使用旋转细胞培养系统在模拟微重力下培养淋巴细胞

摘要

这是使用市售旋转细胞培养系统使用专用一次性培养容器在模拟微重力下培养淋巴细胞的分步指南。该培养方法可应用于任何悬浮型细胞培养物。

摘要

鉴于目前在太空中进行生物学研究的局限性，在地球上将细胞培养置于模拟微重力（SMG）下存在一些选择。这些选项的方法、原理和与悬浮细胞培养的适用性各不相同。这里描述了一种细胞培养方法，用于使用市售的旋转细胞培养系统（也称为2D clinostat或旋转壁容器（RWV）装置）对淋巴细胞进行模拟微重力。这种细胞培养方法利用时间平均重力矢量零化的原理，通过在水平轴上旋转细胞来模拟微重力。该系统中培养的细胞可以收获并用于许多不同的实验测定，以评估模拟微重力对细胞功能和生理的影响。根据所使用的细胞类型或品系，培养技术可能略有不同，但此处描述的方法可以应用于任何悬浮型细胞培养物。

引言

太空飞行已被证明会影响人体生理学的许多方面，包括免疫系统。许多研究已经证明了由于体内太空飞行和体外暴露于模拟微重力（SMG）而导致免疫失调的证据1，²，^3，4。 影响人体生理的空间环境的一个主要方面是微重力。微重力是指由于空间环境中的低引力而经历的"失重"⁵。随着人类准备进行更长的月球和火星太空任务，需要进行更多的研究来减轻宇航员的严重健康风险。

科学研究的真正微重力条件可以在国际空间站（ISS）上的空间或发射到轨道的纳米卫星中实现;但是，这些选项的编排成本和复杂性可能非常高。鉴于目前在太空中进行生物研究的局限性，在地球上诱导真正的微重力和冲锋枪有几种选择。存在可以在地球上产生短时间真实微重力的大规模操作，包括落塔，抛物线飞行和探空火箭。然而，这些方法并不太适合研究微重力对生物系统的影响，主要是因为它们的微重力处理时间短（即几秒钟到20分钟）。这些方法将在别处更详细地讨论5^，6。适用于生物细胞培养的选项包括小型设备，例如2D恒温器或旋转壁容器（RWV）设备以及3D恒温器或随机定位机（RPM）。这些设备可以设置在保持在37°C和5%CO₂的细胞培养箱内，它们在水平轴（2D）或两个垂直轴（3D^）上旋转细胞培养物5。然而，重要的是要强调，这些培养方法产生的SMG而不是真正的微重力，这在生物研究环境中的太空中最为可行。

本文的目的是概述使用市售RWV设备（材料表）对淋巴细胞进行SMG的步骤，该设备属于2D恒温器分类。虽然制造商提供了用于操作此设备的通用协议，但本文旨在更详细地介绍故障排除和优化步骤。本文还介绍了该装置如何在悬浮细胞培养中产生SMG的理论，特别是淋巴细胞。在这种情况下，悬浮细胞培养是指细胞在补充培养基中自由生长，而不粘附在任何额外的支架上。许多细胞类型在悬浮细胞培养中生长，包括淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的细胞，包括T，B和自然杀伤（NK）细胞，存在于淋巴器官和血液中⁷。

此处描述的RWV 2D恒温器的工作原理是时间平均重力载体^无效5，6，⁸，^9，其中通过水平轴上旋转细胞培养物来随机化重力载体。这是通过将培养容器的旋转速度与细胞的沉降速度相匹配来实现的。只要培养容器的旋转速度与细胞的沉降速度匹配良好，细胞就会保持自由落体，无法沉降，就像在太空环境中所经历的那样。经过初始加速阶段后，培养皿中的培养基最终会随着时间的推移达到"固体旋转"。这种水平旋转也会在细胞培养容器中诱导层流。这创造了一个"低剪切"环境，因为层流在细胞上引起的剪切应力远小于湍流的剪切应力。然而，鉴于clinostat不是一个完美的系统，引入了一些小的层流流体运动，这对细胞造成的剪切应力最小。因此，悬浮在培养基中的细胞在旋转过程中被这种流动拖曳。在水平旋转过程中，重力矢量作用于细胞并使它们进入振荡轨迹，如图 1 所示。剪切应力的另一个小来源是由细胞"落"通过培养基引起的，导致细胞周围的层流。当培养容器在水平轴上旋转时，细胞经历的重力矢量也会旋转。随着时间的推移，这个旋转的重力矢量平均接近零;这种现象称为时间平均重力矢量无效，并诱导SMG⁵，⁶，^8，9的状态。该装置已被用于研究SMG对许多类型细胞的影响，其中一些在参考文献^10，11，12中有所涉及。更多示例可在设备制造商的网站上找到。

此 RWV 设备使用设备制造商提供的专用"高纵横比容器"（HARV）。这些 HARV 每个可容纳 10 mL 细胞培养物;但是，也可以使用 50 mL HARV。可以使用 10 mL 或 50 mL HARV，具体取决于完成任何下游实验测定所需的细胞数量，这将在讨论部分进一步概述。HARV由聚碳酸酯制成，包括硅氧合膜，允许在细胞培养过程中进行气体交换。这维持了细胞培养基的pH值，并允许有效的细胞呼吸。容器表面有一个主填充口和两个带盖的注射器端口（图2A）。通过主进样口装载细胞培养物后，将两个注射器装载到容器上以协助去除气泡。使用 10 mL 容器时，两个 3 mL 注射器工作良好。一个注射器连接到设备是空的，注射器完全压下，另一个连接着填充有3mL细胞培养物（图2E）。这些组合用于去除容器中的气泡，这对于维持SMG处理很重要。一般来说，建议设置两个阴性对照，可以称为"烧瓶"对照和"1G"对照。"Flask"对照对应于在标准T25悬浮细胞培养瓶中生长的细胞。1G对照对应于在专门的10 mL培养容器中生长的细胞，该培养容器只需放置在培养箱中（即，无需进行SMG处理）。有关控件的更多详细信息，请参阅"讨论"部分。

这里描述的方法适用于任何希望研究SMG对淋巴细胞影响的研究人员，特别是通过使用NK92细胞系¹³来研究NK细胞。这些研究的结果可能有助于我们更好地了解和减轻太空飞行对人体免疫系统的不利影响。

研究方案

注意:以下步骤应在无菌生物安全柜内完成。

1. 细胞培养容器的制备

1. 将培养皿从塑料包装中取出。根据所使用的细胞类型/细胞系，是对照（1G）还是处理（SMG）以及任何其他相关信息，在边缘标记每个容器。
2. 稳定容器并小心打开加注口，不要接触加注口盖钉/O 形圈。将盖子放在乙醇垫上，将钉子/O 形圈朝上，同时填充容器。不要从注射器端口上取下盖子。
   注意:如果不小心触摸了钉子/O 形圈，请用 70% 乙醇喷洒盖钉，让它在填充容器时静置（朝上）片刻。准备再次关闭加注口时，用新纸巾拿起盖子，彻底擦干盖子，然后再将其放回容器上。
3. 使用无菌血清移液管在容器中装入 10 mL 用于细胞培养的适当完整培养基，并小心地将盖子放回进样口。
   注意:在这里，使用了NK92 NK细胞系，该细胞系在GM1培养基中培养，如先前在使用NK92细胞作为细胞疗法的临床试验中验证的那样¹⁴。使用的培养基取决于所培养的细胞系或细胞类型。请查看供应商的网站，了解所用细胞系或细胞类型的正确培养基配方。
4. 确保注射器端口盖和填充端口牢固关闭，并将填充的容器放入37°C，5%CO₂ 培养箱中，同时执行后续步骤以启动用于细胞培养的容器。
   注意:此启动步骤有助于最大限度地减少大气泡的形成，以便在步骤6的后面更容易排出气泡。

