زراعة الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة

Summary

هذا دليل خطوة بخطوة لاستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة المتاح تجاريا لزرع الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام أوعية استزراع متخصصة يمكن التخلص منها. يمكن تطبيق طريقة الاستزراع هذه على أي مزرعة خلايا من نوع التعليق.

Abstract

بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد بعض الخيارات لإخضاع زراعة الخلايا لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) على الأرض. تختلف هذه الخيارات في أساليبها ومبادئها ومدى ملاءمتها للاستخدام مع مزرعة الخلايا المعلقة. هنا ، يتم وصف طريقة زراعة الخلايا لإخضاع الخلايا الليمفاوية لمحاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة المتاح تجاريا ، والمعروف أيضا باسم clinostat 2D أو جهاز وعاء الجدار الدوار (RWV). تستخدم طريقة زراعة الخلايا هذه مبدأ إبطال ناقل الجاذبية المتوسط زمنيا لمحاكاة الجاذبية الصغرى عن طريق تدوير الخلايا على محور أفقي. يمكن حصاد الخلايا المستزرعة في هذا النظام واستخدامها في العديد من المقايسات التجريبية المختلفة لتقييم آثار محاكاة الجاذبية الصغرى على الوظيفة الخلوية وعلم وظائف الأعضاء. قد تختلف تقنية الاستزراع قليلا اعتمادا على نوع الخلية أو الخط المستخدم ، ولكن يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا على أي مزرعة خلية من نوع التعليق.

Introduction

لقد ثبت أن رحلات الفضاء تؤثر على العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء البشرية ، بما في ذلك جهاز المناعة. أظهرت العديد من الدراسات أدلة على عدم التنظيم المناعي نتيجة لرحلات الفضاء في الجسم الحي والتعرض لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) في المختبر¹،²،^3،4. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. تشير الجاذبية الصغرى إلى "انعدام الوزن" الذي يحدث بسبب قوى الجاذبية المنخفضة في بيئة الفضاء⁵. بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء.

ويمكن تحقيق ظروف الجاذبية الصغرى الحقيقية للبحث العلمي في الفضاء على متن محطة الفضاء الدولية (ISS) أو في السواتل النانوية التي تطلق في المدار؛ ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الخيارات مكلفة للغاية ومعقدة للتنسيق. بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد عدة خيارات لإحداث جاذبية صغيرة حقيقية و SMG على الأرض. توجد عمليات واسعة النطاق يمكن أن تنتج فترات قصيرة من الجاذبية الصغرى الحقيقية على الأرض ، بما في ذلك أبراج الإسقاط ، والطيران المكافئ ، وصواريخ السبر. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل مفرط لدراسة آثار الجاذبية الصغرى على النظم البيولوجية ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى فترات قصيرة من معالجة الجاذبية الصغرى (أي ثوان إلى 20 دقيقة). تتم مناقشة هذه الأساليب بمزيد من التفصيل في مكان آخر ^5,6. تشمل الخيارات المناسبة لزراعة الخلايا البيولوجية الأجهزة الصغيرة الحجم مثل 2D clinostats أو أجهزة وعاء الجدار الدوار (RWV) و clinostats 3D أو آلات تحديد المواقع العشوائية (RPM). يمكن إعداد هذه الأجهزة داخل حاضنات زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ ، وتقوم بتدوير ثقافة الخلية إما على محور أفقي (2D) أو على محورين عموديين (3D) ⁵. ومع ذلك ، من المهم التأكيد على أن طرق الاستزراع هذه تنتج رشاشات صغيرة بدلا من الجاذبية الصغرى الحقيقية ، والتي يتم تحقيقها بشكل عملي في الفضاء لسياقات البحث البيولوجي.

