Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria

Riepilogo

L'analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.

Abstract

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una malattia congenita prevalentemente ereditata in un tratto autosomico recessivo. Il disturbo provoca disturbi nel movimento delle ciglia, portando a una grave compromissione della clearance mucociliare (MCC). Se non diagnosticata o diagnosticata troppo tardi, la condizione porta allo sviluppo di bronchiectasie e gravi danni ai polmoni in età avanzata. La maggior parte dei metodi per diagnosticare la PCD richiedono molto tempo e richiedono ampie risorse economiche per stabilirli. L'analisi videomicroscopica ad alta velocità (HSVMA) è l'unico strumento diagnostico per visualizzare e analizzare le cellule respiratorie viventi con ciglia battenti in vitro. È veloce, economico e, in mani esperte, molto affidabile come strumento diagnostico per PCD. Inoltre, le misure diagnostiche classiche come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) non sono applicabili per alcune mutazioni in quanto i cambiamenti morfologici sono assenti.

Questo documento descrive il processo di raccolta delle cellule epiteliali respiratorie, l'ulteriore preparazione del campione e il processo di HSVMA. Descriviamo anche come le cellule spazzolate possono essere mantenute con successo illese e picchiate tenendole in un mezzo nutriente per lo stoccaggio e il trasporto al sito di indagine nei casi in cui una clinica non possiede l'attrezzatura per eseguire HSVMA. Vengono mostrati anche video con modelli di battito patologico di pazienti con una mutazione nel gene della catena pesante del braccio di dineina 11 (DNAH11), che non può essere diagnosticato con TEM; il risultato di un HSVMA inconcludente a causa dell'infezione delle vie aeree superiori, nonché di una spazzolatura infruttuosa con sovrapposizione di globuli rossi. Con questo articolo, vorremmo incoraggiare ogni unità che si occupa di pazienti pneumologici e malattie polmonari rare a eseguire HSVMA come parte della loro diagnostica di routine quotidiana per PCD o inviare i campioni a un centro specializzato nell'esecuzione di HSVMA.

Introduzione

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una rara malattia genetica ereditaria, che causa disturbi nel movimento delle ciglia che battono. Se non diagnosticato, porta a gravi danni polmonari in età avanzata a causa di una grave compromissione del MCC. In passato, la sua prevalenza è stata stimata nell'intervallo da 1:4.000 a 50.000. A causa del costante miglioramento della diagnostica e di una crescente consapevolezza della condizione, gli aggiornamenti sulla prevalenza della PCD suggeriscono che potrebbe essere molto più comune e probabilmente nell'intervallo da 1: 4.000 a 20.000 invece^{di 1,2}. Tuttavia, i pazienti con PCD sono ancora sottodiagnosticati o diagnosticati troppo tardi ^1,3. Pertanto, i neonati con situs inversus congenito e/o eterotassia o rinorrea perinatale, distress respiratorio neonatale, naso chiuso e difficoltà di alimentazione dovrebbero essere sospetti per la PCD. In età avanzata, otite cronica, polmonite ricorrente, rinosinusite e una tosse umida cronica e tipica a causa di MCC compromesso sono i sintomi caratteristici della PCD, che in combinazione con bronchiectasie e compromissione della funzione polmonare, continuano nell'età adulta².

I pazienti sospettati di avere PCD possono essere diagnosticati utilizzando diversi strumenti diagnostici. TEM è stato considerato il gold standard per la diagnostica di prima linea in passato. Tuttavia, fino al 30% dei casi di PCD non mostra un'ultrastruttura anormale 1,3,4,5,6, richiedendo un approccio diagnostico diverso. Pertanto, un numero crescente di centri e le linee guida della European Respiratory Society (ERS) suggeriscono una combinazione di ossido nitrico nasale (nNO) e HSVMA come diagnostica di prima linea 1,7,9,10. HSVMA e nNO sono anche le opzioni più convenienti nell'identificazione di un paziente con PCD¹¹. Tuttavia, anche se i test genetici fossero inclusi nella diagnostica, si deve tenere presente che attualmente non esiste un test autonomo o una combinazione di test che possa escludere la PCD con certezza al 100% ^8,9,10.

