Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade para diagnóstico de primeira linha da dyskinesia ciliar primária

Resumo

A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade é uma análise relativamente fácil de executar, rápida, econômica e, em mãos experientes, uma ferramenta consideravelmente confiável para diagnósticos de primeira linha de dyskinesia ciliar primária, que deve estar disponível em todos os centros envolvidos em diagnósticos e no tratamento de doenças pulmonares graves.

Resumo

A discnesia ciliar primária (PCD) é uma doença congênita predominantemente herdada em um traço recessivo autossômico. O transtorno causa perturbação no movimento do cílio, levando a grave comprometimento do desmatamento mucociliar (CCM). Se não diagnosticada ou diagnosticada tarde demais, a condição leva ao desenvolvimento de bronquiectase e danos graves aos pulmões na vida posterior. A maioria dos métodos de diagnóstico de PCD são demorados e exigem amplos recursos econômicos para estabelecê-los. A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVMA) é a única ferramenta de diagnóstico para visualizar e analisar células respiratórias vivas com cílios in vitro. É rápido, econômico e, em mãos experientes, muito confiável como ferramenta de diagnóstico para PCD. Além disso, medidas diagnósticas clássicas como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) não são aplicáveis para algumas mutações, pois as alterações morfológicas estão ausentes.

Este artigo descreve o processo de coleta de células epiteliais respiratórias, a preparação posterior da amostra e o processo de HSVMA. Também descrevemos como as células escovadas podem ser mantidas ilesas e batendo, mantendo-as em um meio nutritivo para armazenamento e transporte para o local de investigação nos casos em que uma clínica não possui o equipamento para realizar o HSVMA. Também são mostrados vídeos com padrões patológicos de espancamento de pacientes com uma mutação no braço dynein cadeia pesada 11 gene (DNAH11), que não pode ser diagnosticado com TEM; o resultado de um HSVMA inconclusivo devido à infecção das vias aéreas superiores, bem como uma escovação mal sucedida com superposição de glóbulos vermelhos. Com este artigo, gostaríamos de incentivar todas as unidades que lidam com pacientes de pneumologia e doenças pulmonares raras a realizar o HSVMA como parte de seus diagnósticos diários de rotina para PCD ou enviar os espécimes para um centro especializado na realização do HSVMA.

Introdução

A discnesia ciliar primária (PCD) é uma doença genética rara e hereditária, que causa distúrbios no movimento de bater cílios. Se não diagnosticado, leva a danos pulmonares graves na vida posterior devido ao grave comprometimento do CCM. No passado, sua prevalência foi estimada na faixa de 1:4.000 a 50.000. Devido à melhoria constante dos diagnósticos e à crescente conscientização sobre a condição, atualizações sobre a prevalência de PCD sugerem que pode ser muito mais comum e provavelmente na faixa de 1:4.000 a 20.000 em vez^{de 1,2}. No entanto, os pacientes com PCD ainda são subdiagnosticados ou diagnosticados tarde demais ^1,3. Portanto, bebês com situs inversus congênito e/ou heterotaxia ou rinorreia perinatal, problemas respiratórios neonatais, nariz entupido e dificuldades de alimentação devem ser suspeitos para PCD. Na vida posterior, otite crônica, pneumonia recorrente, rinosinusite e uma tosse úmida crônica e típica devido ao MCC prejudicado são os sintomas marcantes do PCD, que em combinação com bronquiectase e função pulmonar prejudicada, continuam até a idade adulta².

Pacientes com suspeita de PCD podem ser diagnosticados usando diferentes ferramentas de diagnóstico. O TEM foi considerado o padrão-ouro para diagnósticos de primeira linha no passado. No entanto, até 30% dos casos de PCD não apresentam ultraestrutura anormal 1,3,4,5,6, exigindo uma abordagem diagnóstica diferente. Portanto, um número crescente de centros e as diretrizes da Sociedade Respiratória Europeia (ERS) sugerem uma combinação de óxido nítrico nasal (nNO) e HSVMA como diagnósticos de primeira linha 1,7,9,10. HSVMA e nNO também são as opções mais econômicas na identificação de um paciente com PCD¹¹. No entanto, mesmo que os testes genéticos tenham sido incluídos nos diagnósticos, deve-se ter em mente que atualmente não há nenhum teste autônomo ou combinação de testes que possam excluir pcd com 100% de certeza ^8,9,10.

Das opções de diagnóstico disponíveis, o HSVMA é o único teste que se concentra em células respiratórias vivas, revestidas de cílios e avalia o padrão de batida ciliar (CBP) e a frequência de batida ciliar (CBF). Em contraste com o TEM, os resultados do HSVMA estão disponíveis rapidamente, geralmente no dia do teste, enquanto os resultados do TEM podem chegar meses após a coleta da amostra. O HSVMA pode ser aplicado para todas as faixas etárias, enquanto o NNO exige um alto grau de conformidade; tentativas de usá-lo com menos de 5 anos geralmente são mal sucedidas¹⁰. Em mãos experientes, o HSVMA tem excelente sensibilidade e especificidade para diagnosticar PCD em 100% e 96%, respectivamente¹².

Este artigo descreve o procedimento passo-a-passo para a realização do HSVMA, incluindo a colheita de células respiratórias revestidas de cílios a partir do turbinado inferior do nariz, a preservação de células colhidas em um meio nutritivo celular para transporte para o local de investigação, e o processo de análise de vídeo microscópico para determinar CBF e CBP. Além disso, alguns videoclipes de pacientes são mostrados, comparando CBPs normais e CBFs com função cília anormal (Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5, Vídeo 6, Vídeo 7 e Vídeo 8).

Protocolo

Declaração ética:

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética local (69/2017) e realizado em cumprimento à declaração de Helsinque.

1. Coleta e transporte de células epiteliais respiratórias

1. Escovar
   1. Antes de escovar, administre um curso de duas semanas de ácido amoxicilina-clavulanic oral ao paciente para erradicar biofilmes interferindo na função cílio. Certifique-se de que o antibiótico é terminado 2 dias antes do procedimento.
   2. Para diminuir uma sobreposição de material mucoso nas tiras de célula epitelial escovadas, peça ao paciente para assoar completamente o nariz. Peça aos pais para ajudar seus filhos pequenos a estourarem o nariz.
   3. Para escovar, utilize uma escova interdental de 0,6 mm de tamanho (veja a Tabela de Materiais). Mantenha a cabeça do paciente fixada com uma mão, e com a outra mão, escove o turbinado inferior de ambas as narinas para coletar tiras celulares epiteliais suficientes.
      NOTA: Uma leve resistência é geralmente experimentada ao inserir a escova interdental profundamente sob o turbinado inferior. A escovação nasal é realizada girando e colhendo rapidamente por aproximadamente 2 s. Escovação mais longa e intensa pode causar lesões epiteliais graves e epistaxis consecutivas.
   4. Se a broncoscopia for planejada por outras razões que não a suspeita de PCD, colete amostras durante a broncoscopia escovando a carina ou o epitélio brônquico ou por biópsia¹³.
   5. Solte as tiras de células colhidas em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL contendo o Meio águia modificada (DMEM) de Dulbecco, nutritivo por células.
      NOTA: As tiras de células epiteliais geralmente deixam o pincel mais facilmente lançando e girando a escova contra a parede do tubo.
   6. Feche a tampa do tubo de microcentrifuuagem e segure o tubo contra uma fonte de luz. Agite o tubo para descobrir tiras de células colhidas e conglomerados.
2. Transporte do espécime
   1. Coloque os tubos de microcentrifuuge em uma caixa de poliestireno bem fechada e certifique-se de que a tampa dos tubos está devidamente fechada e os tubos estão fixados dentro da caixa.
   2. Adicione um pacote frio; no entanto, evite congelar o espécime.
      NOTA: A temperatura ideal para a preservação da amostra antes da investigação é de aproximadamente 4-8 °C (39.2-46.4 °F).
   3. Certifique-se de que as amostras preservadas sejam analisadas durante as próximas 24 horas.
      NOTA: Nesses experimentos, o tempo médio entre escovações e HSVMA foi de 3h.

2. Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVMA)

1. Microscopia de vídeo das amostras
   1. Depois de receber os tubos de microcentrifuuge contendo as amostras, aqueça-os até 37 °C (98,6 °F) para imitar um ambiente ótimo, in vivo.
   2. Se o microscópio estiver equipado com uma unidade de aquecimento, coloque os tubos sob o capô e aqueça-os lá em cima. Alternativamente, use uma incubadora para aquecer as amostras.
   3. Inicie a câmera e o software da unidade de vídeo no PC.
   4. Usando uma pipeta, pegue uma pequena quantidade da amostra e coloque duas gotas em um prato cuvette ou fundo de vidro (veja a Tabela de Materiais). Cubra o cuvette ou prato com uma tampa e coloque-o sob o microscópio.
   5. Para avaliação das amostras, use um microscópio de interferência diferencial equipado com uma fonte de luz fria e uma câmera de vídeo capaz de gravar em alta velocidade (pelo menos 200 quadros/s). Use uma lente de imersão em óleo com uma ampliação de 100x e coloque uma gota de óleo de imersão na superfície da óptica.
      NOTA: Microscópios com uma lente se aproximando de baixo são recomendados.
   6. Aproxime-se da parte inferior do prato com a lente do microscópio e procure por aglomerados celulares sem glóbulos vermelhos e com baixo teor de muco. Depois de encontrar uma região representativa de interesse (ROI), concentre-se em um grupo específico de bater clia com os maiores movimentos de cílios e gravar uma sequência de vídeo. Registo celular com batida cilia lateral e de cima. Depois disso, procure outro grupo representativo de células e repita a gravação.
      NOTA: As células revestidas de cílio devem ser investigadas sob uma ampliação de 1.000x, e a batida de Cílios deve ser gravada com uma câmera de vídeo digital de alta velocidade (DHSV) fixada em uma taxa de quadros de 200/s ou mais (256/s neste protocolo). Como os dados obtidos nos clipes de vídeo gravados exigem muito espaço no disco rígido, recomenda-se um disco rígido SSD externo.
2. Análise de sequências de vídeo
   1. Para determinar CBF e CBP, reprodumente os clipes de vídeo quadro a quadro.
   2. Para determinar a CBF, defina a taxa de quadros em câmera lenta com 15 quadros/s e conte 10 batidas consecutivas.
   3. Registo o número de quadros que passam durante um único ciclo de 10 batidas e insira o resultado em Eq (1). Determine a frequência calculando a média de todos os ciclos de batida cilia registrados e compare o resultado com os valores de referência para a idade (ver Tabela 1)¹⁴.
      (1)
      Onde X é o número de quadros que passam durante um ciclo de 10 batidas.
   4. Para avaliar o CBP, observe se o movimento da cília de batida está em pleno alcance (ver Figura 1) e sincronizado. Ter dois operadores independentes avaliando o CBP para evitar viés de seleção.
   5. Informe os resultados da análise HSVMA para serem compatíveis, improváveis ou inconclusivos com PCD.

Resultados

O vídeo 1 e o vídeo 2 mostram um controle normal onde a CBF e o CBP estão na faixa normal (ver Figura 1). Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5 e Vídeo 6 representam dois casos de pacientes com PCD com uma mutação homozigous no gene DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)³. Esses vídeos representativos foram escolhidos porque os fenótipos de mutaç...

Discussão

Aqui, o processo de diagnóstico para PCD usando HSVMA é descrito e discutido à luz dos diagnósticos de primeira linha. Apesar de ser relativamente fácil de estabelecer,¹¹ econômico e um método confiável em mãos experientes¹², o HSVMA não é uma medida de diagnóstico sem armadilhas. A CBF e o CBP anormal podem ser devido a infecções secundárias, levando à inflamação da epithelia bronco-respiratória¹⁵, e pelo mesmo motivo, os indivíd...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxiciline-clavulanic acid	Orion Oyj		40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day
Camera Software	Hamamatsu		HCI Image
Cold pack	any		for preservation and transport
Differential interference microscope	Carl Zeiss		Inverted, cell observer microscope
Digitial High Speed Video Camera	Hamamatsu		Orca Flash 4.0, digital camera type C11440
Dulbecco´s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10565018	basal cell culture medium
Eppendorf tube	Eppendorf	30120086	1.5 mL tube
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	cuvette for microscopy
Heating Unit	Carl Zeiss/PeCon	810-450001	Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control
Interdental brush 0.6 mm	Doft	872267	Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag
Objective	Carl Zeiss		100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Small polystyrene box with lid	any		for transport