочего раствора разбавителя (приготовленного на этапе 4.2) непосредственно перед использованием. Встряхните вручную, чтобы хорошо перемешать.
  2. Соедините два или три 3-позиционных запорных крана и иглу бабочки 25 G последовательно. Приготовьте шприцы 10 мл с 4 мл PBS, 10 мл раствора DiI и 10 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (см. Таблицу материалов).
  3. Подключите шприц с формалином к проксимальному входному отверстию и введите раствор для промывки воздуха из линии; поверните запорный кран, чтобы закрыть порт. Повторите ту же процедуру последовательно, соединив шприцы с DiI, а затем PBS со средним и дистальным входными портами соответственно, позаботившись о том, чтобы промыть все пузырьки воздуха через узел запорного крана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в любой части запорного крана или трубки нет пузырьков воздуха. Пузырьки воздуха могут закупоривать мелкие артерии во время перфузии, что приводит к плохому внутрисосудистому распределению DiI и нарушению результатов визуализации.
  4. Как только установка будет завершена, усыпьте животное передозировкой CO2 в индукционной камере.
  5. Поместите животное для перфузии в положение лежа на спине на абсорбирующей прокладке и закрепите подмышечные и нижние конечности иглами.
  6. С помощью ножниц сделайте поперечный разрез, чтобы открыть брюшную полость. Обнажите, а затем разделите левую и правую диафрагму для доступа к грудной полости.
    1. Отрежьте стенку грудной клетки по обе стороны грудины от нижних ребер до первого или второго ребер, избегая внутренних грудных (молочных) артерий медиально. Используйте гемостат (см. Таблицу материалов), чтобы захватить нижний конец грудины и отразить его к голове животного, чтобы обнажить грудную полость.
  7. Определите левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый желудочек. Осторожно обхватите сердце тупыми щипцами и вставьте иглу бабочки в левый желудочек.
    1. Используйте ножницы или иглу весом 18 г, чтобы проколоть правое предсердие, позволяя крови и перфузионным растворам возвращаться к сердцу для дренажа. Стабилизируйте иглу одной или двумя руками, следя за тем, чтобы случайно не проколоть правый желудочек и не перфузировать легочное, а не системное кровообращение.
  8. Откройте порт к шприцу с PBS и вручную введите 2-4 мл со скоростью 1-2 мл/мин в течение 1-2 мин для вымывания крови из сосудистой системы. Обеспечьте успешную перфузию, наблюдая кровотечение из правого предсердия. После инъекции закройте порт шприца PBS.
  9. Откройте порт к шприцу с помощью DiI и введите 5-10 мл со скоростью 1-2 мл/мин в течение 5 мин. Следите за ушами, носом и ладонями, которые должны слегка порозоветь при инъекции раствора DiI. После инъекции закройте порт шприца DiI и подождите 2 мин, чтобы можно было внести краситель перед инъекцией фиксатора.
  10. Откройте порт к шприцу с формалином и введите 5-10 мл со скоростью 1-2 мл/мин в течение 5 мин. После инъекции извлеките иглу из левого желудочка и приступайте к сбору интересующих тканей.
  11. С помощью тяжелых ножниц вывихните большеберцовую кость на лодыжке, полностью отделив левую и правую ступни от голени. Поместите собранные ножки в 6- или 12-луночную плиту с 1-2 мл 10% раствора формалина. Оберните тарелку фольгой и храните при температуре 4 °C в течение ночи.

6. Подготовка ткани подушечки для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

  1. На следующий день замените фиксирующий раствор в 6- или 12-луночной пластине на 1-2 мл ПБС на скважину.
  2. Для снятия кожи стопы сначала делают продольный разрез скальпелем на подошвенном и спинном аспектах стопы. Затем, используя зубчатые щипцы и небольшой гемостат, аккуратно удалите всю кожу с стопы и пальцев, не повредив подлежащие мягкие ткани.
  3. Приступают к монтажу и визуализации тканей, желательно в течение 1-2 дней после перфузии и сбора урожая. В качестве альтернативы можно вернуть подножки на 6- или 12-луночные пластины с 1-2 мл PBS; покрыть фольгой и хранить при 4 °C для поддержания флуоресценции до 1 месяца.
  4. Для крепления тканей по отдельности поместите ножки между двумя предметными стеклами микроскопа с сложенной над собой пенопластовой биопсийной прокладкой (один или два раза в зависимости от толщины ткани) на каждом конце (см. Таблицу материалов). Используйте два небольших зажима для связующего, чтобы сжать стеклянные слайды вместе на каждом конце (окончательная толщина примерно 1 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые ткани потребуют более длительного времени сканирования. Подушечка для ног с кожей может быть сжата между стеклянными слайдами за один день до визуализации, чтобы уменьшить толщину ткани.

7. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

  1. Подготовьтесь к сеансу обработки изображений: включите систему обработки изображений и запустите программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов). Используйте объектив с низким увеличением / низкой числовой диафрагмой (например, x5 / 0,15) для захвата изображений, поскольку линзы с более низким увеличением обычно имеют более длинные рабочие расстояния, необходимые для этого эксперимента.
  2. Нажмите кнопку Да в диалоговом окне Активировать этап. Активируйте лазер 561 нм на вкладке Конфигурация. На главном экране активируйте видимый путь луча, нажав на кнопку Видимый . Установите детектор в диапазон 570-600 нм, нажав на соответствующий флажок Active .
  3. Выберите значок «Сканирование плитки» на вкладке «Получение > и задайте требуемое разрешение (512 x 512 или 1024 x 1024).
  4. Поместите сухо установленный (без добавления воды или PBS) образец ткани, сжатый между стеклянными слайдами на ступени микроскопа, и поместите ткань в фокус.
  5. Чтобы задать границы сканирования, перейдите в левый верхний или правый угол образца. На вкладке Приобретение в меню Сканирование плитки нажмите кнопку Пометить положение . Перейдите в противоположный угол (внизу справа или слева соответственно) и нажмите кнопку «Отметить позицию» еще раз.
  6. Чтобы задать глубину Z-стека, нажмите кнопку Live в левом нижнем углу экрана и перейдите к центру образца. Используйте ручку оси Z для прокрутки до нижней части образца.
  7. На вкладке Приобретение в меню Z-Stack нажмите кнопку Начать . Прокрутите образец до конца и нажмите кнопку Конец . Нажмите на Z-шаг Размер и установите нужное значение (например, 50 мкм).
  8. В правом нижнем углу экрана нажмите кнопку Пуск , чтобы начать получение изображения.

8. Количественный анализ и 3D реконструкция васкулярности подушечки стопы

  1. Загрузите и установите последнюю версию Fiji (ImageJ), а также плагин Vessel Analysis20. Откройте файлы изображений микроскопии на Фиджи, которые объединят отдельные Z-серии в Z-стеки, которые можно просматривать по оси Z с помощью ползунка в нижней части изображения.
  2. Выберите составное изображение Z-стека, а затем в меню Изображение выберите Стеки > Z Project , чтобы создать двумерную проекцию. Затем преобразуйте Z-проекцию в двоичный в разделе Process > Binary > Make Binary.
  3. Запустите плагин «Плотность сосудов» в разделе «Плагины > «Плотность сосудов». При появлении запроса используйте курсор для трассировки ROI по периметру подножки и цифр. Обратите внимание на сообщаемую плотность сосудов, которая выражается в процентах от ROI (фракция сосудистой области).
  4. Чтобы создать 3D-реконструкции на Фиджи, выберите Стеки > 3D Project и задайте нужную ось поворота, угол и скорость в меню Изображение. Кроме того, выберите Volume Viewer в меню «Плагины», чтобы визуализировать изображения в виде фрагментов или манипулировать реконструкцией по нужным осям.
  5. Для более сложного 3D-рендеринга используйте альтернативное программное обеспечение для анализа и обработки изображений (см. Таблицу материалов). Конвертируйте файлы в нужный формат программного обеспечения и сшивайте отдельные сканы плиток с помощью функции сшивания плиток.
  6. После сшивания отдельных сканов плиток откройте составной файл и приступайте к рендерингу объемной поверхности. Щелкните Добавить новую поверхность , чтобы открыть мастер создания surface, и используйте стрелки для переключения между меню, в частности, для настройки рентабельности инвестиций и пороговой интенсивности. После того, как вы удовлетворены рендерингом поверхности, используйте функциональность анимации для создания видео обработанного изображения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом протоколе подробно описывается надежное средство индуцирования ишемии и потери тканей в подножке мышей с использованием комбинации коагуляции бедренной артерии и вены с введением L-NAME, ингибитором синтазы оксида азота, у восприимчивых мышей FVB. На рисунке 1 подро...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В то время как ишемия задних конечностей мышей является наиболее широко используемой доклинической моделью для изучения неоваскуляризации при PAD и CLTI, существуют значительные различия в тяжести и восстановлении ишемии в зависимости от конкретного используемого штамма мыши, а также м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Z-J L и OC V от Национальных институтов здравоохранения [R01HL149452 и VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Мы также благодарим Центр микроскопии и визуализации Проекта Майами по лечению паралича в Медицинской школе Университета Майами за предоставление доступа к их программному обеспечению для анализа и обработки изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Binder clips (small)Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)VWR10148-584
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)InvitrogenD282
Electrocautery deviceGemini Cautery System5917
Ethanol (100%)VWR89370-084
Fiji (ImageJ) softwareNIHUsed version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy padsFisher Scientific22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)VWR89370-094
FVB miceJackson Laboratory001800
GlucoseSigma-AldrichG7528
HCl (1 M)Sigma-Aldrich13-1700
Imaris softwareOxford InstrumentsUsed version 9.6.0.
IsofluranePivetalNDC 46066-755-04
KClSigma-AldrichP9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)Sigma-AldrichN5751
Laser Doppler perfusion imagerMoorLDImoorLDI2-HIRUsed moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)VWR48311-703
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaOHSigma-AldrichS8263
Needles (27 G)BD305109
Povidone-iodine swabstick (10%)MedlineMDS093901ZZ
Surgical instrumentsRoboz SurgicalFine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)DemeTECHG275017B0P
Syringes (10 mL)BD305482
Three-way stopcocksCole-Parmer19406-49
Vascular Analysis PluginFree download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine

Ссылки

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  2. Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
  3. Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
  4. Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
  5. Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
  6. Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
  7. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035(2009).
  8. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  9. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  10. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  11. Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
  12. Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
  13. Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
  14. McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
  15. Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
  16. Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
  17. Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
  19. Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
  20. Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106(2015).
  21. Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  22. Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
  23. Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
  24. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166(2016).
  25. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
  26. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
  27. Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047(2013).
  28. Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181L NAMEDiI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены