Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria

Riepilogo

L'analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.

Abstract

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una malattia congenita prevalentemente ereditata in un tratto autosomico recessivo. Il disturbo provoca disturbi nel movimento delle ciglia, portando a una grave compromissione della clearance mucociliare (MCC). Se non diagnosticata o diagnosticata troppo tardi, la condizione porta allo sviluppo di bronchiectasie e gravi danni ai polmoni in età avanzata. La maggior parte dei metodi per diagnosticare la PCD richiedono molto tempo e richiedono ampie risorse economiche per stabilirli. L'analisi videomicroscopica ad alta velocità (HSVMA) è l'unico strumento diagnostico per visualizzare e analizzare le cellule respiratorie viventi con ciglia battenti in vitro. È veloce, economico e, in mani esperte, molto affidabile come strumento diagnostico per PCD. Inoltre, le misure diagnostiche classiche come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) non sono applicabili per alcune mutazioni in quanto i cambiamenti morfologici sono assenti.

Questo documento descrive il processo di raccolta delle cellule epiteliali respiratorie, l'ulteriore preparazione del campione e il processo di HSVMA. Descriviamo anche come le cellule spazzolate possono essere mantenute con successo illese e picchiate tenendole in un mezzo nutriente per lo stoccaggio e il trasporto al sito di indagine nei casi in cui una clinica non possiede l'attrezzatura per eseguire HSVMA. Vengono mostrati anche video con modelli di battito patologico di pazienti con una mutazione nel gene della catena pesante del braccio di dineina 11 (DNAH11), che non può essere diagnosticato con TEM; il risultato di un HSVMA inconcludente a causa dell'infezione delle vie aeree superiori, nonché di una spazzolatura infruttuosa con sovrapposizione di globuli rossi. Con questo articolo, vorremmo incoraggiare ogni unità che si occupa di pazienti pneumologici e malattie polmonari rare a eseguire HSVMA come parte della loro diagnostica di routine quotidiana per PCD o inviare i campioni a un centro specializzato nell'esecuzione di HSVMA.

Introduzione

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una rara malattia genetica ereditaria, che causa disturbi nel movimento delle ciglia che battono. Se non diagnosticato, porta a gravi danni polmonari in età avanzata a causa di una grave compromissione del MCC. In passato, la sua prevalenza è stata stimata nell'intervallo da 1:4.000 a 50.000. A causa del costante miglioramento della diagnostica e di una crescente consapevolezza della condizione, gli aggiornamenti sulla prevalenza della PCD suggeriscono che potrebbe essere molto più comune e probabilmente nell'intervallo da 1: 4.000 a 20.000 invece^{di 1,2}. Tuttavia, i pazie....

Protocollo

Dichiarazione etica:

Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (69/2017) ed è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki.

1. Raccolta e trasporto di cellule epiteliali respiratorie

1. Spazzolatura
   1. Prima di spazzolare, somministrare un ciclo di due settimane di acido amoxicillina-clavulanico orale al paziente per sradicare i biofilm che interferiscono con la funzione delle ciglia. Assicurarsi che l'antibiotico venga interrotto 2 giorni prima della procedura.
   2. Per diminuire una sovrapposizione di materiale mucoso sulle strisce cellulari ep....

Risultati

I video 1 e 2 mostrano un controllo normale in cui CBF e CBP si trovano nell'intervallo normale (vedere la Figura 1). Video 3, Video 4, Video 5 e Video 6 rappresentano due casi di pazienti con PCD con una mutazione omozigote nel gene DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)³. Questi video rappresentativi sono stati scelti perché i fenotipi delle m.......

Discussione

Qui, il processo diagnostico per PCD utilizzando HSVMA è descritto e discusso alla luce della diagnostica di prima linea. Nonostante sia relativamente facile da stabilire, conveniente¹¹ e un metodo affidabile in mani^{esperte 12}, HSVMA non è una misura diagnostica senza insidie. CBF e CBP anormali possono essere dovuti a infezioni secondarie, che portano all'infiammazione dell'epitelio bronco-respiratorio¹⁵ e, per lo stesso motivo, gli individui che .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxiciline-clavulanic acid	Orion Oyj		40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day
Camera Software	Hamamatsu		HCI Image
Cold pack	any		for preservation and transport
Differential interference microscope	Carl Zeiss		Inverted, cell observer microscope
Digitial High Speed Video Camera	Hamamatsu		Orca Flash 4.0, digital camera type C11440
Dulbecco´s Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10565018	basal cell culture medium
Eppendorf tube	Eppendorf	30120086	1.5 mL tube
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	cuvette for microscopy
Heating Unit	Carl Zeiss/PeCon	810-450001	Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control
Interdental brush 0.6 mm	Doft	872267	Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag
Objective	Carl Zeiss		100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Small polystyrene box with lid	any		for transport