تحليل مجهري بالفيديو عالي السرعة لتشخيص الخط الأول لخلل الحركة الهدبوجي الأولي

Summary

يعد التحليل المجهري بالفيديو عالي السرعة أداة سهلة الأداء نسبيا وسريعة وفعالة من حيث التكلفة ، وفي أيدي ذوي الخبرة ، أداة موثوقة إلى حد كبير لتشخيص الخط الأول لخلل الحركة الهدبي الأولي ، والتي يجب أن تكون متاحة في كل مركز يشارك في التشخيص وعلاج أمراض الرئة الشديدة.

Abstract

خلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) هو اضطراب خلقي موروث في الغالب في سمة جسمية متنحية. يسبب هذا الاضطراب اضطرابا في حركة الأهداب ، مما يؤدي إلى ضعف شديد في إزالة الغشاء المخاطي الهدبي (MCC). إذا لم يتم تشخيصها أو تشخيصها بعد فوات الأوان ، فإن الحالة تؤدي إلى تطور توسع الشعب الهوائية وأضرار جسيمة للرئتين في وقت لاحق من الحياة. معظم طرق تشخيص PCD تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موارد اقتصادية واسعة النطاق لإنشائها. تحليل الفيديو المجهري عالي السرعة (HSVMA) هو الأداة التشخيصية الوحيدة لتصور وتحليل خلايا الجهاز التنفسي الحية مع ضرب الأهداب في المختبر. إنه سريع وفعال من حيث التكلفة ، وفي أيدي ذوي الخبرة ، موثوق به للغاية كأداة تشخيصية ل PCD. بالإضافة إلى ذلك ، لا تنطبق التدابير التشخيصية الكلاسيكية مثل المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) على بعض الطفرات لأن التغيرات المورفولوجية غائبة.

تصف هذه الورقة عملية جمع الخلايا الظهارية التنفسية ، ومزيد من التحضير للعينة ، وعملية HSVMA. كما نصف كيف يمكن الحفاظ على الخلايا المصقولة بنجاح دون أذى أو ضرب عن طريق الاحتفاظ بها في وسط مغذي للتخزين والنقل إلى موقع التحقيق في الحالات التي لا تمتلك فيها العيادة المعدات اللازمة لإجراء HSVMA. كما تظهر مقاطع فيديو تحتوي على أنماط ضرب مرضية من المرضى الذين يعانون من طفرة في جين سلسلة ذراع الداينين الثقيلة 11 (DNAH11) ، والتي لا يمكن تشخيصها ب TEM. نتيجة ل HSVMA غير حاسم بسبب عدوى الشعب الهوائية العليا ، وكذلك تنظيف الأسنان بالفرشاة غير الناجحة مع تراكب خلايا الدم الحمراء. مع هذه المقالة ، نود أن نشجع كل وحدة تتعامل مع مرضى أمراض الرئة وأمراض الرئة النادرة على إجراء HSVMA كجزء من تشخيصاتهم الروتينية اليومية ل PCD أو إرسال العينات إلى مركز متخصص في أداء HSVMA.

Introduction

خلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) هو اضطراب وراثي وراثي نادر ، والذي يسبب اضطرابات في حركة أهداب الضرب. إذا لم يتم تشخيصه ، فإنه يؤدي إلى تلف شديد في الرئة في وقت لاحق من الحياة بسبب ضعف شديد في MCC. في الماضي ، قدر انتشاره في حدود 1: 4000 إلى 50000. نظرا للتحسن المطرد في التشخيص والوعي المتزايد بالحالة ، تشير التحديثات حول انتشار PCD إلى أنه قد يكون أكثر شيوعا وربما يتراوح بين 1: 4000 إلى 20000 بدلا من^1.2. ومع ذلك ، لا يزال المرضى الذين يعانون من PCD يعانون من نقص التشخيص أو التشخيص في وقت متأخر جدا ^1,3. لذلك ، يجب أن يكون الرضع الذين يعانون من أي من السيتوس الخلقي في مقابل و / أو سيلان الأنف في الفترة المحيطة بالولادة ، والضائقة التنفسية لحديثي الولادة ، وانسداد الأنف ، وصعوبات التغذية مشتبها بهم في PCD. في وقت لاحق من الحياة ، التهاب الأذن الوسطى المزمن ، والالتهاب الرئوي المتكرر ، والتهاب الجيوب الأنفية الأنفية ، والسعال الرطب المزمن النموذجي بسبب ضعف MCC هي الأعراض المميزة ل PCD ، والتي في تركيبة مع توسع الشعب الهوائية وضعف وظائف الرئة ، تستمر في مرحلة البلوغ².

