Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

Riepilogo

In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.

Abstract

Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie come la sepsi. Durante l'infiammazione, l'eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l'endotelio vascolare negli organi chiave può portare a insufficienza d'organo. Un saggio microfluidico biomimetico fisiologicamente rilevante (bMFA) è stato sviluppato e validato utilizzando diverse tecniche sperimentali e computazionali, in grado di riprodurre l'intera cascata di rotolamento/adesione/migrazione leucocitaria per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale. Le reti microvascolari ottenute da immagini in vivo nei roditori sono state digitalizzate utilizzando un approccio Geographic Information System (GIS) e microfabbricate con polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino per microscopio. Per studiare l'effetto della velocità di taglio e della topologia vascolare sulle interazioni leucocita-cellula endoteliale, è stato sviluppato un modello di fluidodinamica computazionale (CFD) per generare una mappa corrispondente delle velocità e delle velocità di taglio in tutta la rete. Il bMFA consente la quantificazione delle interazioni leucociti-cellule endoteliali, tra cui la velocità di rotolamento, il numero di leucociti aderenti in risposta a diverse velocità di taglio, il numero di leucociti migrati, la permeabilità delle cellule endoteliali, l'espressione della molecola di adesione e altre variabili importanti. Inoltre, utilizzando campioni correlati all'uomo, come cellule endoteliali umane e leucociti, bMFA fornisce uno strumento per lo screening rapido di potenziali terapie per aumentare la loro traducibilità clinica.

Introduzione

L'infiammazione è la risposta dell'ospite a infezioni e lesioni e l'endotelio svolge un ruolo importante nella risposta infiammatoria ^1,2,3. La disregolazione infiammatoria è la causa alla base di una serie di patologie come sepsi, malattie cardiovascolari, asma, malattie infiammatorie intestinali, cancro e COVID-19. Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo centrale in queste malattie infiammatorie. Durante l'infiammazione, il rilascio di PAMPS (pathogen-associated molecular patterns) da patogeni o DAMPS (pattern molecolari associati al danno) da tessuti danneggiati attiva le cellule immunitarie per rilasciare citochine/chemochine e altri mediatori proinfiammatori che portano all'attivazione dell'endotelio, con conseguenti alterazioni della funzione di barriera dell'endotelio vascolare e aumento della permeabilità ^3,4 . L'aumento dell'attivazione delle cellule endoteliali durante l'infiammazione si traduce in una maggiore interazione leucocita-cellula endoteliale che porta a un'eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l'endotelio vascolare negli organi chiave ^1,5,6,7.

Il reclutamento dei leucociti è iniziato da chemioattrattivi chimicamente diversi composti da lipidi bioattivi, citochine, chemochine e componenti del complemento ^8,9. Il reclutamento dei leucociti è un processo in più fasi che comprende cinque fasi discrete: 1) marginazione e cattura/attaccamento dei leucociti, 2) rotolamento, 3) arresto fermo, 4) diffusione e strisciamento e 5) stravaso/migrazione (Figura 1). Ogni fase di questo processo richiede una diafonia tra leucociti e cellule endoteliali per orchestrare questo fenomeno dinamico ^1,9. In definitiva, i leucociti arrestati si estfusionano ai tessuti infiammati attraverso l'endotelio attraverso un processo a più fasi controllato da segnali chemioattratturanti-dipendenti concorrenti, eventi adesivi e forze di taglio emodinamiche 1,9,10,11,12.

Dato il ruolo centrale dello stress da taglio nella regolazione della funzione delle cellule endoteliali e il significato delle interazioni leucocita-cellule endotelio¹³, negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi modelli in vitro per studiare vari aspetti della cascata di migrazione dei leucociti in un ambiente più controllato¹⁴. I dispositivi fluidici tradizionali per studiare le interazioni leucocita-cellula endoteliale possono essere classificati in due grandi categorie¹⁴: a) dispositivi per lo studio del rotolamento dei leucociti, dell'adesione e dell'espressione delle molecole di adesione come le camere di flusso a piastre parallele e b) dispositivi per lo studio della migrazione dei leucociti in condizioni statiche come le camere transwell. Sistemi come le camere di flusso a piastre parallele sono stati utilizzati per studiare i ruoli delle molecole di adesione e dei loro ligandi nella cascata di adesione sotto le forze di taglio¹⁵. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che questi dispositivi semplicistici e idealizzati (ad esempio, canale dritto) non sono in grado di riprodurre la scala e la geometria della microvascolarizzazione in vivo (ad esempio, biforcazioni vascolari successive, morfologia vascolare) e le condizioni di flusso risultanti (ad esempio, flussi convergenti o divergenti a biforcazioni). Di conseguenza, questi dispositivi possono solo modellare l'adesione ma non la trasmigrazione. Le camere Transwell possono studiare la trasmigrazione solo in condizioni statiche senza considerare le caratteristiche geometriche in vivo e le condizioni di flusso. Pertanto, questi modelli tradizionali non imitano il microambiente dei tessuti viventi o risolvono l'adesione e la migrazione a cascata in un singolo saggio⁶.

Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato e ampiamente convalidato un nuovo saggio microfluidico biomimetico 3D (bMFA) (Figura 2), che riproduce realisticamente reti microvascolari in vivo su un chip 16,17,18. Il protocollo per la microfabbricazione di questo dispositivo è stato pubblicato in precedenza¹⁷ ed è solo brevemente descritto qui. La microvascolarizzazione del muscolo cremaster del topo è stata digitalizzata utilizzando un approccio GIS (Geographic Information System) modificato¹⁹. Quindi, la rete microvascolare sintetica è stata generata sul polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando processi di litografia morbida basati sulla rete microvascolare digitalizzata 14,17,20,21,22. In breve, le immagini di rete digitalizzate sono state stampate su pellicola Mylar, che è stata poi utilizzata come maschera per modellare un fotoresist positivo SU-8 sopra un wafer di silicio per creare i master per la fabbricazione. I pilastri microfabbricati (diametro 10 μm, 3 μm di altezza) sono stati utilizzati per creare i pori alti 3 μm e larghi 100 μm, una dimensione ottimale per la migrazione dei leucociti ^23,24,25, collegando i canali vascolari e i compartimenti tissutali. PDMS è stato preparato secondo le istruzioni del produttore e versato sui master sviluppati. Inoltre, il PDMS è stato degassato e lasciato polimerizzare durante la notte in un forno (65 ° C) per creare microcanali complementari in PDMS. Successivamente, il PDMS polimerizzato è stato staccato dal master SU-8, seguito da porte di punzonatura per ingressi / uscite. Quindi, il PMDS è stato plasmato legato a un vetrino. La superficie del dispositivo microfluidico comprende vetro nativo e PDMS. Al fine di promuovere l'attaccamento, la diffusione e la proliferazione cellulare, è necessario il rivestimento a matrice extracellulare (ECM). Il bMFA comprende una rete microvascolare e un compartimento tissutale collegato tramite pori alti 3 μm e larghi 100 μm (Figura 2). Questo sistema microfluidico riproduce l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante di una rete microvascolare completa con vasi interconnessi e biforcazioni, tra cui circolazione, marginazione, rotolamento, adesione e migrazione dei leucociti nel compartimento tissutale extra-vascolare in un unico sistema 14,16,17,21,26.

