Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج بيئة الأوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بأكملها ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض في الأمراض الالتهابية.

Abstract

تلعب تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض دورا مهما في الأمراض الالتهابية مثل الإنتان. أثناء الالتهاب، يمكن أن تؤدي الهجرة المفرطة لكريات الدم البيضاء المنشطة عبر بطانة الأوعية الدموية إلى الأعضاء الرئيسية إلى فشل الأعضاء. تم تطوير والتحقق من صحة فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (bMFA) باستخدام العديد من التقنيات التجريبية والحسابية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج سلسلة الكريات البيض المتداول / الالتصاق / الهجرة بأكملها لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكريات البيض. تم رقمنة شبكات الأوعية الدموية الدقيقة التي تم الحصول عليها من الصور الموجودة في الجسم الحي في القوارض باستخدام نهج نظام المعلومات الجغرافية (GIS) وتم تصنيعها بدقة مع polydimethylsiloxane (PDMS) على شريحة مجهرية. لدراسة تأثير معدل القص وطوبولوجيا الأوعية الدموية على تفاعلات الخلايا البطانية لكريات الدم البيضاء، تم تطوير نموذج ديناميات الموائع الحسابية (CFD) لإنشاء خريطة مقابلة لمعدلات القص والسرعات في جميع أنحاء الشبكة. يتيح bMFA التحديد الكمي لتفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض ، بما في ذلك سرعة الدوران ، وعدد الكريات البيض الملتصقة استجابة لمعدلات القص المختلفة ، وعدد الكريات البيض المهاجرة ، ونفاذية الخلايا البطانية ، والتعبير عن جزيء الالتصاق وغيرها من المتغيرات الهامة. علاوة على ذلك ، باستخدام العينات المتعلقة بالإنسان ، مثل الخلايا البطانية البشرية والكريات البيض ، يوفر bMFA أداة للفحص السريع للعلاجات المحتملة لزيادة قابليتها للترجمة السريرية.

Introduction

الالتهاب هو استجابة المضيف للعدوى والإصابة ، وتلعب البطانة دورا مهما في الاستجابة الالتهابية1،2،3. خلل التنظيم الالتهابي هو السبب الكامن وراء عدد من أمراض الأمراض مثل الإنتان وأمراض القلب والأوعية الدموية والربو وأمراض الأمعاء الالتهابية والسرطان و COVID-19. تلعب تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض دورا مركزيا في هذه الأمراض الالتهابية. أثناء الالتهاب ، يؤدي إطلاق PAMPS (الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض) من مسببات الأمراض أو DAMPS (الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر) من الأنسجة المصابة إلى تنشيط الخلايا المناعية لإطلاق السيتوكينات / الكيموكينات وغيرها من الوسطاء المؤيدين للالتهابات التي تؤدي إلى تنشيط البطانة ، مما يؤدي إلى تغييرات في وظيفة حاجز بطانة الأوعية الدموية وزيادة النفاذية 3,4 . يؤدي زيادة تنشيط الخلايا البطانية أثناء الالتهاب إلى تعزيز تفاعل الخلايا البيضاء مع الخلايا البطانية مما يؤدي إلى الهجرة المفرطة لكريات الدم البيضاء المنشطة عبر بطانة الأوعية الدموية إلى الأعضاء الرئيسية1،5،6،7.

يبدأ تجنيد الكريات البيض بواسطة جاذبات كيميائية متنوعة كيميائيا تتكون من الدهون النشطة بيولوجيا والسيتوكينات والكيموكينات والمكونات المكملة 8,9. تجنيد الكريات البيض هو عملية متعددة الخطوات تتضمن خمس خطوات منفصلة: 1) هامش الكريات البيض والتقاطها / تعلقها ، 2) المتداول ، 3) الاعتقال الثابت ، 4) الانتشار والزحف و 5) الإسراف / الهجرة (الشكل 1). كل خطوة من هذه العملية تتطلب الحديث المتبادل بين الكريات البيض والخلايا البطانية لتنسيق هذه الظاهرة الديناميكية 1,9. في نهاية المطاف، تنتشر الكريات البيض الموقوفة في الأنسجة الملتهبة عبر البطانة عبر عملية متعددة الخطوات يتم التحكم فيها بواسطة إشارات متزامنة تعتمد على الجاذب الكيميائي والأحداث اللاصقة وقوى القص الديناميكية الدموية 1،9،10،11،12.