Tra le opzioni diagnostiche disponibili, HSVMA è l'unico test che si concentra sulle cellule respiratorie viventi rivestite di ciglia e valuta il modello di battito ciliare (CBP) e la frequenza del battito ciliare (CBF). A differenza di TEM, i risultati di HSVMA sono disponibili rapidamente, di solito il giorno del test, mentre i risultati di TEM potrebbero arrivare mesi dopo che il campione è stato prelevato. HSVMA può essere applicato a tutte le fasce d'età, mentre nNO richiede un alto grado di conformità; i tentativi di usarlo sotto i 5 anni di solito non hanno successo¹⁰. In mani esperte, HSVMA ha un'eccellente sensibilità e specificità per diagnosticare la PCD al 100% e al 96%, rispettivamente¹².

Questo documento descrive la procedura passo-passo per eseguire HSVMA, compresa la raccolta di cellule respiratorie rivestite di ciglia dal turbinato inferiore del naso, la conservazione delle cellule raccolte in un mezzo nutritivo cellulare per il trasporto al sito di indagine e il processo di analisi video microscopica per determinare CBF e CBP. Inoltre, vengono mostrati alcuni video clip dei pazienti, confrontando CBP e CFF normali con funzione ciglia anormale (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 e Video 8).

Protocollo

Dichiarazione etica:

Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (69/2017) ed è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki.

1. Raccolta e trasporto di cellule epiteliali respiratorie

1. Spazzolatura
   1. Prima di spazzolare, somministrare un ciclo di due settimane di acido amoxicillina-clavulanico orale al paziente per sradicare i biofilm che interferiscono con la funzione delle ciglia. Assicurarsi che l'antibiotico venga interrotto 2 giorni prima della procedura.
   2. Per diminuire una sovrapposizione di materiale mucoso sulle strisce cellulari epiteliali spazzolate, chiedere al paziente di soffiarsi accuratamente il naso. Chiedi ai genitori di aiutare i loro bambini piccoli a soffiarsi il naso.
   3. Per la spazzolatura, utilizzare una spazzola interdentale di dimensioni 0,6 mm (vedere la Tabella dei materiali). Tenere la testa del paziente fissata con una mano e, con l'altra mano, spazzolare il turbinato inferiore di entrambe le narici per raccogliere sufficienti strisce di cellule epiteliali.
      NOTA: di solito si verifica una leggera resistenza quando si inserisce la spazzola interdentale in profondità sotto il turbinato inferiore. La spazzolatura nasale viene effettuata mediante rapida rotazione e prelievo per circa 2 s. Una spazzolatura più lunga e intensa potrebbe altrimenti causare gravi lesioni epiteliali ed epistassi consecutiva.
   4. Se la broncoscopia è pianificata per motivi diversi dalla sospetta PCD, raccogliere campioni durante la broncoscopia spazzolando la carina o l'epitelio bronchiale o mediante biopsia¹³.
   5. Far cadere le strisce cellulari raccolte in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco che nutre le cellule.
      NOTA: le strisce di cellule epiteliali di solito cadono dalla spazzola più facilmente lanciando e ruotando la spazzola contro la parete del tubo.
   6. Chiudere il coperchio del tubo microcentrifuga e tenere il tubo contro una fonte di luce. Agitare il tubo per scoprire strisce e conglomerati di cellule raccolte.
2. Trasporto dell'esemplare
   1. Posizionare i tubi microcentrifuga in una scatola di polistirolo ben chiusa e assicurarsi che il coperchio dei tubi sia correttamente chiuso e che i tubi siano fissati all'interno della scatola.
   2. Aggiungere un impacco freddo; tuttavia, evitare di congelare il campione.
      NOTA: la temperatura ottimale per conservare il campione prima dell'indagine è di circa 4-8 °C (39,2-46,4 °F).
   3. Assicurarsi che i campioni conservati vengano analizzati durante le successive 24 ore.
      NOTA: In questi esperimenti, il tempo medio tra le spazzolature e hSVMA è stato di 3 ore.

2. Analisi video al microscopio ad alta velocità (HSVMA)

1. Videomicroscopia dei campioni
   1. Dopo aver ricevuto i tubi di microcentrifuga contenenti i campioni, riscaldarli fino a 37 °C (98,6 °F) per imitare un ambiente ottimale, simile a quello in vivo.
   2. Se il microscopio è dotato di un'unità di riscaldamento, posizionare i tubi sotto il cofano e riscaldarli lassù. In alternativa, utilizzare un'incubatrice per riscaldare i campioni.
   3. Avviare la fotocamera e il software dell'unità video sul PC.
   4. Usando una pipetta, prendi una piccola quantità del campione e metti due gocce in una cuvetta o in un piatto con fondo di vetro (vedi la Tabella dei materiali). Coprire la cuvetta o il piatto con un coperchio e metterlo sotto il microscopio.
   5. Per la valutazione dei campioni, utilizzare un microscopio a interferenza differenziale dotato di sorgente a luce fredda e di una videocamera in grado di registrare ad alta velocità (almeno 200 fotogrammi/s). Utilizzare una lente ad immersione in olio con un ingrandimento di 100x e mettere una goccia di olio ad immersione sulla superficie dell'ottica.
      NOTA: si consigliano microscopi con una lente che si avvicina dal basso.
   6. Avvicinati al fondo del piatto con la lente del microscopio e cerca cluster di cellule senza globuli rossi e con basso contenuto di muco. Dopo aver trovato una regione rappresentativa di interesse (ROI), concentrati su un gruppo specifico di ciglia battenti con i più grandi movimenti di ciglia e registra una sequenza video. Registra le cellule con le ciglia che battono lateralmente e dall'alto. Successivamente, cerca un altro gruppo rappresentativo di celle e ripeti la registrazione.
      NOTA: le cellule rivestite di ciglia devono essere studiate con un ingrandimento di 1.000x e le ciglia battenti devono essere registrate con una telecamera video digitale ad alta velocità (DHSV) impostata su un frame rate di 200 / s o più (256 / s in questo protocollo). Poiché i dati ottenuti dai video clip registrati richiedono molto spazio sul disco rigido, si consiglia un disco rigido SSD esterno.
2. Analisi di sequenze video
   1. Per determinare CBF e CBP, riproducete i clip video fotogramma per fotogramma.
   2. Per determinare il CBF, imposta la frequenza dei fotogrammi al rallentatore con 15 fotogrammi/s e conta 10 battiti consecutivi.
   3. Registrare il numero di fotogrammi che passano durante un singolo ciclo di 10 battiti e inserire il risultato in Eq (1). Determinare la frequenza calcolando la media di tutti i cicli di battito delle ciglia registrati e confrontare il risultato con i valori di riferimento per l'età (vedere Tabella 1)¹⁴.
      (1)
      Dove X è il numero di fotogrammi che passano durante un ciclo di 10 battiti.
   4. Per valutare il CBP, controllare se il movimento delle ciglia che battono è in gamma completa (vedere Figura 1) e sincronizzato. Chiedi a due operatori indipendenti di valutare il CBP per prevenire la distorsione della selezione.
   5. Segnalare che i risultati dell'analisi HSVMA sono compatibili, improbabili o inconcludenti con la PCD.

Risultati

I video 1 e 2 mostrano un controllo normale in cui CBF e CBP si trovano nell'intervallo normale (vedere la Figura 1). Video 3, Video 4, Video 5 e Video 6 rappresentano due casi di pazienti con PCD con una mutazione omozigote nel gene DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)³. Questi video rappresentativi sono stati scelti perché i fenotipi delle m...

Discussione

Qui, il processo diagnostico per PCD utilizzando HSVMA è descritto e discusso alla luce della diagnostica di prima linea. Nonostante sia relativamente facile da stabilire, conveniente¹¹ e un metodo affidabile in mani^{esperte 12}, HSVMA non è una misura diagnostica senza insidie. CBF e CBP anormali possono essere dovuti a infezioni secondarie, che portano all'infiammazione dell'epitelio bronco-respiratorio¹⁵ e, per lo stesso motivo, gli individui che ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxiciline-clavulanic acid	Orion Oyj		40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day
Camera Software	Hamamatsu		HCI Image
Cold pack	any		for preservation and transport
Differential interference microscope	Carl Zeiss		Inverted, cell observer microscope
Digitial High Speed Video Camera	Hamamatsu		Orca Flash 4.0, digital camera type C11440
Dulbecco´s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10565018	basal cell culture medium
Eppendorf tube	Eppendorf	30120086	1.5 mL tube
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	cuvette for microscopy
Heating Unit	Carl Zeiss/PeCon	810-450001	Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control
Interdental brush 0.6 mm	Doft	872267	Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag
Objective	Carl Zeiss		100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Small polystyrene box with lid	any		for transport