Va notato che anche quando la portata all'ingresso di bMFA è fissa, le condizioni di flusso nella rete variano in posizioni diverse e non possono essere calcolate con una semplice formula matematica. È stato sviluppato un modello basato sulla fluidodinamica computazionale (CFD) per calcolare diversi parametri di flusso (ad esempio, sforzo di taglio, velocità di taglio, velocità) in diverse posizioni della rete. Questo modello CFD è stato utilizzato per simulare i modelli di perfusione del colorante e i parametri di flusso nel bMFA. La convalida incrociata con i risultati sperimentali ha suggerito che le resistenze di flusso attraverso la rete sono ben previste dal modello computazionale (Figura 3)¹⁷. Questo modello CFD è stato quindi utilizzato per stimare la velocità e il profilo della velocità di taglio in ogni vaso di bMFA (Figura 4), consentendo l'analisi degli effetti del flusso di taglio e della geometria sul rotolamento, l'adesione e la migrazione dei leucociti¹⁶. I leucociti aderiscono preferenzialmente in prossimità di biforcazioni e in regioni a basso taglio in vivo, e questi modelli spaziali di adesione leucocitaria sono stati dimostrati con successo in bMFA usando neutrofili (Figura 5)¹⁶. Questo documento descrive il protocollo per la preparazione di bMFA per studiare l'interazione leucocita-cellula endoteliale in condizioni infiammatorie utilizzando cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVEC) e neutrofili umani. I sistemi microfisiologici, come il bMFA, possono essere utilizzati per studiare le interazioni delle cellule endoteliali con diversi tipi di cellule come neutrofili, monociti, linfociti e cellule tumorali 18,27,28,29,30. Il bMFA può essere seminato con cellule endoteliali primarie di diversi organi (ad esempio, polmone vs cervello) e diverse specie (ad esempio, cellule endoteliali umane vs murine), nonché linee cellulari endoteliali 21,27,31,32. Il bMFA può essere utilizzato per studiare risposte cellulari multiple, interazioni cellula-cellula, funzione barriera, somministrazione di farmaci e tossicità del farmaco.

Protocollo

Il sangue umano eparinizzato è ottenuto per l'isolamento dei neutrofili da donatori adulti sani (maschi e femmine, di età compresa tra 21 e 60 anni), previo consenso informato approvato dall'Institutional Review Board della Temple University (Philadelphia, PA, USA).

1. Adescamento e rivestimento del dispositivo con fibronectina umana

NOTA: il bMFA ha due porte di ingresso e due porte di uscita collegate al compartimento vascolare. Ha anche una porta collegata al compartimento del tessuto (Figura 2).

1. Inserire tubi (O.D. di 0,06" e I.D. di 0,02") (Tabella dei materialis) su tutte le porte ad eccezione di una porta di ingresso con pinza a punto fine. Bloccare le due porte di uscita e la porta del compartimento del tessuto con morsetti a mascella. Assicurarsi che ogni tubo sia lungo ~ 1 pollice.
2. Diluire la fibronectina umana a 100 μg/mL con PBS da soluzione madre di fibronectina (1 mg/mL). Caricare una siringa da 1 mL con una soluzione di fibronectina preparata. Collegare la siringa a un ago smussato da 24 G e a un tubo lungo ~ 4 pollici.
   NOTA: Per prevenire la reticolazione, non sovrastare/pipettare la fibronectina umana. Altre matrici extracellulari (ECM) come il collagene possono essere utilizzate per diversi tipi di cellule.
3. Inserire il tubo nella porta di ingresso aperta, spingere lo stantuffo fino a quando la fibronectina umana non esce dall'altra porta di ingresso, quindi bloccarlo. Ripetere questo processo per il resto delle porte fino a quando tutti i canali, il compartimento tissutale e il tubo sono riempiti con la soluzione di fibronectina umana. Rimuovere l'ago ma mantenere il tubo lungo 4 pollici inserito e sbloccato.
   NOTA: Assicurarsi che il tubo sia riempito con fibronectina prima che venga bloccato.
4. Per il degasaggio, collegare il tubo non clamoroso a un serbatoio di azoto compresso attraverso il primer pneumatico, regolare la pressione a ~ 5 psi e funzionare per ~ 15 minuti.
5. Dopo 15 minuti, controllare al microscopio per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate nel dispositivo. Se ci sono bolle d'aria intrappolate nel canale o nel compartimento tissutale, ricollegare il dispositivo al primer pneumatico per il degassamento di nuovo, cioè ripetere il passaggio 1.4.
   NOTA: Il microscopio invertito viene utilizzato in tutte le fasi che coinvolgono la microscopia in questo protocollo.
6. Rimuovere il dispositivo dal primer pneumatico. Incubare il dispositivo a 37 °C per 1 ora, quindi lavare tutti i canali e il compartimento tissutale con terreni di coltura HLMVEC (Table of Materials) preriscaldati, simili al passaggio 1.3. Il bMFA è ora pronto per la semina cellulare.
   NOTA: prima di rimuovere/inserire un tubo dalla porta, posizionare una goccia d'acqua con una pipetta attorno alla base del tubo della porta di ingresso per impedire all'aria di entrare nel dispositivo.