بالنظر إلى الدور المركزي لإجهاد القص في تنظيم وظيفة الخلايا البطانية وأهمية تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض13 ، تم تطوير العديد من النماذج في المختبر خلال العقود القليلة الماضية لدراسة جوانب مختلفة من سلسلة هجرة الكريات البيض في بيئة أكثر تحكما14. يمكن تصنيف الأجهزة الموائعة التقليدية لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض إلى فئتين عريضتين14: أ) أجهزة لدراسة دوران الكريات البيض والالتصاق والتعبير عن جزيء الالتصاق مثل غرف تدفق الصفائح المتوازية و ب) أجهزة لدراسة هجرة الكريات البيض في ظل ظروف ثابتة مثل غرف البئر. تم استخدام أنظمة مثل غرف تدفق الصفائح المتوازية لدراسة أدوار جزيئات الالتصاق وأربطتها في شلال الالتصاق تحت قوى القص15. ومع ذلك ، فإن العيب الكبير هو أن هذه الأجهزة المبسطة والمثالية (على سبيل المثال ، القناة المستقيمة) غير قادرة على إعادة إنتاج حجم وهندسة الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي (على سبيل المثال ، تشعبات الأوعية الدموية المتتالية ، مورفولوجيا الأوعية الدموية) وظروف التدفق الناتجة (على سبيل المثال ، التدفقات المتقاربة أو المتباينة عند التشعبات). ونتيجة لذلك ، يمكن لهذه الأجهزة فقط نموذج الالتصاق ولكن ليس الهجرة. يمكن لغرف ترانسويل فقط دراسة الهجرة العابرة في ظل ظروف ثابتة دون النظر في الميزات الهندسية في الجسم الحي وظروف التدفق. وبالتالي ، فإن هذه النماذج التقليدية لا تحاكي البيئة الدقيقة للأنسجة الحية أو تحل التصاق والهجرة في فحص واحد6.

لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير والتحقق من صحة فحص الموائع الدقيقة ثلاثي الأبعاد ثلاثي الأبعاد (bMFA) (الشكل 2) ، والذي يتكاثر بشكل واقعي في شبكات الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي على شريحة16،17،18. تم نشر بروتوكول التصنيع الدقيق لهذا الجهاز سابقا17 ويتم وصفه بإيجاز فقط هنا. تمت رقمنة الأوعية الدموية الدقيقة لعضلة كريماستر الفأر باستخدام نهج معدل لنظام المعلومات الجغرافية (GIS)19. بعد ذلك ، تم إنشاء شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية على polydimethylsiloxane (PDMS) باستخدام عمليات الطباعة الحجرية الناعمة على أساس شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الرقمية14،17،20،21،22. باختصار ، تمت طباعة صور الشبكة الرقمية على فيلم Mylar ، والذي تم استخدامه بعد ذلك كقناع لتصميم مقاومة ضوئية إيجابية SU-8 فوق رقاقة سيليكون لإنشاء سادة للتصنيع. تم استخدام أعمدة دقيقة الصنع (قطرها 10 ميكرومتر ، طولها 3 ميكرومتر) لإنشاء مسام بارتفاع 3 ميكرومتر وعرض 100 ميكرومتر ، وهو الحجم الأمثل لهجرة الكريات البيض23،24،25 ، التي تربط القنوات الوعائية ومقصورات الأنسجة. تم إعداد PDMS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وسكب على الأساتذة المتقدمين. علاوة على ذلك ، تم تفريغ PDMS وسمح له بالعلاج بين عشية وضحاها في فرن (65 درجة مئوية) لإنشاء قنوات دقيقة تكميلية في PDMS. في وقت لاحق ، تم تقشير PDMS المعالج من سيد SU-8 ، متبوعا بمنافذ اللكم للمداخل / المنافذ. ثم ، تم ربط PMDS بالبلازما بشريحة زجاجية. يتكون سطح جهاز الموائع الدقيقة من الزجاج الأصلي و PDMS. من أجل تعزيز تعلق الخلايا وانتشارها وانتشارها ، يلزم طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM). يتضمن bMFA شبكة الأوعية الدموية الدقيقة وحجرة الأنسجة المتصلة عبر مسام بارتفاع 3 ميكرومتر وعرض 100 ميكرومتر (الشكل 2). يقوم نظام الموائع الدقيقة هذا بإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بالكامل في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجيا لشبكة الأوعية الدموية الدقيقة الكاملة مع الأوعية المترابطة والتشعبات ، بما في ذلك الدورة الدموية والهوامش والدحرجة والالتصاق وهجرة الكريات البيض إلى حجرة الأنسجة خارج الأوعية الدموية في نظام واحد14،16،17،21،26.