2. 为SMG处理装置准备储备细胞培养

1. 不使用时，将感兴趣的细胞储存在低于-130°C的温度下，或者理想情况下，储存在液氮气相中。
2. 在设置计划处理前至少 1 周，解冻细胞并使用供应商网站上的适当细胞培养基配方进行培养。计划需要多少细胞来建立治疗（下面将在后续步骤中详细介绍），并确保尽早开始培养，以便充分增殖和适应培养物。
3. 将细胞培养物储存在37°C，5%CO₂ 培养箱中。有关标准细胞培养实践的更多详细信息，详见其他^专题15。
4. 在计划的SMG处理设置当天，确定初始细胞培养物的起始浓度和活力。
   1. 使用优选的方法来确定初始细胞培养物的浓度（例如，血细胞计数器、ViCell、流式细胞术等）。记下细胞的活细胞浓度（细胞/mL）和活力（%），确保活力理想大于85%。使用血细胞计数器的方案可以在其他地方找到¹⁶。
5. 通过考虑特定细胞类型/系的最佳细胞浓度范围、它们的倍增时间和SMG处理的长度，确定用于SMG处理的细胞培养物的适当细胞接种密度/浓度。有关进一步说明，请参阅讨论部分。
   注意:根据经验，NK92细胞的最佳浓度范围在0.3 x 10 6- 1.2 x 10⁶细胞/ mL之间。通常，这些细胞的倍增时间为48-72小时，并且每2-3天喂食一次。鉴于处理长度为72小时，将细胞接种在其最佳范围的下端，为0.4-0.5 x 10⁶个细胞/ mL。供应商还建议在从新鲜的NK92细胞瓶开始初始细胞培养时使用此接种密度。
6. 确定设置处理和对照所需的原液细胞培养体积。
   注意:每个实验组需要10 mL细胞培养物。如果设置三个实验组（即，一个处理:"SMG"和两个阴性对照:"烧瓶"和"1G"），另外10 mL细胞培养物足以等分到用于加载HARV注射器的15 mL管中。总共为 40 mL，可能会根据具体的实验设计而波动。
7. 确定设置治疗所需的细胞数量。
   1. 通过将所选接种密度（细胞/mL）乘以所需的总体积（mL）来计算所需的细胞总数。
      注意:根据NK92的经验，如上所述制备40 mL的原液细胞培养物，接种浓度为0.4-0.5 x 10⁶ 个细胞/ mL。因此，需要16-20 x 10^{6 NK92} 细胞来完成典型的治疗设置。对于NK92细胞系，使用稍多的细胞比使用稍少的细胞更好，以在整个治疗过程中保持高活力。
8. 确定要旋转的初始细胞培养物的体积。
   1. 假设细胞浓度以细胞/mL表示，将实验所需的细胞总数（细胞）除以测量的细胞培养起始浓度（细胞/mL）。
      注意:例如，如果需要16 x 10 6个细胞，并且培养物的起始浓度为0.8 x 10⁶个细胞/ mL，则应旋转20 mL培养物。
9. 进行最终的细胞培养。
   1. 在 50 mL 锥形管中以 300 x g 离心适当数量的细胞 8 分钟。
   2. 小心地将上清液倒入废物容器中，然后轻轻轻弹试管以将沉淀重悬于剩余的小体积中。
   3. 将细胞重悬于适当体积的加热（37°C）完全培养基中，以使培养物达到所需的接种密度。此体积在步骤 2.6 中计算。
   4. 盖紧 50 mL 管，轻轻倒置几次以彻底混合细胞悬液。
      注意:如果需要超过 50 mL 来设置完整的实验，最好在 50 mL 锥形管中离心所需的细胞总数，并将其重悬于所需体积的一半。然后，充分混合并在单独的 50 mL 锥形管中进行 1:2 稀释。例如，如果需要 100 mL 的 0.4 x 10 6 个细胞/mL，请在 50 mL 管中旋转 40 x 10⁶ 个细胞，重悬于 50 mL 培养基中，将 25 mL 转移到另一个 50 mL 管中，然后用 25 mL 新鲜培养基加满两个细胞。