2. Semina bMFA con HLMVEC

1. Coltura HLMVEC al 60% - 80% di confluenza secondo il protocollo del fornitore in un pallone T-25.
2. Aspirare i terreni di coltura HLMVEC dal pallone di coltura cellulare. Lavare due volte con PBS.
3. Aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata (37 °C) nel matraccio T-25. Incubare per 3-5 minuti in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) fino a quando la maggior parte delle cellule non si stacca dal pallone.
   NOTA: Il tempo di incubazione può variare per diversi tipi di cellule e la concentrazione di tripsina-EDTA.
4. Aggiungere 2 mL di soluzione di neutralizzazione della tripsina (TNS, 37 °C) al matraccio per neutralizzare la tripsina-EDTA.
5. Picchiettare delicatamente il pallone per aiutare a dissociare le cellule. Quindi, trasferire la soluzione di sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml.
6. Centrifugare per 5 min a 150 x g per pellettizzare le cellule endoteliali. Rimuovere le cellule surnatante e risospese in 3 ml di terreno di coltura cellulare. Contare il numero di cellule con un emocitometro.
7. Centrifugare nuovamente per 5 minuti a 150 x g per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospese le cellule alla densità di semina desiderata di 20 x 10⁶/ml.
   NOTA: A seconda dei tipi di cellule e della confluenza, circa 2 x 10⁶ cellule endoteliali possono essere raccolte da due palloni T-25 e, con la densità di semina di 20 x 10⁶ / mL, 100 μL della sospensione cellulare (2 x 10⁶ cellule endoteliali), è sufficiente per seminare 5 dispositivi.
8. Montare una siringa da 1 mL nella pompa a siringa programmabile, collegare il tubo all'ago smussato.
9. Aspirare ~ 20 μL della sospensione cellulare nel tubo, assicurandosi che la sospensione cellulare sia solo nel tubo, non nella canna della siringa.
10. Togliere il morsetto da una porta di uscita del dispositivo. Collegare il tubo a un ingresso del dispositivo. Assicurarsi che nel canale non vengano introdotte bolle d'aria.
11. Avviare la pompa con una portata di 4-8 μL/min. Osservare il dispositivo al microscopio.
12. Quando i canali sono pieni di celle, arrestare la pompa, bloccare l'uscita e tagliare il tubo di ingresso.
    NOTA: Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nel dispositivo.
13. Mettere il dispositivo nell'incubatore per 4 ore al 5% di CO₂ e 37 °C.
14. Dopo 4 ore di incubazione, preparare un'altra siringa riempita con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa su una pompa a siringa, collegare la siringa alla porta di ingresso e rimuovere il morsetto da una porta di uscita.
15. Eseguire fluidi freschi attraverso il dispositivo per circa 5 minuti a 4-8 μL / min per lavare le celle galleggianti / non attaccate.

3. Coltura cellulare sotto flusso per 48 ore

1. Preparare una siringa riempita con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa in una pompa a siringa, collegare la siringa a una porta di ingresso e tenere aperta un'uscita. Mettere il dispositivo nell'incubatore (5% CO₂, 37 °C).
2. Programmare la pompa a siringa per la coltura di cellule endoteliali sotto flusso seguendo le seguenti istruzioni menzionate nella Tabella 1.
3. Controllare bMFA al microscopio dopo 48 ore di coltura sotto flusso. HLMVEC deve coprire i canali vascolari che formano un lume completo (Figura 6).
   NOTA: potrebbero essere necessari altri regimi di flusso per diversi tipi di celle.

4. Citochine e/o trattamento terapeutico

NOTA: Ad esempio, questa sezione descrive l'uso di bMFA per studiare l'impatto del trattamento delle cellule con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e un nuovo inibitore antinfiammatorio (inibitore del peptide delta-TAT della proteina chinasi C, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.

1. Preparare tre diversi dispositivi bMFA utilizzando il protocollo precedente (sezione 1-3).
2. Caricare tre siringhe da 1 mL con terreni di coltura cellulare (TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM), rispettivamente.
   NOTA: Le citochine vengono ricostituite in terreni di coltura cellulare.
3. Collegare le tre siringhe a tre dispositivi bMFA. Trattare HLMVEC con tampone TNF-α o TNF-α + inibitore per 4 ore a 0,1 μL/min.
   NOTA: Sulla base di specifiche esigenze dello studio, altre citochine o cocktail di citochine (ad esempio, TNF-α + Interleuchina 1 beta (IL1-β) + Interferone-gamma (IFN-γ)), possono essere usati per trattare le cellule endoteliali.

5. Isolamento dei neutrofili umani

1. Utilizzare tutti i reagenti a temperatura ambiente (RT). I reagenti includono mezzi di isolamento leucocitario, 1x tampone HEPES con Ca²⁺/Mg²⁺ (Tabella 2), 6% destro in soluzione salina normale (0,9% NaCl), soluzione di NaCl al 3,6% e acqua deionizzata (DI).
2. Pipettare 20 mL di mezzi di isolamento leucocitario in un tubo conico da 50 mL e stratificare accuratamente 25 mL di sangue sul mezzo di isolamento dei leucociti. Centrifuga per 40 min a 427 x g a RT.
   NOTA: Eseguire questo passaggio lentamente e con attenzione per evitare di mescolare il mezzo di isolamento del sangue e dei leucociti.
3. Aspirare fino a ~ 5 mL sopra lo strato di globuli rossi (RBC). Lo strato di buffy bianco sulla parte superiore del RBC è prevalentemente neutrofilo.
4. Aggiungere il buffer HEPES per raddoppiare il volume corrente (volume esistente: buffer HEPES = 1:1).
5. Aggiungi una quantità di destrano al 6%, che sarà il 20% del volume finale. (volume corrente/4 = volume del 6% di destrano aggiunto).
6. Capovolgere delicatamente il tubo un paio di volte per mescolare bene e lasciare sedimentare il RBC (~ 25 min).
7. Pipettare con cura lo strato superiore (strato ricco di neutrofili) e trasferirlo in un nuovo tubo da 50 ml, fare attenzione a non contaminare con RBC sedimentati.
8. Centrifugare per 10 minuti a 315 x g a RT. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 8 mL di tampone HEPES.
9. Per lisare il RBC residuo, aggiungere 24 ml di acqua DI e mescolare delicatamente per 50 s. Aggiungere immediatamente 8 mL di soluzione naCl al 3,6%, mescolare e centrifugare per 10 minuti a 315 x g a RT.
10. Rimuovere il surnatante, lavare il pellet cellulare con 15 mL di tampone HEPES e centrifugare per 5 minuti a 315 x g. Sostituire il pellet nel tampone HEPES.

6. Esperimento di adesione e migrazione dei neutrofili con bMFA

1. Sospendere i neutrofili umani isolati (15 milioni) in 999 μL di tampone HEPES.
2. Aggiungere 1 μL di CFDA-SE (carbossifluoresceina diacetato succinimidyl estere) soluzione madre colorante (10 mM) alla sospensione di neutrofili per ottenere una concentrazione di lavoro di 10 μM CFDA-SE e incubare per 10 min a RT. Lavare le cellule due volte con tampone HEPES centrifugando per 5 min a 315 x g.
3. Contare i neutrofili usando un emocitometro e risospendere a 2 milioni di neutrofili/mL con terreni di coltura cellulare, TNF-α (10 ng/mL) e TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM), rispettivamente; incubare per 15 minuti a RT prima dell'inizio dell'esperimento.
4. Preparare una siringa riempita con 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), il chemioattrattivo per lo studio, in terreni di coltura cellulare. Prendi bMFA e apri una porta di ingresso e una porta di uscita.
   NOTA: Queste condizioni sperimentali sono utilizzate per imitare le condizioni di sepsi che includono una risposta infiammatoria sistemica con alti livelli di citochine / chemochine circolanti. Inoltre, fMLP, un peptide derivato da batteri Gram-negativi, viene utilizzato per modellare la presenza di batteri nel polmone (cioè il compartimento tissutale).
5. Rimuovere il tubo della porta del compartimento in tessuto e inserire il tubo fMLP. Iniettare ~ 20 μL di fMLP nel compartimento tissutale per tutti i bMFA, ad eccezione di quello trattato con i soli terreni di coltura cellulare. Quindi tagliare il tubo e bloccarlo.
6. Riempire la siringa con ~200 μL della sospensione per neutrofili e montare la siringa sulla pompa della siringa.
7. Posizionare il dispositivo sullo stadio del microscopio invertito (Tabella dei materiali).
8. Avviare la pompa a una portata di 1 μL/min e attendere che una piccola goccia della sospensione dei neutrofili esca dal tubo. Inserire il tubo nella porta di ingresso. Vedere la Figura 7 per l'installazione.