تجدر الإشارة إلى أنه حتى عندما يكون معدل التدفق عند مدخل bMFA ثابتا ، فإن ظروف التدفق في الشبكة تختلف في مواقع مختلفة ولا يمكن حسابها بصيغة رياضية بسيطة. تم تطوير نموذج قائم على ديناميكيات الموائع الحسابية (CFD) لحساب معلمات التدفق المختلفة (على سبيل المثال ، إجهاد القص ، معدل القص ، السرعة) في مواقع مختلفة في الشبكة. تم استخدام نموذج CFD هذا لمحاكاة أنماط تروية الصبغة ومعلمات التدفق في bMFA. ويشير التحقق المتبادل مع النتائج التجريبية إلى أن مقاومة التدفق عبر الشبكة يمكن التنبؤ بها بشكل جيد من خلال النموذج الحسابي (الشكل 3)17. ثم تم استخدام نموذج CFD هذا لتقدير السرعة وملف تعريف معدل القص في كل وعاء من bMFA (الشكل 4) ، مما يسمح بتحليل آثار تدفق القص والهندسة على تدحرج الكريات البيض والالتصاق والهجرة16. تلتصق الكريات البيض بشكل تفضيلي بالقرب من التشعبات وفي مناطق القص المنخفضة في الجسم الحي ، وقد أثبتت هذه الأنماط المكانية من التصاق الكريات البيض بنجاح في bMFA باستخدام العدلات (الشكل 5)16. تصف هذه الورقة بروتوكول إعداد bMFA لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض في ظل الظروف الالتهابية باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية (HLMVEC) والعدلات البشرية. يمكن استخدام الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة ، مثل bMFA ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية مع أنواع مختلفة من الخلايا مثل العدلات والخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية والخلايا السرطانية18،27،28،29،30. يمكن زرع bMFA مع الخلايا البطانية الأولية من أعضاء مختلفة (على سبيل المثال ، الرئة مقابل الدماغ) وأنواع مختلفة (على سبيل المثال ، الخلايا البطانية البشرية مقابل الفئران) ، وكذلك خطوط الخلايا البطانية 21،27،31،32. يمكن استخدام bMFA لدراسة الاستجابات الخلوية المتعددة ، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية ، ووظيفة الحاجز ، وتوصيل الدواء وسمية الدواء.

Protocol

يتم الحصول على الدم البشري الهيباريني لعزل العدلات عن المتبرعين البالغين الأصحاء (الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 21 و 60 عاما) ، بعد الموافقة المستنيرة على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة تمبل (فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

1. فتيلة وطلاء الجهاز مع الفيبرونيكتين البشري

ملاحظة: يحتوي bMFA على منفذي مدخل ومنفذي منفذ متصلين بحجرة الأوعية الدموية. كما أن لديها منفذا واحدا متصلا بحجرة الأنسجة (الشكل 2).