3. 装载装有细胞培养原液的容器

1. 从培养箱中取出培养基引发的容器。
2. 如果使用"烧瓶"对照，则从上述制备的原液中装入装有10 mL细胞培养物的T25悬浮培养瓶。此外，将 10 mL 原液细胞培养物添加到单独的 15 mL 锥形管中，该锥形管将用于加载注射器。
3. 拧下注射器端口盖以将其从容器中取出，并确保旋塞阀处于打开位置（图2C）。
4. 稳定容器并小心打开加注口，不要接触加注口盖钉/O 形圈。将盖子放在乙醇垫上，将钉子/O 形圈朝上，同时填充容器。小心地从注射器端口拧下盖子。
5. 确保旋塞阀处于打开位置（图2C）。小心地将容器中的培养基倒入废物容器中，使用血清移液管取出培养基，或使用连接到真空系统的无菌玻璃巴斯德移液管吸出培养基，而不接触氧化膜。
6. 紧紧关闭包含原液培养物的 50 mL 锥形管，轻轻倒置几次以彻底混合内容物。
7. 用新鲜的无菌血清移液管从 50 mL 管中吸取 10 mL 细胞培养原液。拿起容器并倾斜其，使进样口朝向顶部，然后小心地通过进样口将细胞培养液分配到培养皿中。
   注意:小心并注意体积，以便在倾斜容器时培养物不会溢出注射器端口。
8. 目标是将容器填充到填充口唇的顶部而不会溢出;在装满容器时将容器向下倾斜以避免溢出。小心不要用移液器接触氧合膜，因为它非常脆弱。
   注意:容器填充过程可能需要一些练习;要有耐心，慢慢来。如果在加注口开口处形成气泡膜，这将干扰容器的装载。如果发生这种情况，请轻轻撞击容器以破坏气泡膜产生的密封。
9. 装载容器后，小心地将加注口盖放回原处，确保不要接触钉子/O 形圈。
10. 放在注射器上。
    注意:容器表面有两个注射器端口（图2A）。一个将容纳一个空注射器，另一个将容纳一个装满细胞培养物的注射器（图2E）。
    1. 首先，将3 mL空注射器连接到其中一个注射器端口，确保注射器完全压下。
       注意:在将注射器连接到容器之前，请泵送注射器几次，因为它们一开始有点紧。在生物安全柜内执行此操作以保持无菌。
    2. 用 10 mL 等分细胞培养物紧紧关闭 15 mL 锥形管，轻轻倒置几次以彻底混合内容物。
    3. 接下来，小心地将第二个3 mL注射器半浸没在细胞培养物中并抽取一些培养物。为了尽量减少注射器顶部的气泡，将其完全分配回管中，然后吸取3mL培养物。
    4. 将填充的注射器连接到剩余的注射器端口，并用乙醇垫仔细消毒注射器和填充端口周围。不要在氧化膜上沾上乙醇。现在容器已准备好清除气泡。
       注意:考虑到 15 mL 管的深度，第二个容器的第二个填充注射器更难加载。它有助于在填充注射器时倾斜试管，以保持被填充的注射器和细胞培养物之间的密封。
    5. 对其余船只重复步骤3.3-3.10。如果最后一个容器的 50 mL 锥形管中剩余的细胞培养量略微不足（例如，9.5 mL 而不是 10 mL），请从用于装入注射器的 15 mL 锥形管中回收剩余量。
       注意:以下步骤不需要在无菌生物安全柜内进行，因为容器现在是一个封闭的无菌系统。

4. 去除容器中的气泡

注意:在此设置中，气泡是不可避免的，必须在整个处理过程中始终如一地去除（图3）。有关此内容的更多详细信息，请参阅"讨论"部分。

1. 确保注射器端口旋塞阀处于关闭位置（图2D），以限制细胞和气泡从注射器迁移到容器中。这在治疗后期尤其重要（如下所述）。要收集最初的气泡，请将容器倒置并撞击其侧面几次。
2. 快速将容器翻转回朝上，然后以轻微的角度背对着，使气泡全部漂浮到容器的向上侧（图3B）。
3. 用空注射器操纵端口下方的气泡，观察它们开始进入端口。打开两个注射器端口旋塞阀（图2C）。
4. 轻轻撞击容器，鼓励气泡漂浮到空注射器中。用空注射器慢慢吸起较大的气泡，同时小心地压下整个注射器，以保持容器内的压力，使氧合膜不会破裂。
   注意:较大的气泡需要被吸入，而小气泡和微气泡可以通过将它们操纵到注射器端口并轻轻撞击容器来鼓励它们漂浮到注射器中。经过几个小时的治疗后，尽量减少注射器中的细胞与培养容器中的细胞之间的"交叉污染"非常重要。这是因为注射器中的细胞不会像血管中的细胞那样接受相同量的氧合或暴露于SMG。
5. 重复步骤4.2-4.4几次，以确保去除所有气泡。从容器中去除所有气泡，包括微气泡。
   注意:当容器对准光源（窗户、光线等）时，可以通过氧化膜（容器背面）轻松看到气泡。执行步骤 4.2 和 4.3 时，观察从容器背面移动的气泡，以帮助可视化更难看到的气泡。
6. 当气泡被有效去除后，关闭注射器端口旋塞阀。在治疗期间保持注射器打开，以便随后去除气泡，确保两个注射器中的体积大致相等。

5. 将容器连接到旋转底座上

1. 用 70% 乙醇小心地擦拭旋转底座和带状电缆的表面。
2. 确保随附的带状电缆已连接到电源。将旋转底座放入培养箱中，并将带状电缆连接到底座上。确保电源保持在培养箱附近但外部。 图 4 描述了旋转底座和电源，以供参考。
3. 通过将容器螺纹排列在旋转钉上并按逆时针方向轻轻转动底座上的旋转钉来连接 SMG 处理容器。确保容器牢固连接。通过在水盘中填充足够的高压灭菌反渗透（RO）水，确保培养箱保持接近100%的湿度。
4. 选择合适的转速 （rpm）。调整旋转速度以匹配细胞的沉降速度，使细胞根本不"穿过培养基"，而是最终在小轨道路径上旋转。这种现象在 图1中可视化为示意图。
   注意:公司建议以 8-10 rpm 的速度开始淋巴细胞旋转。在这种情况下，NK92电池以11 rpm旋转，如之前的论文¹⁷所示。根据电池大小，对于较大的电池，rpm应增加，对于较小的电池，应降低rpm。如果使用的细胞在培养过程中倾向于聚集，则相同的模式适用。有关此内容的更多详细信息，请参阅讨论部分。

6. 治疗

1. 为研究应用选择合适的治疗长度，这可能取决于正在测定的细胞功能/生理学参数。有关此内容的更多详细信息，请参阅讨论部分。
   注意:在这种情况下，根据先前研究的结果，NK92细胞进行了72小时的SMG处理^18，19。在整个治疗过程中不可避免地会形成气泡，需要去除。可以短暂停止并重新启动轮换以方便此操作。请参阅步骤 7.1 了解如何安全地移除冲锋枪容器。
2. 在设置处理的第一天，通过重复步骤4.2-4.6每隔几个小时检查一次气泡形成。第一天后，根据需要检查血管（至少每天一次），重复步骤4.2-4.6，直到治疗结束。

7. 从血管中收获细胞

1. 一旦计划的治疗时间过后，停止旋转，并拆卸设备。通过轻轻保持容器静止，同时顺时针方向转动设备的旋转钉来取出 SMG 处理容器。
2. 将对照瓶、对照1G容器和处理过的SMG容器带入无菌生物安全柜中。
3. 取每个容器（仅限1G和SMG;而不是烧瓶）并将其倒置，使其朝下并轻轻撞击它以使所有细胞悬浮。然后，将容器侧转，进样口朝向底部，然后再次撞击容器以鼓励细胞朝向填充口以进行有效抽吸。
4. 单独处理每个容器。从两个端口拧下注射器，并将它们丢弃到生物危害废物中。打开注射器端口上的旋塞阀。
5. 小心地取下进样口盖，并使用无菌 10 mL 血清移液管抽取内容物，在清空容器时倾斜容器。将"烧瓶"、"1G"和"SMG"组的内容物分配到单独标记的 15 mL 锥形管中。
6. 关闭每个管子并轻轻倒置几次以确保它们正确混合。使用首选方法确定所得细胞培养物的浓度和活力，以准备用于后续实验测定。

结果

如果1）细胞的增殖在对照组（理想情况下是所有实验组）中大致一致，2）考虑到接种密度，处理时间和细胞类型/系的倍增时间，增殖是合适的，并且3）收获的细胞的活力为85%或更高（表1).理想情况下，所得细胞应与标准细胞培养物一样健康，特别是用于后续实验和测定（即活力为85%或更高）。如果情况正好相反，则认为这种培养方法不成功，即产生的细胞要么死亡，要么在对照组?...

讨论

随着人类准备进行更长的月球和火星太空任务，需要进行更多的研究来减轻宇航员的严重健康风险。影响人体生理的空间环境的一个主要方面是微重力。本文描述了一种使用市售旋转细胞培养系统对淋巴细胞进行SMG的细胞培养方法。

该协议包含一些关键步骤，可能需要根据所使用的细胞类型或品系进行优化。这些包括1）根据细胞的倍增时间和SMG处理的长度选择合适的接种密?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)	Synthecon	D-410	Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL)	BD	309657	For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line	ATCC	CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes	Fisher Scientific	86.1254.001
T25 suspension culture flasks	Sarsedt	83.3910.502	For flask control