高速视频显微镜分析在原发性睫状体运动障碍一线诊断中的应用

摘要

高速视频显微镜分析是一种相对容易执行、快速、经济高效，而且在有经验的人手中，它是原发性睫状体运动障碍一线诊断的相当可靠的工具，每个参与诊断和治疗严重肺部疾病的中心都应该提供这种工具。

摘要

原发性睫状体运动障碍（PCD）是一种先天性疾病，主要遗传于常染色体隐性遗传性状。该疾病导致纤毛运动紊乱，导致黏膜纤毛清除率（MCC）的严重损害。如果未确诊或诊断得太晚，该病症会导致支气管扩张症的发展，并在以后的生活中对肺部造成严重损害。大多数诊断PCD的方法都很耗时，需要大量的经济资源来建立它们。高速视频显微镜分析 （HSVMA） 是 体外可视化和分析纤毛跳动的活呼吸道细胞的唯一诊断工具。它快速，经济高效，并且在经验丰富的手中，作为PCD的诊断工具非常可靠。此外，由于不存在形态学变化，透射电子显微镜（TEM）等经典诊断措施不适用于某些突变。

本文介绍了收集呼吸道上皮细胞的过程，标本的进一步制备以及HSVMA的过程。我们还描述了如何在诊所不具备执行HSVMA的设备的情况下，通过将刷毛细胞保存在滋养介质中以储存并运输到调查地点，从而成功地保持不受伤害和跳动。还显示了来自动力蛋白臂重链11基因（DNAH11）突变的患者的病理性跳动模式的视频，该基因不能被诊断为TEM;由于上气道感染导致的 HSVMA 不确定的结果，以及刷牙与红细胞叠加不成功。通过本文，我们希望鼓励每个处理肺病患者和罕见肺部疾病的单位进行HSVMA，作为其PCD日常常规诊断的一部分，或将标本送到专门从事HSVMA的中心。

引言

原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种罕见的遗传性遗传性疾病，可引起跳动纤毛运动的紊乱。如果未确诊，由于MCC的严重损害，它会导致晚年严重的肺损伤。过去，其患病率估计在1:4，000至50，000之间。由于诊断方法的稳步改善和对该病症的认识不断提高，关于PCD患病率的最新情况表明，它可能更为常见，可能在1:4，000至20，000的范围内，而不是^1，2。然而，PCD患者仍然被低估或诊断得太晚^1，3。因此，应怀疑患有先天性坐姿与异型或围产期鼻漏、新生儿呼吸窘迫、鼻塞和喂养困难的婴儿。在晚年，慢性中耳炎、复发性肺炎、鼻-鼻窦炎和由 MCC 受损引起的慢性典型湿性咳嗽是 PCD 的标志性症状，与支气管扩张症和肺功能受损相结合，持续到成年期².

怀疑患有PCD的患者可以通过使用不同的诊断工具进行诊断。过去，TEM被认为是一线诊断的黄金标准。然而，高达30%的PCD病例没有显示异常的超微结构^{1，3，4，5，6}，需要不同的诊断方法。因此，越来越多的中心和欧洲呼吸学会 （ERS） 指南建议将鼻一氧化氮 （nNO） 和 HSVMA 联合作为一线诊断^{方法 1，7，9，10}。HSVMA 和 nNO 也是识别 PCD¹¹ 患者的最具成本效益的选择。然而，即使基因检测包含在诊断中，也必须记住，目前没有独立的检测或组合检测可以100%确定性排除PCD^8，9，10。

在现有的诊断选项中，HSVMA 是唯一一种专注于活的纤毛包被呼吸道细胞并评估纤毛搏动模式 （CBP） 和纤毛搏动频率 （CBF） 的检查。与TEM相反，HSVMA的结果通常通常在测试当天快速获得，而TEM的结果可能在标本采集后数月到达。HSVMA可以适用于所有年龄组，而nNO要求高度合规;5岁以下尝试使用它通常不成功¹⁰.在有经验的人手中，HSVMA具有出色的敏感性和特异性，可分别诊断PCD 100%和96%，¹²。

本文描述了执行HSVMA的分步程序，包括从鼻子的下鼻甲中收获纤毛包被的呼吸道细胞，将收获的细胞保存在细胞滋养培养基中以运输到研究部位，以及微观视频分析以确定CBF和CBP的过程。此外，还显示了一些来自患者的视频剪辑，将正常的CBP和CBF与异常纤毛功能（视频3， 视频4， 视频5， 视频6， 视频7和 视频8）进行比较。

研究方案

道德声明:

这项研究得到了当地伦理委员会（69/2017）的批准，并按照赫尔辛基宣言进行。

1. 呼吸道上皮细胞的收集和运输

1. 刷牙
   1. 刷牙前，给患者口服阿莫西林-克拉维酸两周疗程，以根除干扰纤毛功能的生物膜。确保在手术前2天终止抗生素。
   2. 为了减少刷洗上皮细胞条上的粘液物质覆盖，请患者彻底擤鼻涕。请父母帮助他们的孩子擤鼻涕。
   3. 如需刷牙，请使用 0.6 mm 大小的齿间刷（请参见 材料表）。用一只手固定患者的头部，另一只手刷两个鼻孔的下鼻甲，以收集足够的上皮细胞条。
      注意:将齿间刷深埋在下鼻甲下方时，通常会遇到轻微的阻力。鼻刷通过快速转动和拾取约2秒进行。否则，长时间和剧烈的刷牙可能会导致严重的上皮损伤和连续的鼻衄。
   4. 如果计划进行支气管镜检查，除怀疑多氯二苯并对苯二恶英外，在支气管镜检查期间通过刷牙或支气管上皮或活检收集样本¹³.
   5. 将收获的细胞条放入含有滋养细胞的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）的1.5 mL微量离心管中。
      注意:上皮细胞条通常通过对着管壁辗转和转动刷子更容易掉落。
   6. 合上微量离心管的盖子，并将离心管靠在光源上。摇动试管以发现收获的细胞条和砾岩。
2. 标本的运输
   1. 将微量离心管放在密闭的聚苯乙烯盒中，并确保管的盖子正确关闭，管子固定在盒内。
   2. 添加冷敷;但是，避免冻结标本。
      注意:在调查前保存试样的最佳温度约为4-8°C（39.2-46.4°F）。
   3. 确保在接下来的24小时内分析保存的样品。
      注意:在这些实验中，刷牙和HSVMA之间的平均时间为3小时。

2. 高速视频显微镜分析

1. 样品的视频显微镜检查
   1. 接收含有样品的微量离心管后，将其加热至37°C（98.6°F）以模拟最佳的 体内样环境。
   2. 如果显微镜配备了加热装置，请将试管放在引擎盖下并在那里加热。或者，使用培养箱预热样品。
   3. 启动PC上视频单元的相机和软件。
   4. 使用移液器，取少量样品，将两滴放入比色皿或玻璃底培养皿中（参见 材料表）。用盖子盖住比色皿或盘子，并将其放在显微镜下。
   5. 为了评估样品，请使用配备冷光源的差分干涉显微镜和能够以高速（至少200帧/秒）记录的摄像机。使用放大倍率为100倍的油浸透镜，并将一滴浸油滴在光学元件的表面上。
      注意:建议使用从下方接近透镜的显微镜。
   6. 用显微镜镜片接近培养皿的底部，寻找没有红细胞且粘液含量低的细胞簇。找到具有代表性的兴趣区域（ROI）后，将重点放在具有最大纤毛运动的特定一组跳动纤毛上，并录制视频序列。记录从侧面和从上方跳动纤毛的细胞。之后，搜索另一个具有代表性的细胞簇并重复记录。
      注意:必须在1，000倍放大镜下研究纤毛包被的细胞，并且应使用以200 / s或更高帧速率（在本方案中为256 / s）设置的数字高速视频（DHSV）相机记录跳动纤毛。由于从录制的视频剪辑中获取的数据需要在硬盘驱动器上占用大量空间，因此建议使用外部SSD硬盘驱动器。
2. 视频序列分析
   1. 要确定 CBF 和 CBP，请逐帧播放视频剪辑。
   2. 要确定 CBF，请将帧速率设置为 15 帧/秒的慢动作，并计算 10 个连续节拍。
   3. 记录在 10 次节拍的单个周期内经过的帧数，并将结果插入到等式 （1） 中。通过计算所有记录的纤毛搏动周期的平均值来确定频率，并将结果与年龄的参考值进行比较（见 表1）¹⁴。
      （1）
      其中 X 是在 10 次节拍的周期内经过的帧数。
   4. 为了评估CBP，观察跳动纤毛的运动是否在全范围内（见 图1）并同步。让两个独立的操作员评估CBP以防止选择偏差。
   5. 报告 HSVMA 分析结果与 PCD 兼容、不太可能或不确定。

结果

视频 1 和 视频 2 显示了 CBF 和 CBP 处于正常范围的正常控制（参见 图 1）。 视频3， 视频4， 视频5和 视频6 代表了两例PCD患者在 DNAH11 基因中纯合突变（c.2341G>A; p. Glu781Lys）³。之所以选择这些具有代表性的视频，是因为 DNAH11 基因突变的表型值得注意，因?...

讨论

在这里，根据一线诊断来描述和使用HSVMA的PCD的诊断过程。尽管HSVMA相对容易建立，成本效益¹¹，并且在有经验的手中是一种可靠的方法¹²，但HSVMA并不是一种没有陷阱的诊断措施。异常CBF和CBP可能是由于继发感染，导致支气管 - 呼吸道上皮炎症¹⁵，并且出于同样的原因，吸烟个体可能有异常的心跳频率^16，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxiciline-clavulanic acid	Orion Oyj		40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day
Camera Software	Hamamatsu		HCI Image
Cold pack	any		for preservation and transport
Differential interference microscope	Carl Zeiss		Inverted, cell observer microscope
Digitial High Speed Video Camera	Hamamatsu		Orca Flash 4.0, digital camera type C11440
Dulbecco´s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10565018	basal cell culture medium
Eppendorf tube	Eppendorf	30120086	1.5 mL tube
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	cuvette for microscopy
Heating Unit	Carl Zeiss/PeCon	810-450001	Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control
Interdental brush 0.6 mm	Doft	872267	Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag
Objective	Carl Zeiss		100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Small polystyrene box with lid	any		for transport