  1. أدخل الأنابيب (O.D. من 0.06 "و IDD من 0.02") (جدول المواد) إلى جميع المنافذ باستثناء منفذ مدخل واحد مع ملقط نقطة دقيقة. قم بتثبيت منفذي المخرج ومنفذ حجرة الأنسجة بمشابك الفك. تأكد من أن طول كل أنبوب ~ 1 بوصة.
  2. تمييع الفيبرونيكتين البشري إلى 100 ميكروغرام / مل مع PBS من محلول مخزون الفيبرونيكتين (1 ملغ / مل). قم بتحميل حقنة 1 مل بمحلول فيبرونيكتين معد. قم بتوصيل المحقنة بإبرة حادة 24 جم وأنبوب بطول 4 بوصات.
    ملاحظة: لمنع الربط المتبادل، لا تفرط في خلط / ماصة الفيبرونيكتين البشري. يمكن استخدام مصفوفات أخرى خارج الخلية (ECM) مثل الكولاجين لأنواع مختلفة من الخلايا.
  3. أدخل الأنبوب في منفذ المدخل المفتوح ، وادفع المكبس حتى يخرج الفيبرونيكتين البشري من منفذ المدخل الآخر ، ثم قم بتثبيته. كرر هذه العملية لبقية المنافذ حتى تمتلئ جميع القنوات وحجرة الأنسجة والأنابيب بمحلول الفيبرونيكتين البشري. قم بإزالة الإبرة ولكن حافظ على إدخال الأنابيب التي يبلغ طولها 4 بوصات وفتحها.
    ملاحظة: تأكد من ملء الأنابيب بالفيبرونيكتين قبل تثبيتها.
  4. لإزالة الغاز ، قم بتوصيل الأنابيب غير المثبتة بخزان نيتروجين مضغوط من خلال التمهيدي الهوائي ، واضبط الضغط على ~ 5 رطل لكل بوصة مربعة واستمر لمدة 15 دقيقة تقريبا.
  5. بعد 15 دقيقة ، تحقق تحت المجهر للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة في الجهاز. إذا كانت هناك فقاعات هواء محاصرة في القناة أو حجرة الأنسجة، فأعد توصيل الجهاز بالتمهيدي الهوائي لتفريغ الغاز مرة أخرى، أي كرر الخطوة 1.4.
    ملاحظة: يستخدم المجهر المقلوب في جميع الخطوات التي تنطوي على الفحص المجهري في هذا البروتوكول.
  6. قم بإزالة الجهاز من التمهيدي الهوائي. احتضن الجهاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم اغسل جميع القنوات وحجرة الأنسجة باستخدام وسائط زراعة HLMVEC المسخنة مسبقا (جدول المواد) ، على غرار الخطوة 1.3. bMFA جاهز الآن لبذر الخلايا.
    ملاحظة: قبل إزالة/إدخال أنبوب من المنفذ، ضع أولا قطرة ماء مع ماصة حول قاعدة أنبوب منفذ المدخل لمنع الهواء من دخول الجهاز.

2. البذر bMFA مع HLMVEC

  1. ثقافة HLMVEC إلى 60٪ - 80٪ التقاء وفقا لبروتوكول البائع في قارورة T-25.
  2. استنباط وسائط ثقافة HLMVEC من قارورة زراعة الخلايا. يغسل مرتين مع PBS.
  3. أضف 2 مل من محلول التربسين-EDTA المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) في قارورة T-25. احتضان لمدة 3-5 دقائق في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2) حتى يتم فصل معظم الخلايا عن القارورة.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة باختلاف أنواع الخلايا وتركيز التربسين-EDTA.
  4. أضف 2 مل من محلول تحييد التربسين (TNS ، 37 درجة مئوية) إلى القارورة لتحييد التربسين-EDTA.
  5. اضغط برفق على القارورة للمساعدة في فصل الخلايا. ثم ، انقل محلول تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 150 × جم لتكوير الخلايا البطانية. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل من وسائط زراعة الخلايا. احسب عدد الخلايا التي تحتوي على مقياس دمية.
  7. جهاز طرد مركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 150 × غرام لتكوير الخلايا. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا إلى كثافة البذر المطلوبة من 20 × 106 / مل.
    ملاحظة: اعتمادا على أنواع الخلايا والالتقاء ، يمكن جمع حوالي 2 × 10 6 خلايا بطانية من قارورتين T-25 ، ومع كثافة البذر من 20 × 10 6 / مل ، 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (2 × 106 خلايا بطانية) ، يكفي لزرع 5 أجهزة.
  8. قم بتركيب حقنة 1 مل في مضخة المحقنة القابلة للبرمجة ، وقم بتوصيل الأنابيب بالإبرة الحادة.
  9. اسحب ~ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الأنابيب ، مع التأكد من أن تعليق الخلية موجود فقط في الأنابيب ، وليس في برميل المحقنة.
  10. قم بإزالة المشبك من منفذ منفذ تشغيل الجهاز. قم بتوصيل الأنبوب بمدخل واحد للجهاز. تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء إلى القناة.
  11. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل تدفق 4-8 ميكرولتر / دقيقة. مراقبة الجهاز تحت المجهر.
  12. عندما تمتلئ القنوات بالخلايا ، أوقف المضخة ، وقم بتثبيت المخرج ، واقطع أنبوب المدخل.
    ملاحظة: احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء إلى الجهاز.
  13. ضع الجهاز في الحاضنة لمدة 4 ساعات عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.
  14. بعد 4 ساعات من الحضانة ، قم بإعداد حقنة أخرى مليئة بوسائط زراعة الخلايا الطازجة. قم بتركيب المحقنة على مضخة حقنة ، وقم بتوصيل المحقنة بمنفذ المدخل وقم بإزالة المشبك من منفذ المخرج.
  15. قم بتشغيل وسائط جديدة عبر الجهاز لمدة 5 دقائق تقريبا عند 4-8 ميكرولتر / دقيقة لغسل الخلايا العائمة / غير المرفقة.