الهدف من الورقة الحالية هو تحديد خطوات إخضاع الخلايا الليمفاوية ل SMG باستخدام جهاز RWV المتاح تجاريا (جدول المواد) ، والذي يندرج تحت تصنيف clinostat 2D. على الرغم من وجود بروتوكول عام متاح من الشركة المصنعة لتشغيل هذا الجهاز ، تهدف المقالة الحالية إلى تغطية خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين بمزيد من التفصيل. تغطي هذه المقالة أيضا النظرية الكامنة وراء كيفية عمل هذا الجهاز لإنتاج SMG في ثقافة الخلايا المعلقة ، وتحديدا مع الخلايا الليمفاوية. في هذا السياق ، تشير زراعة الخلايا المعلقة إلى الخلايا التي تنمو بحرية في وسائط الاستزراع التكميلية ، دون الالتزام بأي سقالات إضافية. تزرع العديد من أنواع الخلايا في زراعة الخلايا المعلقة ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية. الخلايا الليمفاوية هي خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا التائية والبائية والقاتلة الطبيعية (NK) ، الموجودة في الأعضاء اللمفاوية ومجرى الدم⁷.

يعمل كلينستات RWV 2D الموصوف هنا على مبدأ إبطال متجه الجاذبية متوسط الوقت⁵،⁶،⁸،^{9 ،} حيث يتم اختيار متجه الجاذبية بشكل عشوائي من خلال دوران ثقافة الخلية على محور أفقي. يتم تحقيق ذلك من خلال مطابقة سرعة دوران وعاء الاستزراع مع سرعة ترسيب الخلايا. وطالما أن سرعة دوران وعاء الاستزراع تتطابق بشكل جيد مع سرعة ترسيب الخلايا، فإن الخلايا تظل في حالة سقوط حر وغير قادرة على الترسب، كما حدث في بيئة الفضاء. بعد مرحلة التسريع الأولية ، تصل الوسائط في وعاء الاستزراع في النهاية إلى "دوران الجسم الصلب" بمرور الوقت. يحفز هذا الدوران الأفقي أيضا التدفق الصفحي في وعاء زراعة الخلايا. هذا يخلق بيئة "قص منخفضة" ، بالنظر إلى أن إجهاد القص الناجم عن الخلايا عن طريق التدفق الصفحي أقل بكثير من التدفق المضطرب. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن clinostat ليس نظاما مثاليا ، فهناك بعض حركات السوائل الصفائحية الصغيرة التي يتم إدخالها ، والتي تسبب الحد الأدنى من إجهاد القص على الخلايا. على هذا النحو ، يتم سحب الخلايا المعلقة في الوسائط بواسطة هذا التدفق أثناء الدوران. أثناء الدوران الأفقي، يؤثر متجه الجاذبية على الخلايا ويضعها في مسار متذبذب، كما هو موضح في الشكل 1. مصدر صغير آخر لإجهاد القص ناتج عن "سقوط" الخلايا عبر الوسائط ، مما يتسبب في تدفق رقائقي حول الخلايا. عندما يدور وعاء الاستزراع على محور أفقي ، يدور ناقل الجاذبية الذي تتعرض له الخلايا أيضا. بمرور الوقت ، يقترب متوسط ناقل الجاذبية الدوار هذا من الصفر. تسمى هذه الظاهرة إبطال ناقل الجاذبية المتوسط الزمني وتؤدي إلى حالة SMG⁵،^6،8،9. تم استخدام هذا الجهاز لدراسة آثار SMG على العديد من أنواع الخلايا ، والتي يتم تغطية بعضها في المراجع¹⁰،^11،12. يمكن العثور على المزيد من الأمثلة على موقع الشركة المصنعة للجهاز.

يستخدم جهاز RWV هذا "أوعية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية" (HARVs) متخصصة متوفرة من خلال الشركة المصنعة للجهاز. تحتوي هذه HARVs على 10 مل من زراعة الخلايا لكل منها. ومع ذلك ، تتوفر أيضا 50 مل من HARVs. يمكن استخدام 10 مل أو 50 مل HARVs اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة لإكمال أي فحوصات تجريبية نهائية ، والتي تم توضيحها بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة. تصنع HARVs من البولي كربونات وتشمل غشاء أكسجة السيليكون للسماح بتبادل الغازات أثناء زراعة الخلايا. وهذا يحافظ على الأس الهيدروجيني للوسائط الخلوية ويسمح بالتنفس الخلوي بكفاءة. يوجد منفذ تعبئة رئيسي ومنفذي حقنة مغطاة على وجه الوعاء (الشكل 2 أ). بعد تحميل مزرعة الخلية من خلال منفذ التعبئة الرئيسي ، يتم تحميل حقنتين على الوعاء للمساعدة في إزالة الفقاعة. عند استخدام الأوعية سعة 10 مل ، تعمل حقنتان سعة 3 مل بشكل جيد. يتم توصيل حقنة واحدة بالجهاز فارغة ، مع الضغط التام على المحقنة ، والأخرى متصلة مملوءة ب 3 مل من زراعة الخلايا (الشكل 2E). يتم استخدامها معا لإزالة الفقاعات من الوعاء ، وهو أمر مهم للحفاظ على علاج SMG. بشكل عام ، ينصح بإعداد عنصري تحكم سلبيين ، يمكن الإشارة إليهما باسم عنصر التحكم "Flask" وعنصر التحكم "1G". يتوافق عنصر التحكم "القارورة" مع الخلايا التي تزرع في قارورة ثقافة الخلايا المعلقة T25 القياسية. يتوافق عنصر التحكم 1G مع الخلايا التي تزرع في وعاء الاستزراع المتخصص سعة 10 مل ، والذي يتم وضعه ببساطة في الحاضنة (أي دون التعرض لعلاج SMG). يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول عناصر التحكم.

الطريقة الموصوفة هنا مناسبة لأي باحث يتطلع إلى دراسة آثار SMG على الخلايا الليمفاوية ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام خط الخلية NK92¹³. قد تساعدنا نتائج هذه الدراسات على فهم أفضل وتخفيف الآثار الضارة لرحلات الفضاء على جهاز المناعة البشري.

Protocol

ملاحظة: يجب إكمال الخطوات التالية داخل خزانة أمان بيولوجي معقمة.

1. إعداد الأوعية لزراعة الخلايا

1. أخرج أوعية الاستزراع من العبوة البلاستيكية. قم بتسمية كل وعاء على الحافة وفقا لنوع / خط الخلية المستخدم ، سواء كان التحكم (1G) أو العلاج (SMG) ، وأي معلومات أخرى ذات صلة.
2. ثبت الوعاء وافتح منفذ التعبئة بعناية ، دون لمس ربط غطاء منفذ التعبئة / الحلقة O. ضع الغطاء على وسادة الإيثانول ، مع توجيه الوتد / الحلقة O لأعلى ، أثناء ملء الوعاء. لا تقم بإزالة الأغطية من منافذ الحقن.
   ملاحظة: إذا تم لمس الوتد / الحلقة O عن طريق الخطأ ، فقم برش ربط الغطاء بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه (متجها لأعلى) لبضع لحظات أثناء ملء الوعاء. عندما تكون جاهزا لإغلاق منفذ التعبئة مرة أخرى ، التقط الغطاء بمنديل ورقي جديد لتجفيف الغطاء تماما قبل وضعه مرة أخرى على الوعاء.
3. قم بتحميل الوعاء ب 10 مل من الوسائط الكاملة المناسبة لزراعة الخلايا باستخدام ماصة مصلية معقمة ، ثم ضع الغطاء بعناية مرة أخرى على منفذ التعبئة.
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام خط الخلايا NK92 NK ، والذي تم زراعته في وسائط GM1 ، كما تم التحقق من صحته سابقا في تجربة سريرية باستخدام خلايا NK92 كعلاج خلوي¹⁴. تعتمد وسائط الاستزراع المستخدمة على خط الخلية أو نوع الخلية التي يتم استزراعها. يرجى التحقق من موقع المورد للحصول على وصفة الوسائط الصحيحة لخط الخلية أو نوع الخلية المستخدمة.
4. تأكد من إغلاق أغطية منفذ المحقنة ومنفذ التعبئة بإحكام ، ووضع الأوعية المملوءة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ أثناء تنفيذ الخطوات اللاحقة لتجهيز الأوعية لزراعة الخلايا.
   ملاحظة: تساعد خطوة التحضير هذه على تقليل تكوين الفقاعات الكبيرة لتسهيل طرد الفقاعات لاحقا في الخطوة 6.