يمكن تشخيص المرضى المشتبه في إصابتهم ب PCD باستخدام أدوات تشخيصية مختلفة. وقد اعتبر TEM المعيار الذهبي لتشخيص الخط الأول في الماضي. ومع ذلك ، فإن ما يصل إلى 30٪ من حالات PCD لا تظهر بنية فائقة غير طبيعية¹،³،⁴،⁵،^{6 ،} مما يتطلب نهجا تشخيصيا مختلفا. لذلك ، يقترح عدد متزايد من المراكز والمبادئ التوجيهية للجمعية الأوروبية للجهاز التنفسي (ERS) مزيجا من أكسيد النيتريك الأنفي (nNO) و HSVMA كتشخيص الخط الأول^1،7،^9،10. HSVMA و nNO هي أيضا الخيارات الأكثر فعالية من حيث التكلفة في تحديد المريض المصاب ب PCD¹¹. ومع ذلك ، حتى لو تم تضمين الاختبارات الجينية في التشخيص ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه لا يوجد حاليا اختبار قائم بذاته أو مجموعة من الاختبارات التي يمكن أن تستبعد PCD مع اليقين بنسبة 100٪ ^8,9,10.

من بين خيارات التشخيص المتاحة ، يعد HSVMA هو الاختبار الوحيد الذي يركز على الخلايا التنفسية الحية المغلفة بالأهداب ويقيم نمط الضربات الهدبية (CBP) وتردد الضربات الهدبية (CBF). على النقيض من TEM ، تتوفر نتائج HSVMA بسرعة ، عادة في يوم الاختبار ، في حين أن نتائج TEM قد تصل بعد أشهر من أخذ العينة. يمكن تطبيق HSVMA لجميع الفئات العمرية ، في حين أن nNO يتطلب درجة عالية من الامتثال ؛ عادة ما تكون محاولات استخدامه تحت سن 5 سنوات غير ناجحة¹⁰. في أيدي ذوي الخبرة ، HSVMA لديه حساسية ممتازة وخصوصية لتشخيص PCD بنسبة 100 ٪ و 96 ٪ ، على التوالي¹².

تصف هذه الورقة الإجراء خطوة بخطوة لأداء HSVMA ، بما في ذلك حصاد خلايا الجهاز التنفسي المغلفة بالأهداب من التوربينات السفلية للأنف ، والحفاظ على الخلايا المحصودة في وسط مغذي للخلايا لنقلها إلى موقع التحقيق ، وعملية تحليل الفيديو المجهري لتحديد CBF و CBP. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض بعض مقاطع الفيديو من المرضى ، مقارنة CBPs العادية و CBFs مع وظيفة الأهداب غير الطبيعية (الفيديو 3 ، الفيديو 4 ، الفيديو 5 ، الفيديو 6 ، الفيديو 7 ، والفيديو 8).

Protocol

بيان الأخلاقيات:

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (69/2017) وأجريت وفقا لإعلان هلسنكي.

1. جمع ونقل الخلايا الظهارية التنفسية

1. الفرشاه
   1. قبل تنظيف الأسنان بالفرشاة ، قم بإعطاء دورة لمدة أسبوعين من حمض الأموكسيسيلين كلافولانيك الفموي للمريض للقضاء على الأغشية الحيوية التي تتداخل مع وظيفة الأهداب. تأكد من إنهاء المضاد الحيوي قبل 2 أيام من الإجراء.
   2. لتقليل تراكب المواد المخاطية على شرائط الخلايا الظهارية المصقولة ، اطلب من المريض أن ينفخ أنفه جيدا. اطلب من الآباء مساعدة أطفالهم الصغار على نفخ أنوفهم.
   3. للتنظيف بالفرشاة، استخدم فرشاة بين الأسنان بحجم 0.6 مم (انظر جدول المواد). حافظ على رأس المريض ثابتا بيد واحدة ، وباليد الأخرى ، قم بتنظيف التوربينات السفلية لكلا الخياشيم لجمع شرائط الخلايا الظهارية الكافية.
      ملاحظة: عادة ما تحدث مقاومة طفيفة عند إدخال الفرشاة بين الأسنان بعمق تحت التوربينات السفلية. يتم تنظيف الأنف بالفرشاة عن طريق الدوران السريع والانتقاء لمدة 2 ثانية تقريبا. قد يؤدي التنظيف بالفرشاة لفترة أطول ومكثفة إلى إصابة ظهارية شديدة ورعاف متتالي.
   4. إذا تم التخطيط لتنظير القصبات لأسباب أخرى غير PCD المشتبه به ، فقم بجمع عينات أثناء تنظير القصبات عن طريق تنظيف الكارينا أو ظهارة الشعب الهوائية أو عن طريق الخزعة¹³.
   5. قم بإسقاط شرائط الخلايا التي تم حصادها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على وسيط النسر المعدل من دولبيكو المغذي للخلايا (DMEM).
      ملاحظة: عادة ما تسقط شرائط الخلايا الظهارية من الفرشاة بسهولة أكبر عن طريق قذف الفرشاة وقلبها على جدار الأنبوب.
   6. أغلق غطاء أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق وأمسك الأنبوب بمصدر ضوء. هز الأنبوب لاكتشاف شرائط الخلايا والتكتلات التي تم حصادها.
2. نقل العينة
   1. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيق في صندوق بوليسترين مغلق بإحكام وتأكد من إغلاق غطاء الأنابيب بشكل صحيح وتثبيت الأنابيب داخل الصندوق.
   2. إضافة حزمة باردة. ومع ذلك ، تجنب تجميد العينة.
      ملاحظة: درجة الحرارة المثلى للحفاظ على العينة قبل التحقيق هي حوالي 4-8 درجة مئوية (39.2-46.4 درجة فهرنهايت).
   3. تأكد من تحليل العينات المحفوظة خلال ال 24 ساعة القادمة.
      ملاحظة: في هذه التجارب، كان متوسط الوقت بين التنظيف بالفرشاة وHSVMA 3 ساعات.

2. تحليل مجهري فيديو عالي السرعة (HSVMA)

1. الفحص المجهري بالفيديو للعينات
   1. بعد استلام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على العينات، قم بتسخينها حتى 37 درجة مئوية (98.6 درجة فهرنهايت) لمحاكاة مثالية في بيئة تشبه الجسم الحي.
   2. إذا كان المجهر مجهزا بوحدة تسخين ، فضع الأنابيب تحت غطاء المحرك وقم بتسخينها هناك. بدلا من ذلك ، استخدم حاضنة لتسخين العينات.
   3. ابدأ تشغيل الكاميرا وبرنامج وحدة الفيديو على جهاز الكمبيوتر.
   4. باستخدام ماصة ، خذ كمية صغيرة من العينة وضع قطرتين في طبق كوفيت أو طبق زجاجي (انظر جدول المواد). قم بتغطية الكوفيت أو الطبق بغطاء وضعه تحت المجهر.
   5. لتقييم العينات، استخدم مجهرا للتداخل التفاضلي مزودا بمصدر ضوء بارد وكاميرا فيديو قادرة على التسجيل بسرعة عالية (200 إطار/ثانية على الأقل). استخدم عدسة غمر الزيت مع تكبير 100x ووضع قطرة من زيت الغمر على سطح البصرية.
      ملاحظة: يوصى باستخدام المجاهر ذات العدسة التي تقترب من الأسفل.
   6. اقترب من الجزء السفلي من الطبق باستخدام عدسة المجهر وابحث عن مجموعات الخلايا بدون خلايا دم حمراء وذات محتوى مخاط منخفض. بعد العثور على منطقة تمثيلية ذات أهمية (ROI) ، ركز على مجموعة محددة من أهداب الضرب مع أكبر حركات الأهداب وسجل تسلسل فيديو. سجل الخلايا مع ضرب الأهداب جانبيا ومن الأعلى. بعد ذلك ، ابحث عن مجموعة تمثيلية أخرى من الخلايا وكرر التسجيل.
      ملاحظة: يجب التحقيق في الخلايا المغلفة بالأهداب تحت تكبير 1000x ، ويجب تسجيل أهداب الضرب باستخدام كاميرا فيديو رقمية عالية السرعة (DHSV) تم ضبطها على معدل إطارات 200 / ثانية أو أكثر (256 / ثانية في هذا البروتوكول). نظرا لأن البيانات التي تم الحصول عليها من مقاطع الفيديو المسجلة تتطلب مساحة كبيرة على محرك الأقراص الثابتة ، يوصى باستخدام محرك أقراص ثابت SSD خارجي.
2. تحليل تسلسلات الفيديو
   1. لتحديد CBF و CBP ، قم بتشغيل مقاطع الفيديو مرة أخرى إطارا تلو الآخر.
   2. لتحديد CBF ، اضبط معدل الإطارات على حركة بطيئة مع 15 إطارا / ثانية وعد 10 نبضات متتالية.
   3. سجل عدد الإطارات التي تمر خلال دورة واحدة من 10 دقات وأدخل النتيجة في Eq (1). تحديد التردد عن طريق حساب متوسط جميع دورات ضرب الأهداب المسجلة ومقارنة النتيجة بالقيم المرجعية للعمر (انظر الجدول 1)¹⁴.
      (1)
      حيث X هو عدد الإطارات التي تمر خلال دورة من 10 نبضات.
   4. لتقييم CBP ، راقب ما إذا كانت حركة أهداب الضرب في نطاق كامل (انظر الشكل 1) ومتزامنة. اطلب من اثنين من المشغلين المستقلين تقييم CBP لمنع التحيز في الاختيار.
   5. الإبلاغ عن نتائج تحليل HSVMA لتكون إما متوافقة أو غير مرجحة أو غير حاسمة مع PCD.

النتائج

يظهر الفيديو 1 والفيديو 2 تحكما طبيعيا حيث يكون CBF و CBP في النطاق الطبيعي (انظر الشكل 1). يمثل الفيديو 3 والفيديو 4 والفيديو 5 والفيديو 6 حالتين من مرضى PCD الذين يعانون من طفرة متماثلة الزيجوت في جين D...

Discussion

هنا ، يتم وصف عملية تشخيص PCD باستخدام HSVMA ومناقشتها في ضوء تشخيص الخط الأول. على الرغم من سهولة إنشائها نسبيا ، وفعالة من حيث التكلفة¹¹ ، وطريقة موثوقة في أيدي ذوي الخبرة¹² ، فإن HSVMA ليس مقياسا تشخيصيا بدون مزالق. قد يكون CBF و CBP غير الطبيعيين ناتجين عن عدوى ثانوية ، مما...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxiciline-clavulanic acid	Orion Oyj		40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day
Camera Software	Hamamatsu		HCI Image
Cold pack	any		for preservation and transport
Differential interference microscope	Carl Zeiss		Inverted, cell observer microscope
Digitial High Speed Video Camera	Hamamatsu		Orca Flash 4.0, digital camera type C11440
Dulbecco´s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10565018	basal cell culture medium
Eppendorf tube	Eppendorf	30120086	1.5 mL tube
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	cuvette for microscopy
Heating Unit	Carl Zeiss/PeCon	810-450001	Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control
Interdental brush 0.6 mm	Doft	872267	Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag
Objective	Carl Zeiss		100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Small polystyrene box with lid	any		for transport