3. زراعة الخلايا تحت التدفق لمدة 48 ساعة

  1. قم بإعداد حقنة مليئة بوسائط زراعة الخلايا الطازجة. قم بتركيب المحقنة في مضخة حقنة ، وقم بتوصيل المحقنة بمنفذ مدخل واحد واحتفظ بمنفذ مفتوح. ضع الجهاز في الحاضنة (5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية).
  2. قم ببرمجة مضخة المحقنة لزراعة الخلايا البطانية تحت التدفق باستخدام الإرشادات التالية المذكورة في الجدول 1.
  3. تحقق من bMFA تحت المجهر بعد 48 ساعة من الثقافة تحت التدفق. يجب أن يغطي HLMVEC قنوات الأوعية الدموية التي تشكل تجويفا كاملا (الشكل 6).
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى أنظمة تدفق أخرى لأنواع الخلايا المختلفة.

4. السيتوكين و / أو العلاج العلاجي

ملاحظة: على سبيل المثال، يصف هذا القسم استخدام bMFA لدراسة تأثير علاج الخلايا بعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ومثبط جديد مضاد للالتهابات (مثبط الببتيد بروتين كيناز C دلتا-تات، PKCδ-i)18،27،32،33،34،35،36.

  1. قم بإعداد ثلاثة أجهزة bMFA مختلفة باستخدام البروتوكول أعلاه (القسم 1-3).
  2. قم بتحميل ثلاثة حقنة سعة 1 مل مع وسائط زراعة الخلايا ، (TNF-α) (10 نانوغرام / مل) ، TNF-α (10 نانوغرام / مل) + PKCδ-i (5 ميكرومتر) ، على التوالي.
    ملاحظة: يتم إعادة تشكيل السيتوكينات في وسائط زراعة الخلايا.
  3. قم بتوصيل المحاقن الثلاثة بثلاثة أجهزة bMFA. عالج HLMVEC باستخدام مثبط TNF-α أو TNF-α + لمدة 4 ساعات عند 0.1 ميكرولتر / دقيقة.
    ملاحظة: استنادا إلى متطلبات الدراسة المحددة، يمكن استخدام السيتوكينات الأخرى أو كوكتيلات السيتوكين (على سبيل المثال، TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ))، لعلاج الخلايا البطانية.