2. إعداد ثقافة خلايا المخزون لإعداد علاج SMG

1. عندما لا تكون قيد الاستخدام ، قم بتخزين الخلايا ذات الأهمية عند درجة حرارة أقل من -130 درجة مئوية أو ، من الناحية المثالية ، في مرحلة بخار النيتروجين السائل.
2. ما لا يقل عن 1 أسبوع قبل إعداد العلاج المخطط له ، قم بإذابة الخلايا واستزراعتها باستخدام وصفة وسائط زراعة الخلايا المناسبة الموجودة على موقع المورد. خطط لعدد الخلايا اللازمة لإعداد العلاج (التفاصيل أدناه في الخطوات اللاحقة) وتأكد من بدء الثقافات في وقت مبكر بما يكفي للسماح بالانتشار الكافي والتكيف مع الثقافة.
3. قم بتخزين ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ . يتم تغطية مزيد من التفاصيل حول ممارسة زراعة الخلايا القياسية في مكان آخر¹⁵.
4. في يوم إعداد علاج SMG المخطط له ، حدد تركيز البدء وصلاحية ثقافة الخلية الأولية.
   1. استخدم الطريقة المفضلة لتحديد تركيز مزرعة الخلية الأولية (على سبيل المثال ، مقياس الدم ، ViCell ، قياس التدفق الخلوي ، إلخ). لاحظ تركيز الخلية القابل للحياة (الخلايا لكل مل) وقابلية البقاء (٪) للخلايا ، مما يضمن أن تكون الصلاحية أكبر من 85٪ بشكل مثالي. يمكن العثور على بروتوكول لاستخدام مقياس الدم في مكان آخر¹⁶.
5. تحديد كثافة / تركيز بذر الخلية المناسب لثقافة الخلية لعلاج SMG من خلال النظر في نطاق تركيز الخلية الأمثل لنوع / خط خلية معين ، ووقت مضاعفتها ، وطول علاج SMG. يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة لمزيد من التفصيل.
   ملاحظة: من التجربة ، يتراوح نطاق التركيز الأمثل لخلايا NK92 بين 0.3 × 10 6- 1.2 × 10⁶ خلايا / مل. بشكل عام ، هذه الخلايا لها وقت مضاعف من 48-72 ساعة ويتم تغذيتها كل 2-3 أيام على هذا النحو. بالنظر إلى أن طول العلاج كان 72 ساعة ، تم زرع الخلايا في الطرف الأدنى من نطاقها الأمثل عند 0.4-0.5 × 10⁶ خلايا / مل. يوصي المورد أيضا بكثافة البذر هذه عند بدء زراعة الخلايا الأولية من قارورة جديدة من خلايا NK92.
6. تحديد حجم زراعة خلايا المخزون اللازمة لإعداد العلاج والضوابط.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى 10 مل من زراعة الخلايا لكل مجموعة تجريبية. إذا تم إعداد ثلاث مجموعات تجريبية (أي علاج واحد: "SMG" ، وضابطان سلبيان: "قارورة" و "1G") ، فإن 10 مل أخرى من زراعة الخلايا تكفي للقسمة في أنبوب 15 مل يستخدم لتحميل محاقن HARV. هذا هو 40 مل في المجموع ، والتي قد تتقلب اعتمادا على التصميم التجريبي المحدد.
7. تحديد عدد الخلايا اللازمة لإعداد العلاج.
   1. احسب العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة بضرب كثافة البذر المختارة (الخلايا / مل) في الحجم الإجمالي المطلوب (مل).
      ملاحظة: من التجربة مع NK92 ، يتم تحضير 40 مل من زراعة خلايا المخزون كما هو مفصل أعلاه بتركيز بذر 0.4-0.5 × 10⁶ خلايا / مل. على هذا النحو ، هناك حاجة إلى 16-20 × 10⁶ خلايا NK92 لإكمال إعداد العلاج النموذجي. بالنسبة لخط خلايا NK92 ، يعد استخدام خلايا أكثر قليلا أفضل من عدد أقل قليلا من الخلايا للحفاظ على قابلية عالية للبقاء طوال فترة العلاج.
8. تحديد حجم زراعة الخلية الأولية للدوران.
   1. بالنظر إلى أن تركيز الخلية يتم تمثيله كخلايا / مل ، اقسم العدد الإجمالي للخلايا (الخلايا) اللازمة للتجربة على تركيز البدء المقاس لثقافة الخلية (الخلايا / مل).
      ملاحظة: على سبيل المثال ، إذا كانت هناك حاجة إلى 16 × 10 6 خلايا وكان تركيز البدء للثقافة 0.8 × 10⁶ خلايا / مل ، فيجب تدوير 20 مل من المستزرع.
9. جعل ثقافة خلية الأسهم النهائية.
   1. أجهزة الطرد المركزي العدد المناسب من الخلايا عند 300 × جم لمدة 8 دقائق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   2. اسكب المادة الطافية بعناية في حاوية نفايات ، وحرك الأنبوب برفق لإعادة تعليق الحبيبات في الحجم الصغير المتبقي.
   3. أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب من الوسائط الكاملة الدافئة (37 درجة مئوية) لإحضار الثقافة إلى كثافة البذر المطلوبة. تم حساب هذا الحجم في الخطوة 2.6.
   4. قم بتغطية الأنبوب سعة 50 مل بإحكام ، وقم بقلبه برفق عدة مرات لخلط تعليق الخلية جيدا.
      ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من 50 مل لإعداد التجربة الكاملة ، فمن الأفضل طرد مركزي العدد الإجمالي للخلايا اللازمة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وإعادة تعليقه بنصف الحجم المطلوب. بعد ذلك ، امزج جيدا وقم بعمل تخفيف 1: 2 في أنبوب مخروطي منفصل سعة 50 مل. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك حاجة إلى 100 مل عند 0.4 × 10 6 خلايا / مل ، فقم بتدوير 40 × 10⁶ خلايا في أنبوب 50 مل ، وأعد التعليق في 50 مل من الوسائط ، وانقل 25 مل إلى أنبوب 50 مل آخر ، ثم قم بتعبئة كليهما ب 25 مل من الوسائط الجديدة.

3. تحميل السفن مع ثقافة خلية الأسهم

1. استرجع الأوعية المهيأة للوسائط من الحاضنة.
2. إذا تم استخدام عنصر تحكم "قارورة" ، فقم بتحميل قارورة ثقافة التعليق T25 ب 10 مل من زراعة الخلايا من المخزون المحضر أعلاه. أضف أيضا 10 مل من زراعة خلايا المخزون إلى أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل ، والذي سيتم استخدامه لتحميل المحاقن.
3. قم بفك أغطية منفذ المحقنة لإزالتها من السفينة وتأكد من أن محبس المحابس في وضع الفتح (الشكل 2C).
4. ثبت الوعاء وافتح منفذ التعبئة بعناية ، دون لمس ربط غطاء منفذ التعبئة / الحلقة O. ضع الغطاء على وسادة الإيثانول ، مع توجيه الوتد / الحلقة O لأعلى ، أثناء ملء الوعاء. قم بفك الأغطية بعناية من منافذ الحقن.
5. تأكد من أن المحبس في الوضع المفتوح (الشكل 2C). اسكب الوسائط بعناية من الوعاء في حاوية نفايات ، أو قم بإزالة الوسائط باستخدام ماصة مصلية ، أو قم باستنشاقها باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة متصلة بنظام التفريغ ، دون لمس غشاء الأكسجين.
6. أغلق بإحكام الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على مزرعة خلايا المخزون واقلبه برفق عدة مرات لخلط المحتويات جيدا.
7. ارسم 10 مل من مخزون زراعة الخلايا من أنبوب 50 مل باستخدام ماصة مصلية معقمة جديدة. التقط الوعاء وقم بإمالته بحيث يكون منفذ التعبئة باتجاه الأعلى ثم قم بتوزيع مخزون زراعة الخلايا بعناية في الوعاء من خلال منفذ التعبئة.
   ملاحظة: كن حذرا وراقب مستوى الصوت حتى لا تتسرب الثقافة عبر منافذ الحقن أثناء إمالة الوعاء.
8. تهدف إلى ملء السفينة مباشرة إلى أعلى شفة منفذ التعبئة دون انسكاب ؛ قم بإمالة الوعاء لأسفل أثناء ملئه لتجنب انسكابه. احرص على عدم لمس غشاء الأوكسجين بالماصة لأنه هش للغاية.
   ملاحظة: قد تستغرق عملية ملء الوعاء بعض الممارسة ؛ التحلي بالصبر والذهاب ببطء. إذا تشكل فيلم فقاعة عند فتح منفذ التعبئة ، فسوف يتداخل ذلك مع تحميل الوعاء. إذا حدث هذا ، فاضغط برفق على الوعاء لكسر الختم الناتج عن فيلم الفقاعة.
9. بمجرد تحميل الوعاء ، ضع غطاء منفذ التعبئة بعناية مرة أخرى ، مع التأكد من عدم لمس الوتد / الحلقة O.
10. ضع على المحاقن.
    ملاحظة: يوجد منفذا حقنة على وجه السفينة (الشكل 2 أ). سيحمل أحدهما حقنة فارغة ، والآخر سيحمل حقنة مليئة بزراعة الخلايا (الشكل 2E).
    1. أولا ، قم بتوصيل المحقنة الفارغة سعة 3 مل بأحد منافذ الحقن ، مع التأكد من أن المحقنة مكتئبة تماما.
       ملاحظة: قم بضخ المحاقن عدة مرات قبل توصيلها بالوعاء لأنها ضيقة بعض الشيء في البداية. افعل ذلك داخل خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على العقم.
    2. أغلق الأنبوب المخروطي سعة 15 مل بإحكام مع 10 مل من مزرعة الخلايا المقتبسة واقلبه برفق عدة مرات لخلط المحتويات جيدا.
    3. بعد ذلك ، قم بغمر المحقنة الثانية سعة 3 مل بعناية في ثقافة الخلايا ووضع بعض الثقافة. لتقليل فقاعة الهواء في الجزء العلوي من المحقنة ، قم بتوزيعها تماما في الأنبوب ، ثم ارسم 3 مل من الثقافة.
    4. قم بتوصيل المحقنة المملوءة بمنفذ الحقنة المتبقي ، وقم بتعقيم المحاقن بعناية وحول منفذ التعبئة باستخدام وسادة الإيثانول. لا تحصل على الإيثانول على غشاء الأكسجين. الآن السفينة جاهزة للتخلص من الفقاعات.
       ملاحظة: يصعب تحميل المحقنة الثانية المملوءة للوعاء الثاني نظرا لعمق الأنبوب سعة 15 مل. يساعد على إمالة الأنبوب أثناء ملء المحقنة للحفاظ على الختم بين المحقنة التي يتم ملؤها وثقافة الخلية.
    5. كرر الخطوات 3.3-3.10 للسفن المتبقية. إذا كان هناك كمية غير كافية قليلا من زراعة الخلايا المتبقية في الأنبوب المخروطي 50 مل للوعاء الأخير (على سبيل المثال ، 9.5 مل بدلا من 10 مل) ، استرجع الكمية المتبقية من الأنبوب المخروطي 15 مل المستخدم لتحميل المحاقن.
       ملاحظة: لا يلزم أن تتم الخطوات التالية داخل خزانة أمان بيولوجي معقمة ، حيث أصبحت السفينة الآن نظاما مغلقا ومعقما.

4. إزالة الفقاعات من الأوعية

ملاحظة: الفقاعات أمر لا مفر منه في هذا الإعداد ويجب إزالتها باستمرار طوال فترة العلاج (الشكل 3). يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع.

