Culture de lymphocytes en microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotatif

Résumé

Il s’agit d’un guide étape par étape pour l’utilisation d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce pour cultiver des lymphocytes en microgravité simulée à l’aide de récipients de culture jetables spécialisés. Cette méthode de culture peut être appliquée à toute culture cellulaire de type suspension.

Résumé

Compte tenu des limites actuelles de la recherche biologique dans l’espace, il existe quelques options pour soumettre la culture cellulaire à la microgravité simulée (SMG) sur Terre. Ces options varient dans leurs méthodes, leurs principes et leur aptitude à être utilisées avec la culture cellulaire en suspension. Ici, une méthode de culture cellulaire est décrite pour soumettre les lymphocytes à une microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce, également connu sous le nom de clinostat 2D ou de dispositif de récipient à paroi rotative (RWV). Cette méthode de culture cellulaire utilise le principe de l’annulation du vecteur de gravité moyenné dans le temps pour simuler la microgravité en faisant tourner les cellules sur un axe horizontal. Les cellules cultivées dans ce système peuvent être récoltées et utilisées dans de nombreux tests expérimentaux différents pour évaluer les effets de la microgravité simulée sur la fonction cellulaire et la physiologie. La technique de culture peut varier légèrement selon le type de cellule ou la lignée utilisée, mais la méthode décrite ici peut être appliquée à toute culture cellulaire de type suspension.

Introduction

Il a été démontré que les vols spatiaux ont un impact sur de nombreux aspects de la physiologie humaine, y compris le système immunitaire. De nombreuses études ont démontré des signes de dérégulation immunitaire à la suite de vols spatiaux in vivo et d’exposition à la microgravité simulée (SMG) in vitro 1,2,3,4. Un aspect majeur de l’environnement spatial qui a un impact sur la physiologie humaine est la microgravité. La microgravité fait référence à « l’apesanteur » ressentie en raison des faibles forces gravitationnelles dans l’environnement spatial⁵. Alors que l’humanité se prépare à des missions spatiales plus longues vers la Lune et Mars, davantage de recherches doivent être menées pour atténuer les risques graves pour la santé des astronautes.

Des conditions réelles de microgravité pour la recherche scientifique peuvent être obtenues dans l’espace à bord de la Station spatiale internationale (ISS) ou dans des nanosatellites lancés en orbite; Cependant, ces options peuvent être incroyablement coûteuses et complexes à orchestrer. Compte tenu des limites actuelles de la recherche biologique dans l’espace, plusieurs options existent pour induire une microgravité réelle et SMG sur Terre. Il existe des opérations à grande échelle qui peuvent produire de courtes périodes de microgravité réelle sur Terre, y compris des tours de largage, des vols paraboliques et des fusées-sondes. Cependant, ces méthodes ne sont pas trop adaptées à l’étude des effets de la microgravité sur les systèmes biologiques, en grande partie en raison de leurs courtes périodes de traitement en microgravité (c.-à-d. de quelques secondes à 20 minutes). Ces méthodes sont examinées plus en détail ailleurs ^5,6. Les options adaptées à la culture cellulaire biologique comprennent des dispositifs à petite échelle tels que des clinostats 2D ou des dispositifs à cuve à paroi rotative (RWV) et des clinostats 3D ou des machines de positionnement aléatoire (RPM). Ces dispositifs peuvent être installés à l’intérieur d’incubateurs de culture cellulaire maintenus à 37 °C et 5% de CO₂, et ils font tourner la culture cellulaire soit sur un axe horizontal (2D), soit sur deux axes perpendiculaires (3D)⁵. Cependant, il est important de souligner que ces méthodes de culture produisent du SMG par opposition à la microgravité réelle, qui est la plus réalisable dans l’espace pour les contextes de recherche biologique.

L’objectif du présent article est de décrire les étapes à suivre pour soumettre les lymphocytes à l’ASG à l’aide d’un dispositif RWV (Table of Materials) disponible dans le commerce, qui relève de la classification clinostat 2D. Bien qu’il existe un protocole général disponible auprès du fabricant pour l’utilisation de cet appareil, le présent article vise à couvrir les étapes de dépannage et d’optimisation plus en détail. Cet article couvre également la théorie derrière la façon dont ce dispositif fonctionne pour produire du SMG en culture cellulaire en suspension, en particulier avec des lymphocytes. Dans ce contexte, la culture cellulaire en suspension fait référence aux cellules qui se développent librement dans des milieux de culture supplémentés, sans adhérer à un échafaudage supplémentaire. De nombreux types de cellules sont cultivés en culture cellulaire en suspension, y compris les lymphocytes. Les lymphocytes sont des cellules du système immunitaire, y compris les cellules T, B et Natural Killer (NK), qui résident dans les organes lymphoïdes et la circulation sanguine⁷.

Le clinostat RWV 2D décrit ici fonctionne sur le principe de l’annulation du vecteur de gravité moyenné dans le temps ^5,6,8,9, selon lequel le vecteur de gravité est randomisé par rotation de la culture cellulaire sur un axe horizontal. Ceci est réalisé en faisant correspondre la vitesse de rotation du récipient de culture à la vitesse de sédimentation des cellules. Tant que la vitesse de rotation du récipient de culture correspond bien à la vitesse de sédimentation des cellules, les cellules sont maintenues en chute libre et incapables de sédimenter, comme c’est le cas dans l’environnement spatial. Après une phase initiale d’accélération, le milieu dans le récipient de culture atteint finalement la « rotation du corps solide » au fil du temps. Cette rotation horizontale induit également un écoulement laminaire dans le récipient de culture cellulaire. Cela crée un environnement de « faible cisaillement », étant donné que la contrainte de cisaillement induite sur les cellules par l’écoulement laminaire est bien inférieure à celle de l’écoulement turbulent. Cependant, étant donné que le clinostat n’est pas un système parfait, de petits mouvements de fluide laminaire sont introduits, qui infligent une contrainte de cisaillement minimale aux cellules. En tant que telles, les cellules en suspension dans le milieu sont entraînées par ce flux pendant la rotation. Pendant la rotation horizontale, le vecteur de gravité agit sur les cellules et les amène dans une trajectoire oscillante, comme le montre la figure 1. Une autre petite source de contrainte de cisaillement est causée par les cellules qui « tombent » à travers le milieu, provoquant un flux laminaire autour des cellules. Lorsque le récipient de culture tourne sur un axe horizontal, le vecteur de gravité subi par les cellules tourne également. Au fil du temps, ce vecteur gravitationnel rotatif se rapproche de zéro; ce phénomène est appelé nullification du vecteur de gravité moyen dans le temps et induit un état de SMG 5,6,8,9. Ce dispositif a été utilisé pour étudier les effets du SMG sur de nombreux types de cellules, dont certaines sont couvertes dans les références^10,11,12. Vous trouverez d’autres exemples sur le site Web du fabricant de l’appareil.

Cet appareil RWV utilise des « vaisseaux à rapport d’aspect élevé » (HARV) spécialisés disponibles auprès du fabricant de l’appareil. Ces HARV contiennent 10 mL de culture cellulaire chacun; cependant, des VHR de 50 mL sont également disponibles. Des HARV de 10 mL ou de 50 mL peuvent être utilisés selon le nombre de cellules nécessaires pour effectuer les essais expérimentaux en aval, ce qui est décrit plus en détail dans la section de discussion. Les HARV sont faits de polycarbonate et comprennent une membrane d’oxygénation en silicone pour permettre l’échange gazeux pendant la culture cellulaire. Cela maintient le pH du milieu cellulaire et permet une respiration cellulaire efficace. Il y a un orifice de remplissage principal et deux orifices de seringue bouchés sur la face du navire (figure 2A). Après le chargement de la culture cellulaire par l’orifice de remplissage principal, deux seringues sont chargées sur le récipient pour aider à l’élimination des bulles. Lors de l’utilisation des vaisseaux de 10 mL, deux seringues de 3 mL fonctionnent bien. Une seringue est fixée au dispositif vide, la seringue est complètement enfoncée et l’autre est fixée remplie de 3 mL de culture cellulaire (figure 2E). Ceux-ci sont utilisés en combinaison pour éliminer les bulles du récipient, ce qui est important pour maintenir le traitement SMG. En général, il est conseillé de mettre en place deux contrôles négatifs, que l’on peut appeler le contrôle « Flask » et le contrôle « 1G ». Le témoin « Flask » correspond aux cellules cultivées dans un ballon de culture cellulaire en suspension standard T25. Le contrôle 1G correspond aux cellules qui sont cultivées dans le récipient de culture spécialisé de 10 mL, qui est simplement placé dans l’incubateur (c’est-à-dire sans être soumis au traitement SMG). Veuillez consulter la section Discussion pour plus de détails sur les contrôles.

La méthode décrite ici convient à tout chercheur cherchant à étudier les effets du SMG sur les lymphocytes, en mettant l’accent sur les cellules NK en utilisant la lignée cellulaire NK92¹³. Les résultats de ces études pourraient nous aider à mieux comprendre et atténuer les effets néfastes des vols spatiaux sur le système immunitaire humain.

Protocole

REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique stérile.

1. Préparation des récipients pour la culture cellulaire

1. Sortez les récipients de culture de l’emballage en plastique. Étiquetez chaque récipient sur le bord en fonction du type de cellule ou de la lignée utilisée, qu’il s’agisse du témoin (1G) ou du traitement (SMG) et de toute autre information pertinente.
2. Stabilisez le récipient et ouvrez l’orifice de remplissage avec précaution, sans toucher la cheville du bouchon de l’orifice de remplissage/joint torique. Placez le bouchon sur un tampon d’éthanol, avec la cheville / joint torique vers le haut, pendant que le récipient est en cours de remplissage. Ne retirez pas les capuchons des orifices de la seringue.
   REMARQUE: Si la cheville / joint torique est accidentellement touché, vaporisez la cheville de bouchon avec de l’éthanol à 70% et laissez-la reposer (tournée vers le haut) pendant quelques instants pendant que vous remplissez le récipient. Lorsque vous êtes prêt à refermer l’orifice de remplissage, ramassez le bouchon avec une lingette en papier frais pour bien sécher le bouchon avant de le remettre sur le récipient.
3. Charger le récipient avec 10 ml du milieu complet approprié pour la culture cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique stérile et remettre soigneusement le bouchon sur l’orifice de remplissage.
   REMARQUE: Ici, la lignée cellulaire NK NK a été utilisée, qui a été cultivée dans un milieu GM1, comme précédemment validé dans un essai clinique utilisant des cellules NK92 comme thérapie cellulaire¹⁴. Le milieu de culture utilisé dépend de la lignée cellulaire ou du type de cellule cultivé. Veuillez consulter le site Web du fournisseur pour connaître la recette de média appropriée pour la lignée cellulaire ou le type de cellule utilisé.
4. Assurez-vous que les bouchons de l’orifice de la seringue et l’orifice de remplissage sont bien fermés et placez les récipients remplis dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ tout en effectuant les étapes suivantes pour amorcer les récipients pour la culture cellulaire.
   REMARQUE: Cette étape d’amorçage permet de minimiser la formation de grosses bulles pour faciliter l’expulsion des bulles plus tard à l’étape 6.

2. Préparation de la culture cellulaire mère pour la configuration du traitement SMG

1. Lorsqu’elles ne sont pas utilisées, entreposer les cellules d’intérêt à une température inférieure à -130 °C ou, idéalement, dans une phase vapeur d’azote liquide.
2. Au moins 1 semaine avant la mise en place du traitement prévu, décongelez les cellules et cultivez-les en utilisant la recette appropriée du milieu de culture cellulaire trouvée sur le site Web du fournisseur. Planifiez le nombre de cellules nécessaires pour mettre en place le traitement (détails ci-dessous dans les étapes suivantes) et assurez-vous de commencer les cultures suffisamment tôt pour permettre une prolifération et une adaptation suffisantes à la culture.
3. Conserver la culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ . De plus amples détails sur la pratique standard de la culture cellulaire sont fournis ailleurs¹⁵.
4. Le jour de la configuration prévue du traitement SMG, déterminer la concentration initiale et la viabilité de la culture cellulaire initiale.
   1. Utilisez la méthode préférée pour déterminer la concentration de la culture cellulaire initiale (p. ex., hémocytomètre, ViCell, cytométrie en flux, etc.). Prendre note de la concentration de cellules viables (cellules par mL) et de la viabilité (%) des cellules, en veillant à ce que la viabilité soit idéalement supérieure à 85 %. Un protocole d’utilisation d’un hémocytomètre peut être trouvé ailleurs¹⁶.
5. Déterminer la densité/concentration d’ensemencement cellulaire appropriée de la culture cellulaire pour le traitement par SMG en tenant compte de la plage de concentration cellulaire optimale du type ou de la lignée cellulaire en question, de leur temps de doublement et de la durée du traitement par SMG. Veuillez vous référer à la section Discussion pour plus de détails.
   REMARQUE: D’après l’expérience, la plage de concentration optimale pour les cellules NK92 est comprise entre 0,3 x 10 6 - 1,2 x 10⁶ cellules / mL. Généralement, ces cellules ont un temps de doublement de 48-72 h et sont nourries tous les 2-3 jours en tant que telles. Étant donné que la durée du traitement était de 72 h, les cellules ont été ensemencées à l’extrémité inférieure de leur plage optimale à 0,4-0,5 x 10⁶ cellules/mL. Le fournisseur recommande également cette densité d’ensemencement lors du démarrage de la culture cellulaire initiale à partir d’un flacon frais de cellules NK92.
6. Déterminer le volume de culture cellulaire mère nécessaire pour mettre en place le traitement et les témoins.
   REMARQUE : 10 mL de culture cellulaire sont nécessaires par groupe expérimental. Si trois groupes expérimentaux sont mis en place (c.-à-d. un traitement : « SMG » et deux témoins négatifs : « Flask » et « 1G »), 10 mL supplémentaires de culture cellulaire sont suffisants pour être aliquotes dans un tube de 15 mL utilisé pour charger les seringues HARV. Il s’agit de 40 mL au total, qui peuvent fluctuer en fonction du plan expérimental spécifique.
7. Déterminez le nombre de cellules nécessaires à la mise en place du traitement.
   1. Calculer le nombre total de cellules nécessaires en multipliant la densité d’ensemencement choisie (cellules/mL) par le volume total nécessaire (mL).
      REMARQUE : D’après l’expérience acquise avec NK92, 40 mL de culture cellulaire mère sont préparés comme indiqué ci-dessus à une concentration d’ensemencement de 0,4 à 0,5 x 10⁶ cellules/mL. En tant que tel, 16-20 x 10^{6 cellules} NK92 sont nécessaires pour compléter la configuration de traitement typique. Pour la lignée cellulaire NK92, l’utilisation d’un peu plus de cellules est préférable à un peu moins de cellules pour maintenir une viabilité élevée tout au long du traitement.
8. Déterminez le volume de culture cellulaire initiale à faire tourner.
   1. Étant donné que la concentration cellulaire est représentée en cellules/mL, diviser le nombre total de cellules (cellules) nécessaires à l’expérience par la concentration initiale mesurée de la culture cellulaire (cellules/mL).
      REMARQUE : Par exemple, si 16 x 10 6 cellules sont nécessaires et que la concentration initiale de la culture est de 0,8 x 10⁶ cellules/mL, 20 mL de la culture doivent être filés.
9. Faire la culture cellulaire mère finale.
   1. Centrifuger le nombre approprié de cellules à 300 x g pendant 8 minutes dans un tube conique de 50 mL.
   2. Versez délicatement le surnageant dans un récipient à déchets et agitez doucement le tube pour remettre en suspension la pastille dans le petit volume restant.
   3. Resuspendre les cellules dans le volume approprié de milieu complet chauffé (37 °C) pour amener la culture à la densité de semis désirée. Ce volume a été calculé à l’étape 2.6.
   4. Boucher solidement le tube de 50 ml et le retourner doucement plusieurs fois pour bien mélanger la suspension cellulaire.
      REMARQUE: Si plus de 50 mL sont nécessaires pour mettre en place l’expérience complète, il est préférable de centrifuger le nombre total de cellules nécessaires dans un tube conique de 50 mL et de le remettre en suspension dans la moitié du volume nécessaire. Ensuite, bien mélanger et faire une dilution 1:2 dans un tube conique séparé de 50 mL. Par exemple, si 100 mL sont nécessaires à 0,4 x 10 6 cellules/mL, faire tourner 40 x 10⁶ cellules dans un tube de 50 mL, remettre en suspension dans 50 mL de média, transférer 25 mL dans un autre tube de 50 mL, puis compléter les deux avec 25 mL de média frais.

3. Récipients de chargement avec culture de cellules mères

1. Récupérez les récipients amorcés dans les médias de l’incubateur.
2. Si une fiole témoin est utilisée, charger une fiole de culture en suspension T25 avec 10 mL de culture cellulaire provenant de la souche préparée ci-dessus. De plus, ajoutez 10 mL de culture cellulaire mère dans un tube conique séparé de 15 mL, qui sera utilisé pour charger les seringues.
3. Dévissez les bouchons d’orifice de la seringue pour les retirer du navire et vous assurer que les robinets d’arrêt sont en position ouverte (figure 2C).
4. Stabilisez le récipient et ouvrez l’orifice de remplissage avec précaution, sans toucher la cheville du bouchon de l’orifice de remplissage/joint torique. Placez le bouchon sur un tampon d’éthanol, avec la cheville / joint torique vers le haut, pendant que le récipient est en cours de remplissage. Dévissez délicatement les bouchons des orifices de seringue.
5. Assurez-vous que les robinets d’arrêt sont en position ouverte (figure 2C). Versez soigneusement le fluide du récipient dans un conteneur à déchets, retirez le média à l’aide d’une pipette sérologique ou aspirez-le à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile fixée au système de vide, sans toucher la membrane d’oxygénation.
6. Fermez hermétiquement le tube conique de 50 ml qui contient la culture cellulaire mère et retournez-le doucement plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.
7. Prélever 10 ml de stock de culture cellulaire à partir du tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique fraîchement stérile. Ramassez le récipient et inclinez-le de manière à ce que l’orifice de remplissage soit vers le haut, puis distribuez soigneusement le stock de culture cellulaire dans le récipient par l’orifice de remplissage.
   REMARQUE: Soyez prudent et surveillez le volume afin que la culture ne se répande pas à travers les orifices de la seringue lors de l’inclinaison du récipient.
8. Viser à remplir le navire jusqu’au sommet de la lèvre de l’orifice de remplissage sans renverser; Inclinez le récipient vers le bas pendant qu’il est rempli pour éviter de se renverser. Attention à ne pas toucher la membrane d’oxygénation avec la pipette car elle est très fragile.
   REMARQUE : Le processus de remplissage du récipient peut prendre un certain temps; Soyez patient et allez-y lentement. Si un film de bulles se forme à l’ouverture de l’orifice de remplissage, cela interférera avec le chargement du navire. Si cela se produit, frappez doucement le récipient pour briser le joint créé par le film de bulles.
9. Une fois le navire chargé, replacez soigneusement le bouchon de l’orifice de remplissage, en veillant à ne pas toucher la cheville / le joint torique.
10. Placer sur les seringues.
    REMARQUE : Il y a deux orifices de seringue sur la face avant du navire (figure 2A). L’un tiendra une seringue vide et l’autre une seringue pleine de culture cellulaire (Figure 2E).
    1. Tout d’abord, fixez la seringue vide de 3 ml à l’un des orifices de la seringue, en vous assurant que la seringue est complètement enfoncée.
       REMARQUE: Pompez les seringues plusieurs fois avant de les attacher au récipient car elles sont un peu serrées au début. Faites-le à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité.
    2. Fermez hermétiquement le tube conique de 15 ml avec 10 ml de culture cellulaire aliquote et inversez-le doucement plusieurs fois pour bien mélanger le contenu.
    3. Ensuite, semi-immergez soigneusement la deuxième seringue de 3 ml dans la culture cellulaire et prélevez une culture. Pour minimiser la bulle d’air dans le haut de la seringue, redistribuez-la complètement dans le tube, puis aspirez 3 ml de la culture.
    4. Fixez la seringue remplie au port de seringue restant et désinfectez soigneusement les seringues et autour de l’orifice de remplissage avec un tampon d’éthanol. Ne pas mettre d’éthanol sur la membrane d’oxygénation. Maintenant, le navire est prêt à être débarrassé des bulles.
       REMARQUE : La deuxième seringue remplie pour le deuxième récipient est plus difficile à charger étant donné la profondeur du tube de 15 mL. Il aide à incliner le tube tout en remplissant la seringue pour maintenir l’étanchéité entre la seringue en cours de remplissage et la culture cellulaire.
    5. Répétez les étapes 3.3 à 3.10 pour les autres navires. S’il reste une quantité légèrement insuffisante de culture cellulaire dans le tube conique de 50 mL pour le dernier récipient (p. ex. 9,5 mL au lieu de 10 mL), prélever la quantité restante du tube conique de 15 mL utilisé pour charger les seringues.
       REMARQUE : Les étapes suivantes n’ont pas besoin d’être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique stérile, car le récipient est maintenant un système fermé et stérile.

4. Éliminer les bulles des vaisseaux

REMARQUE : Les bulles sont inévitables dans cette configuration et doivent être éliminées de manière cohérente tout au long du traitement (Figure 3). Veuillez vous référer à la section Discussion pour plus de détails à ce sujet.

1. Assurez-vous que les robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue sont en position fermée (figure 2D) afin de limiter la migration des cellules et des bulles des seringues dans les vaisseaux. Ceci est particulièrement important plus tard pendant le traitement (voir ci-dessous). Pour recueillir les bulles initiales, retournez le récipient et frappez le côté de celui-ci plusieurs fois.
2. Retournez rapidement le récipient vers l’arrière, puis sur un léger angle tourné vers l’extérieur afin que les bulles flottent toutes vers le haut du navire (Figure 3B).
3. Manœuvrez les bulles sous le port avec la seringue vide et regardez-les commencer à entrer dans le port. Ouvrez les deux robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue (Figure 2C).
4. Frappez doucement le récipient pour encourager les bulles à flotter dans la seringue vide. Aspirez lentement les grosses bulles avec la seringue vide, tout en appuyant soigneusement sur la seringue pleine, pour maintenir la pression dans le récipient afin que la membrane d’oxygénation n’éclate pas.
   REMARQUE: Les grosses bulles devront être aspirées, tandis que les petites bulles et les microbulles peuvent être encouragées à flotter dans la seringue en les manœuvrant dans les orifices de la seringue et en frappant doucement le récipient. Après quelques heures de traitement, il est très important de minimiser la « contamination croisée » entre les cellules dans les seringues et les cellules dans le récipient de culture. En effet, les cellules des seringues ne reçoivent pas la même quantité d’oxygénation ou d’exposition au SMG que les cellules du vaisseau.
5. Répétez les étapes 4.2 à 4.4 plusieurs fois pour vous assurer que toutes les bulles sont supprimées. Enlevez toutes les bulles, y compris les microbulles, des vaisseaux.
   NOTE: Les bulles peuvent être facilement vues à travers la membrane d’oxygénation (arrière du récipient) lorsque le récipient est dirigé vers une source de lumière (fenêtre, lumière, etc.). Lorsque vous effectuez les étapes 4.2 et 4.3, regardez les bulles qui se déplacent de l’arrière du vaisseau pour aider à visualiser les bulles les plus difficiles à voir.
6. Lorsque les bulles ont été efficacement éliminées, fermez les robinets d’arrêt de l’orifice de la seringue. Gardez les seringues pendant le traitement pour permettre l’élimination ultérieure des bulles, en veillant à ce que le volume dans les deux seringues soit approximativement égal.

5. Fixation du récipient à la base tournante

1. Essuyez soigneusement la surface de la base rotative et du câble ruban avec de l’éthanol à 70%.
2. Assurez-vous que le câble ruban fourni est connecté au bloc d’alimentation. Placez la base rotative dans l’incubateur et fixez le câble ruban à la base. Assurez-vous que l’alimentation électrique est maintenue à proximité mais à l’extérieur de l’incubateur. La figure 4 illustre la base rotative et l’alimentation électrique pour le contexte.
3. Fixez le récipient de traitement SMG en alignant les filetages du récipient à la cheville rotative et en tournant doucement la cheville rotative sur la base dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Assurez-vous que le navire est bien attaché. Assurez-vous que l’incubateur maintient près de 100 % d’humidité en remplissant le bac à eau avec suffisamment d’eau autoclavée par osmose inverse (OI).
4. Choisissez une vitesse de rotation appropriée (tr/min). Ajustez la vitesse de rotation pour qu’elle corresponde à la vitesse de sédimentation des cellules, de sorte que les cellules ne « tombent pas du tout à travers le milieu », mais finissent par tourner sur une petite trajectoire orbitale. Ce phénomène est visualisé sous forme de diagramme schématique à la figure 1.
   REMARQUE: La société recommande de commencer la rotation à 8-10 rpm pour les lymphocytes. Dans ce cas, les cellules NK92 ont été tournées à 11 tr/min, comme démontré dans un article précédent¹⁷. Selon la taille de la cellule, le régime doit être augmenté pour les cellules plus grandes et diminué pour les cellules plus petites. Le même schéma s’applique si les cellules utilisées ont tendance à s’agglutiner pendant la culture. Veuillez consulter la section Discussion pour plus de détails à ce sujet.

6. Traitement

1. Choisissez une durée de traitement appropriée pour la demande de recherche, qui peut dépendre des paramètres de la fonction cellulaire / physiologie à tester. Veuillez consulter la section Discussion pour plus de détails à ce sujet.
   REMARQUE: Dans ce cas, les cellules NK92 ont été soumises à un traitement SMG de 72 h, sur la base des résultats d’études antérieures^18,19. Des bulles se formeront inévitablement tout au long du traitement et devront être enlevées. La rotation peut être brièvement arrêtée et redémarrée pour faciliter cela. Voir l’étape 7.1 pour savoir comment retirer le récipient SMG en toute sécurité.
2. Le premier jour de la mise en place du traitement, vérifiez la formation de bulles toutes les quelques heures en répétant les étapes 4.2 à 4.6. Après le premier jour, vérifiez les vaisseaux si nécessaire (au moins une fois par jour), en répétant les étapes 4.2-4.6, jusqu’à la fin du traitement.

7. Prélèvement de cellules dans les vaisseaux

1. Une fois la durée de traitement prévue écoulée, arrêtez la rotation et démontez l’appareil. Retirez la cuve de traitement SMG en maintenant doucement la cuve immobile tout en tournant la cheville rotative de l’appareil dans le sens des aiguilles d’une montre.
2. Amener la fiole de commande, le récipient de contrôle 1G et le récipient SMG traité dans une enceinte de sécurité biologique stérile.
3. Prenez chaque récipient (1G et SMG seulement; pas le flacon) et retournez-le pour qu’il soit orienté vers le bas et frappez-le doucement pour mettre toutes les cellules en suspension. Ensuite, tournez le récipient sur le côté avec l’orifice de remplissage vers le fond et frappez à nouveau le récipient pour encourager les cellules vers l’orifice de remplissage pour une aspiration efficace.
4. Manipulez chaque navire individuellement. Dévissez les seringues des deux orifices et jetez-les dans les déchets présentant un risque biologique. Ouvrez les robinets d’arrêt des orifices de seringue.
5. Retirez délicatement le bouchon de l’orifice de remplissage et prélevez le contenu à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL, en inclinant le récipient pendant qu’il est vidé. Distribuer le contenu des groupes « Flask », « 1G » et « SMG » dans des tubes coniques de 15 mL étiquetés individuellement.
6. Fermez chaque tube et retournez-les doucement plusieurs fois pour vous assurer qu’ils sont bien mélangés. Utiliser la méthode préférée pour déterminer la concentration et la viabilité de la culture cellulaire résultante afin de se préparer à l’utilisation dans les essais expérimentaux ultérieurs.

Résultats

Cette méthode de culture est considérée comme efficace si 1) la prolifération des cellules est approximativement constante dans tous les groupes témoins (et idéalement dans tous les groupes expérimentaux), 2) la prolifération est appropriée compte tenu de la densité d’ensemencement, de la durée du traitement et du temps de doublement du type ou de la lignée cellulaire, et 3) la viabilité des cellules récoltées est de 85 % ou plus (tableau 1). ). Idéalement, les cellules résultantes dev...

Discussion

Alors que l’humanité se prépare à des missions spatiales plus longues vers la Lune et Mars, davantage de recherches doivent être menées pour atténuer les risques graves pour la santé des astronautes. Un aspect majeur de l’environnement spatial qui a un impact sur la physiologie humaine est la microgravité. Ici, une méthode de culture cellulaire a été décrite pour soumettre les lymphocytes à l’ASG à l’aide d’un système de culture cellulaire rotative disponible dans le commerce.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)	Synthecon	D-410	Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL)	BD	309657	For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line	ATCC	CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes	Fisher Scientific	86.1254.001
T25 suspension culture flasks	Sarsedt	83.3910.502	For flask control