5. عزل العدلات البشرية

  1. استخدم جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (RT). تشمل الكواشف وسائط عزل الكريات البيض ، ومخزن مؤقت HEPES 1x مع Ca 2+ / Mg2+ (الجدول 2) ، و 6٪ Dextran في محلول ملحي عادي (0.9٪ NaCl) ، ومحلول كلوريد الصوديوم 3.6٪ وماء غير متأين (DI).
  2. ماصة 20 مل من وسائط عزل الكريات البيض في أنبوب مخروطي 50 مل وطبقة بعناية 25 مل من الدم فوق وسائط عزل الكريات البيض. جهاز طرد مركزي لمدة 40 دقيقة عند 427 × g في RT.
    ملاحظة: نفذ هذه الخطوة ببطء وبعناية لتجنب خلط وسائط عزل الدم والكريات البيض.
  3. الطموح وصولا إلى ~ 5 مل فوق طبقة خلايا الدم الحمراء (RBC). الطبقة البيضاء الباهتة الموجودة أعلى RBC هي في الغالب العدلات.
  4. أضف مخزن مؤقت HEPES لمضاعفة وحدة التخزين الحالية (وحدة التخزين الموجودة: مخزن HEPES المؤقت = 1:1).
  5. أضف مبلغا قدره 6٪ Dextran ، والذي سيكون 20٪ من الحجم النهائي. (الحجم الحالي/4 = حجم Dextran المضاف 6٪).
  6. اقلب الأنبوب بلطف عدة مرات لتمتزج جيدا واترك رواسب RBC (~ 25 دقيقة).
  7. قم بماصة الطبقة العليا بعناية (الطبقة الغنية بالعدلات) ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 مل ، واحرص على عدم التلوث ب RBC الرسوبي.
  8. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 315 × g في RT. قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات في 8 مل من المخزن المؤقت HEPES.
  9. لتحليل RBC المتبقي ، أضف 24 مل من ماء DI واخلطه بلطف لمدة 50 ثانية. على الفور ، أضف 8 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 3.6٪ ، واخلطه وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 315 × g في RT.
  10. قم بإزالة السوبرناتانت ، واغسل حبيبة الخلية ب 15 مل من المخزن المؤقت HEPES وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 315 × g. أعد تعليق الكريات في مخزن HEPES المؤقت.

6. التصاق العدلات وتجربة الهجرة مع bMFA

  1. إعادة تعليق العدلات البشرية المعزولة (15 مليون) في 999 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES.
  2. أضف محلول مخزون الصبغة 1 ميكرولتر CFDA-SE (كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات سوسينيميديل استر) (10 ملليمتر) إلى تعليق العدلات للحصول على تركيز عمل يبلغ 10 ميكرومتر CFDA-se واحتضانه لمدة 10 دقائق في RT. اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن HEPES المؤقت عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 315 × جم.
  3. عد العدلات باستخدام مقياس خلايا الدم وأعد تعليقها عند 2 مليون عدلة/مل مع وسائط زراعة الخلايا، TNF-α (10 نانوغرام/مل) و TNF-α (10 نانوغرام/مل) +PKCδ-i (5 ميكرومتر)، على التوالي؛ احتضن لمدة 15 دقيقة في RT قبل بدء التجربة.
  4. قم بإعداد حقنة مملوءة ب 1 ميكرومتر N-formyl-met-leu-phe (fMLP) ، الجاذب الكيميائي للدراسة ، في وسائط زراعة الخلايا. خذ bMFA وافتح منفذ مدخل واحد ومنفذ مخرج واحد.
    ملاحظة: تستخدم هذه الظروف التجريبية لمحاكاة ظروف الإنتان التي تشمل استجابة التهابية جهازية مع مستويات عالية من السيتوكين / الكيموكينات المتداولة. علاوة على ذلك ، يتم استخدام fMLP ، وهو ببتيد مشتق من البكتيريا سالبة الجرام ، لنمذجة وجود البكتيريا في الرئة (أي حجرة الأنسجة).
  5. قم بإزالة أنابيب منفذ حجرة الأنسجة وأدخل أنبوب fMLP. حقن ~ 20 ميكرولتر من fMLP في حجرة الأنسجة لجميع bMFA ، باستثناء تلك المعالجة بوسائط زراعة الخلايا وحدها. ثم قطع الأنابيب والمشبك عليه.
  6. املأ المحقنة ب ~ 200 ميكرولتر من تعليق العدلات وقم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة.
  7. ضع الجهاز على مرحلة المجهر المقلوب (جدول المواد).
  8. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل تدفق هو 1 ميكرولتر / دقيقة وانتظر حتى تخرج قطرة صغيرة من تعليق العدلات من الأنابيب. أدخل الأنبوب في منفذ المدخل. راجع الشكل 7 للاطلاع على الإعداد.