7. Acquisisci immagini

1. Utilizzare la funzione Scan Large Image nel software di analisi delle immagini al microscopio (Table of Materials) per ottenere la mappa di adesione in bMFA (Figura 8) 10 minuti dopo l'inizio dell'esperimento. La maggior parte dei neutrofili entra in bMFA durante i primi 10 minuti.
   NOTA: tenere spenta la luce di fluorescenza quando non si scattano immagini per ridurre il fotosbiancamento.
2. Durante l'ora successiva, scatta immagini timelapse (1 immagine ogni 5 minuti) del compartimento tissutale (Figura 8B, C) per l'analisi della migrazione per ottenere la mappa di migrazione.

8. Analisi delle immagini digitali

1. Per la mappa di adesione, contare il numero di neutrofili aderenti in ogni vaso. Per ogni biforcazione, creare una regione circolare di interesse (ROI) con un diametro pari a due volte il diametro del vaso e contare il numero di neutrofili aderenti.
2. Utilizzare il conteggio manuale o la funzione automatica Object Count per quantificare il numero di neutrofili aderenti in ogni vaso e regione di biforcazione.
3. Utilizzare la mappa della velocità di taglio della rete generata utilizzando la simulazione CFD¹⁷ per determinare la velocità di taglio in ciascuna nave. Quindi tracciare il numero di neutrofili aderenti in un dato vaso rispetto alla velocità di taglio in quella nave per creare una mappa della velocità di taglio in bMFA come mostrato nella Figura 9A.
4. I neutrofili sono contati come migrati se hanno attraversato l'endotelio nel compartimento tissutale. Contare il numero di neutrofili migrati a 10 min, 15 min, 30 min e 60 min. Tracciare il numero di neutrofili migrati rispetto al tempo come mostrato nella Figura 9B.

Risultati

Dopo 48 ore di coltura sotto flusso di taglio in bMFA, le cellule endoteliali coprivano la superficie dei canali vascolari in bMFA e si allineavano nella direzione del flusso (Figura 6). La microscopia confocale ha indicato che tutte le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali, formando un lume 3D completo in bMFA¹⁸.

Utilizzando questo protocollo, è possibile acquisire una mappa di adesione dei neutrofili, che mo...

Discussione

Il bMFA riproduce la topografia e le condizioni di flusso delle reti microvascolari in vivo e può essere utilizzato per studiare l'interazione leucocita-cellula endoteliale e la funzione endoteliale in vitro in condizioni fisiologicamente realistiche. Nella microvascolarizzazione di topo o uomo, la geometria delle reti microvascolari è auto-simile e frattale, e il numero di Reynolds << 1, indicando che la geometria vascolare non influisce in modo significativo sui modelli di flusso. Pertanto, il bFMA ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)	SynVivo	SMN1-C001	Exclusive at SynVivo
Blunt needle	Jensen Global	JG24-0.5
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C70-500
CFDA, SE	ThermoFisher	C1157
Dextran, 250,000, Powder	Spectrum Chemical Mfg. Corp	DE-130
Ficoll-Paque Premium	GE Health Care	17-5442-02	Leukocyte isolation media
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506
Hepes	Fisher Scientific	AAJ1692630
Human fibronectin	Fisher Scientific	33-016-015	use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	cc-3202	Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells	Lonza	cc-2527	use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments Inc.		Microscope
NIS-elements, 5.20.01	Nikon Instruments Inc.		Imaging software
PBS	Fisher Scientific	MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3007	Syringe Pump
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha	R&D Systems	210-TA
Slide clamp	SynVivo
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640-500
Synvivo Pneumatic Primer	SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)	Lonza	cc-5034
Tygon tubing	Fisher Scientific	50-206-8921	Tubing