1. تأكد من أن محبس منفذ الحقن في الوضع المغلق (الشكل 2 د) للحد من هجرة الخلايا والفقاعات من المحاقن إلى الأوعية. هذا مهم بشكل خاص في وقت لاحق أثناء العلاج (تمت مناقشته أدناه). لجمع الفقاعات الأولية ، اقلب الوعاء رأسا على عقب واضغط على جانبه عدة مرات.
2. اقلب الوعاء بسرعة للخلف ليواجه لأعلى ثم بزاوية طفيفة متجهة بعيدا بحيث تطفو جميع الفقاعات إلى الجانب العلوي من الوعاء (الشكل 3 ب).
3. قم بمناورة الفقاعات الموجودة أسفل المنفذ باستخدام المحقنة الفارغة وشاهدها تبدأ في الدخول إلى المنفذ. افتح كلا من محبس منفذ المحقنة (الشكل 2C).
4. اضرب الوعاء برفق لتشجيع الفقاعات على الطفو في المحقنة الفارغة. تمتص ببطء الفقاعات الكبيرة باستخدام المحقنة الفارغة ، مع الضغط بعناية على المحقنة الكاملة ، للحفاظ على الضغط في الوعاء حتى لا ينفجر غشاء الأكسجين.
   ملاحظة: يجب امتصاص الفقاعات الكبيرة ، في حين يمكن تشجيع الفقاعات الصغيرة والفقاعات الدقيقة على الطفو في المحقنة عن طريق المناورة بها في منافذ الحقن وضرب الوعاء برفق. بعد بضع ساعات من العلاج ، من المهم للغاية تقليل "التلوث المتبادل" بين الخلايا الموجودة في المحاقن والخلايا الموجودة في وعاء الثقافة. وذلك لأن الخلايا الموجودة في المحاقن لا تتلقى نفس الكمية من الأوكسجين أو التعرض لرشاش الرذاذ كما تفعل الخلايا الموجودة في الوعاء.
5. كرر الخطوات 4.2-4.4 عدة مرات لضمان إزالة جميع الفقاعات. قم بإزالة جميع الفقاعات بما في ذلك الفقاعات الدقيقة من الأوعية.
   ملاحظة: يمكن رؤية الفقاعات بسهولة من خلال غشاء الأوكسجين (الجزء الخلفي من الوعاء) عندما يستهدف الوعاء مصدر ضوء (نافذة ، ضوء ، إلخ). عند تنفيذ الخطوتين 4.2 و 4.3 ، انظر إلى الفقاعات التي تتحرك من الجزء الخلفي من الوعاء للمساعدة في تصور الفقاعات التي يصعب رؤيتها.
6. عندما تتم إزالة الفقاعات بشكل فعال ، أغلق محبس منفذ المحقنة. حافظ على تشغيل المحاقن أثناء العلاج للسماح بإزالة الفقاعات اللاحقة ، مما يضمن أن الحجم في كلتا الحقنتين متساو تقريبا.

5. ربط السفينة بالقاعدة الدوارة

1. امسح بعناية سطح القاعدة الدوارة وكابل الشريط بنسبة 70٪ إيثانول.
2. تأكد من توصيل كبل الشريط المرفق بموفر الطاقة. ضع القاعدة الدوارة في الحاضنة وقم بتوصيل كابل الشريط بالقاعدة. تأكد من إبقاء مصدر الطاقة بالقرب من الحاضنة ولكن خارجها. يصور الشكل 4 القاعدة الدوارة ومصدر الطاقة للسياق.
3. قم بتوصيل وعاء معالجة SMG عن طريق اصطفاف خيوط الوعاء بالوتد الدوار وتدوير الوتد الدوار برفق على القاعدة في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة. تأكد من توصيل السفينة بإحكام. تأكد من أن الحاضنة تحافظ على رطوبة قريبة من 100٪ عن طريق ملء صينية المياه بكمية كافية من مياه التناضح العكسي (RO).
4. اختر سرعة دوران مناسبة (دورة في الدقيقة). اضبط سرعة الدوران لتتناسب مع سرعة ترسيب الخلايا ، بحيث لا "تسقط الخلايا عبر الوسائط" على الإطلاق ولكن ينتهي بها الأمر بالدوران في مسار مداري صغير. يتم تصور هذه الظاهرة كمخطط تخطيطي في الشكل 1.
   ملاحظة: توصي الشركة ببدء الدوران عند 8-10 دورة في الدقيقة للخلايا الليمفاوية. في هذه الحالة ، تم تدوير خلايا NK92 عند 11 دورة في الدقيقة ، كما هو موضح في ورقة سابقة¹⁷. اعتمادا على حجم الخلية ، يجب زيادة عدد الدورات في الدقيقة للخلايا الأكبر وتقليل الخلايا الأصغر. ينطبق نفس النمط إذا كانت الخلايا المستخدمة تميل إلى التكتل أثناء الزراعة. يرجى الاطلاع على قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع.

6. العلاج

1. اختر مدة العلاج المناسبة لتطبيق البحث ، والتي قد تعتمد على معلمات وظيفة الخلية / علم وظائف الأعضاء التي يتم فحصها. يرجى الاطلاع على قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع.
   ملاحظة: في هذه الحالة ، تعرضت خلايا NK92 لعلاج رشاش 72 ساعة ، بناء على نتائج الدراسات السابقة^18,19. سوف تتشكل الفقاعات حتما طوال فترة العلاج وستحتاج إلى إزالتها. يمكن إيقاف الدوران لفترة وجيزة وإعادة تشغيله لتسهيل ذلك. راجع الخطوة 7.1 لمعرفة كيفية إزالة سفينة SMG بأمان.
2. في اليوم الأول من إعداد العلاج ، تحقق من تكوين الفقاعات كل بضع ساعات عن طريق تكرار الخطوات 4.2-4.6. بعد اليوم الأول ، تحقق من الأوعية حسب الضرورة (مرة واحدة على الأقل يوميا) ، كرر الخطوات 4.2-4.6 ، حتى نهاية العلاج.

7. حصاد الخلايا من الأوعية

1. بمجرد انقضاء طول العلاج المخطط له ، أوقف الدوران وفك الجهاز. قم بإزالة وعاء معالجة SMG عن طريق تثبيت الوعاء برفق أثناء تدوير الوتد الدوار للجهاز في اتجاه عقارب الساعة.
2. أحضر قارورة التحكم ، والتحكم في وعاء 1G ، ووعاء SMG المعالج في خزانة أمان بيولوجي معقمة.
3. خذ كل وعاء (1G و SMG فقط ؛ وليس القارورة) واقلبه رأسا على عقب بحيث يواجه لأسفل وضربه برفق لتعليق جميع الخلايا. بعد ذلك ، أدر الوعاء على جانبه مع منفذ التعبئة نحو الأسفل واضغط على الوعاء مرة أخرى لتشجيع الخلايا نحو منفذ التعبئة من أجل الشفط الفعال.
4. تعامل مع كل سفينة على حدة. قم بفك المحاقن من المنفذين وتخلص منها في النفايات البيولوجية. افتح محبس على منافذ الحقن.
5. قم بإزالة غطاء منفذ التعبئة بعناية وارسم المحتويات باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 10 مل ، مع إمالة الوعاء أثناء تفريغه. قم بتوزيع محتويات مجموعات "القارورة" و "1G" و "SMG" في أنابيب مخروطية سعة 15 مل تحمل علامات فردية.
6. أغلق كل أنبوب واقلبه برفق عدة مرات للتأكد من خلطه بشكل صحيح. استخدم الطريقة المفضلة لتحديد تركيز وصلاحية ثقافة الخلية الناتجة للتحضير للاستخدام في المقايسات التجريبية اللاحقة.

النتائج

تعتبر طريقة الاستزراع هذه ناجحة إذا 1) كان تكاثر الخلايا متسقا تقريبا عبر المجموعات الضابطة (ومن الناحية المثالية جميع المجموعات التجريبية) ، 2) كان الانتشار مناسبا نظرا لكثافة البذر وطول المعالجة ووقت مضاعفة نوع / خط الخلية ، و 3) كانت صلاحية الخلايا المحصودة 85٪ أو أعلى (الجدول 1 ). م...

Discussion

بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. هنا ، تم وصف طريقة زراعة الخلايا لإخضاع الخلايا الليمفاوية لرش?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)	Synthecon	D-410	Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL)	BD	309657	For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line	ATCC	CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes	Fisher Scientific	86.1254.001
T25 suspension culture flasks	Sarsedt	83.3910.502	For flask control