7. الحصول على الصور

  1. استخدم وظيفة مسح الصورة الكبيرة في برنامج تحليل الصور المجهرية (جدول المواد) للحصول على خريطة الالتصاق في bMFA (الشكل 8) بعد 10 دقائق من بدء التجربة. تدخل معظم العدلات bMFA خلال أول 10 دقائق.
    ملاحظة: حافظ على ضوء التألق بعيدا عند عدم التقاط الصور لتقليل التبييض الضوئي.
  2. خلال الساعة التالية ، التقط صورا بفاصل زمني (1 صورة كل 5 دقائق) لحجرة الأنسجة (الشكل 8B ، C) لتحليل الهجرة للحصول على خريطة الترحيل.

8. تحليل الصور الرقمية

  1. بالنسبة لخريطة الالتصاق ، احسب عدد العدلات الملتصقة في كل وعاء. لكل تشعب ، قم بإنشاء منطقة دائرية ذات أهمية (ROI) بقطر يساوي ضعف قطر الوعاء وحساب عدد العدلات الملتصقة.
  2. استخدم العد اليدوي أو وظيفة عدد الكائنات الآلية لتحديد عدد العدلات الملتصقة في كل وعاء ومنطقة تشعب.
  3. استخدم خريطة معدل القص للشبكة التي تم إنشاؤها باستخدام محاكاة CFD17 لتحديد معدل القص في كل سفينة. ثم ارسم عدد العدلات الملتصقة في وعاء معين مقابل معدل القص في تلك السفينة لإنشاء خريطة معدل القص في bMFA كما هو موضح في الشكل 9A.
  4. يتم حساب العدلات على أنها مهاجرة إذا عبرت عبر البطانة إلى حجرة الأنسجة. احسب عدد العدلات المهاجرة في 10 دقائق و 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة. ارسم عدد العدلات المهاجرة مقابل الوقت كما هو موضح في الشكل 9B.

النتائج

بعد 48 ساعة من الزراعة تحت تدفق القص في bMFA ، غطت الخلايا البطانية سطح القنوات الوعائية في bMFA ومحاذاة في اتجاه التدفق (الشكل 6). أشار الفحص المجهري البؤري إلى أن جميع أسطح القنوات الوعائية كانت مغطاة بالخلايا البطانية ، مما شكل تجويفا كاملا ثلاثي الأبعاد في bMFA18.

...

Discussion

يستنسخ bMFA التضاريس وظروف التدفق لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي ويمكن استخدامه لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض والوظيفة البطانية في المختبر في ظل ظروف واقعية من الناحية الفسيولوجية. في الأوعية الدموية الدقيقة للفأر أو الإنسان ، تكون هندسة شبكات الأوع?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، رقم المنحة: GM114359 و GM134701 (M.F.K. و L.E.K.) ، 1F31AI164870-01 (J.C.L.) ، ووكالة الحد من التهديدات الدفاعية ، رقم المنحة: HDTRA11910012 (M.F.K. و L.E.K.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeFisher Scientific14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)SynVivoSMN1-C001Exclusive at SynVivo
Blunt needleJensen GlobalJG24-0.5
Calcium ChlorideFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dextran, 250,000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Leukocyte isolation media
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Human fibronectinFisher Scientific33-016-015use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzacc-3202Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cellsLonzacc-2527use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium ChlorideFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.Microscope
NIS-elements, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Imaging software
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Ultra Syringe PumpHarvard Apparatus70-3007Syringe Pump
Potassium HydroxideFisher Scientific02-003-763
Recombinant Human TNF-alphaR&D Systems210-TA
Slide clampSynVivo
Sodium ChlorideFisher ScientificS640-500
Synvivo Pneumatic PrimerSynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)Lonzacc-5034
Tygon tubingFisher Scientific50-206-8921Tubing

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  2. Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
  3. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
  4. Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
  5. Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
  6. Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
  7. Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
  8. Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
  9. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  10. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
  11. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  12. Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
  13. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
  14. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  15. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
  16. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
  17. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
  18. Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
  19. Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
  20. Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
  21. Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  22. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
  23. Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
  24. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
  25. Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
  26. Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
  27. Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
  28. Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
  29. Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
  30. Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
  31. Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  32. Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
  33. Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
  34. Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
  35. Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
  36. Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
  37. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved