Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Resumo

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Resumo

As interações leucócito-endotelial desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, como a sepse. Durante a inflamação, a migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave pode levar à falência de órgãos. Um ensaio microfluido biomimético fisiologicamente relevante (bMFA) foi desenvolvido e validado utilizando várias técnicas experimentais e computacionais, que podem reproduzir toda a cascata de rolagem/adesão/migração leucócitos para estudar interações células leucócitos-endoteliais. Redes microvasculares obtidas a partir de imagens in vivo em roedores foram digitalizadas usando uma abordagem do Sistema de Informações Geográficas (SIG) e microfabricadas com polidimtilsiloxano (PDMS) em um slide de microscópio. Para estudar o efeito da taxa de corte e topologia vascular nas interações leucócito-endotelial, foi desenvolvido um modelo de Dinâmica de Fluidos Computacionais (CFD) para gerar um mapa correspondente de taxas de corte e velocidades em toda a rede. O bMFA permite a quantificação de interações leucócito-endotelial, incluindo velocidade de rolamento, número de leucócitos aderidos em resposta a diferentes taxas de tesoura, número de leucócitos migrados, permeabilidade de células endoteliais, expressão de molécula de adesão e outras variáveis importantes. Além disso, utilizando amostras relacionadas ao homem, como células endoteliais humanas e leucócitos, a BMFA fornece uma ferramenta para uma triagem rápida de potenciais terapêuticas para aumentar sua tradução clínica.

Introdução

A inflamação é a resposta do hospedeiro à infecção e lesão, e o endotélio desempenha um papel importante na resposta inflamatória ^1,2,3. A desregulação inflamatória é a causa básica de uma série de patologias da doença, como sepse, doenças cardiovasculares, asma, doença inflamatória intestinal, câncer e COVID-19. As interações leucócito-endotelial desempenham um papel central nessas doenças inflamatórias. Durante a inflamação, a liberação de PAMPS (padrões moleculares associados ao patógeno) de patógenos ou DAMPS (padrões moleculares associados a danos) de tecidos feridos ativam células imunes para liberar citocinas/quimiocinas e outros mediadores proinflamatórios que levam à ativação do endotélio, resultando em alterações na função de barreira de endotélio vascular e aumento da permeabilidade ^3,4 . O aumento da ativação das células endoteliais durante a inflamação resulta em uma interação leucócito-endotelial aprimorada levando à migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave 1,5,6,7.

O recrutamento de leucócitos é iniciado por quimioattractants quimicamente diversos compostos por lipídios bioativos, citocinas, quimiocinas e componentes complementares ^8,9. O recrutamento de leucócitos é um processo de várias etapas que inclui cinco passos discretos: 1) margem leucócito e captura/apego, 2) rolamento, 3) prisão firme, 4) espalhamento e rastreamento e 5) extravasão/migração (Figura 1). Cada etapa desse processo requer conversa cruzada entre leucócitos e células endoteliais para orquestrar esse fenômeno dinâmico ^1,9. Em última análise, leucócitos presos extravasam para tecidos inflamados através de endotélio através de um processo de várias etapas controlado por sinais quimiócitos, eventos adesivos e hemodinâmicas de tesoura 1,9,10,11,12.

Dado o papel central do estresse da cisalhamento na regulação da função celular endotelial e o significado das interações células leucócito-endotélio¹³, vários modelos in vitro foram desenvolvidos durante as últimas décadas para estudar vários aspectos da cascata de migração leucócito em um ambiente mais controlado¹⁴. Dispositivos fluidos tradicionais para estudar interações células leucócitos-endoteliais podem ser classificados em duas grandes categorias¹⁴: a) dispositivos para estudar a expressão de moléculas de rolamento, adesão e adesão de leucócitos, como câmaras de fluxo de placas paralelas e b) dispositivos para estudar a migração de leucócitos em condições estáticas, como câmaras transwell. Sistemas como câmaras de fluxo de placas paralelas têm sido usados para estudar os papéis das moléculas de adesão e seus ligantes na cascata de aderência sob as forças^{de cisalhamento 15}. No entanto, uma desvantagem significativa é que esses dispositivos simplistas e idealizados (por exemplo, canal reto) não são capazes de reproduzir a escala e a geometria da microvasculatura in vivo (por exemplo, bifurcações vasculares sucessivas, morfologia vascular) e as condições de fluxo resultantes (por exemplo, fluxos convergentes ou divergentes em bifurcações). Como resultado, esses dispositivos só podem modelar a adesão, mas não a transmigração. As câmaras transwell só podem estudar a transmigração em condições estáticas sem considerar as características geométricas in vivo e as condições de fluxo. Assim, esses modelos tradicionais não imitam o microambiente dos tecidos vivos nem resolvem a adesão e a cascata migratória em um único ensaio⁶.

Para lidar com essa limitação, desenvolvemos e validamos extensivamente um novo ensaio microfluido biomimetético 3D (bMFA) (Figura 2), que reproduz realisticamente redes microvasculares in vivo em um chip 16,17,18. O protocolo de microfabricção deste dispositivo foi publicado anteriormente¹⁷ e é apenas brevemente descrito aqui. A microvasculatura do músculo cremaster do rato foi digitalizada usando uma abordagem modificada do Geographic Information System (GIS)¹⁹. Em seguida, a rede microvascular sintética foi gerada em polidimtilsiloxano (PDMS) utilizando processos de litografia suave com base na rede microvascular digitalizada 14,17,20,21,22. Resumidamente, as imagens digitalizadas da rede foram impressas no filme Mylar, que foi então usado como uma máscara para padronizar um fotoresist positivo SU-8 em cima de um wafer de silício para criar os mestres para fabricação. Pilares microfabricados (10 μm de diâmetro, 3 μm de altura) foram utilizados para criar os poros de 3 μm de altura e 100 μm de largura, um tamanho ideal para a migração de leucócitos 23,24,25, conectando os canais vasculares e compartimentos teciduais. O PDMS foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e derramado sobre os mestres desenvolvidos. Além disso, o PDMS foi desgaseado e autorizado a curar durante a noite em um forno (65 °C) para criar microcanais complementares em PDMS. Posteriormente, o PDMS curado foi descascado do mestre SU-8, seguido de portas perfuradoras para entradas/tomadas. Então, o PMDS foi ligado a um deslizamento de vidro. A superfície do dispositivo microfluido compreende vidro nativo e PDMS. Para promover o apego da célula, a disseminação e a proliferação, é necessário o revestimento da matriz extraceluar (ECM). O bMFA inclui uma rede microvascular e um compartimento de tecido conectado através de poros de 3 μm de altura e 100 μm de largura (Figura 2). Este sistema microfluido reproduz toda a cascata de adesão/migração leucócito em um ambiente 3D fisiologicamente relevante de uma rede microvascular completa com vasos interligados e bifurcações, incluindo circulação, margem, rolamento, adesão e migração de leucócitos para o compartimento vascular extra-tecido em um único sistema 14,16,17,21,26.

Deve-se notar que mesmo quando a taxa de fluxo na entrada de bMFA é fixada, as condições de fluxo na rede variam em diferentes locais e não podem ser calculadas por uma fórmula matemática simples. Um modelo baseado em dinâmica de fluidos computacionais (CFD) foi desenvolvido para calcular diferentes parâmetros de fluxo (por exemplo, estresse de cisalhamento, taxa de cisalhamento, velocidade) em diferentes locais da rede. Este modelo cfd foi utilizado para simular os padrões de perfusão de corante e parâmetros de fluxo no bMFA. A validação cruzada com resultados experimentais sugeriu que as resistências de fluxo em toda a rede são bem previstas pelo modelo computacional (Figura 3)¹⁷. Este modelo de CFD foi então utilizado para estimar o perfil de velocidade e taxa de cisalhamento em cada vaso de bMFA (Figura 4), permitindo a análise dos efeitos do fluxo de cisalhamento e geometria sobre rolamento de leucócitos, adesão e migração¹⁶. Leucócitos preferencialmente aderem perto de bifurcações e em regiões de baixa tesoura in vivo, e esses padrões espaciais de adesão leucócito foram demonstrados com sucesso na BMFA usando neutrófilos (Figura 5)¹⁶. Este artigo descreve o protocolo de preparação da BMFA para estudar a interação leucócito-endotelial sob condições inflamatórias usando células endoteliais pulmonares humanas (HLMVEC) e neutrófilos humanos. Sistemas microfisiológicos, como o bMFA, podem ser usados para estudar interações celulares endoteliais com diferentes tipos de células, como neutrófilos, monócitos, linfócitos e células tumorais 18,27,28,29,30. O bMFA pode ser semeado com células endoteliais primárias de diferentes órgãos (por exemplo, pulmão vs. cérebro) e diferentes espécies (por exemplo, células endoteliais humanas vs. murinas), bem como linhas de células endoteliais 21,27,31,32. O bMFA pode ser usado para estudar múltiplas respostas celulares, interações célula-células, função de barreira, entrega de drogas e toxicidade de drogas.

Protocolo

O sangue humano heparinizado é obtido para isolamento de neutrófilos de doadores adultos saudáveis (homens e mulheres, com idade entre 21 e 60 anos), seguindo o consentimento informado, conforme aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Temple University (Filadélfia, PA, EUA).

1. Priming e revestimento do dispositivo com fibronectina humana

NOTA: O bMFA possui duas portas de entrada e duas portas de saída conectadas ao compartimento vascular. Também possui uma porta conectada ao compartimento tecidual (Figura 2).

1. Inserir tubos (O.D. de 0,06" e I.D. de 0,02") (Tabela de Materials) para todas as portas, exceto uma porta de entrada com fórceps de ponto fino. Fixar as duas portas de saída e a porta do compartimento de tecido com grampos na mandíbula. Certifique-se de que cada tubo tem ~1 polegada de comprimento.
2. Diluir a fibronectina humana a 100 μg/mL com PBS a partir da solução de estoque de fibronectina (1mg/mL). Carregue uma seringa de 1 mL com solução de fibronectina preparada. Conecte a seringa a uma agulha de 24 G e uma tubulação de ~4 polegadas de comprimento.
   NOTA: Para evitar a ligação cruzada, não misture/pipeta a fibronectina humana. Outras matrizes extracelulares (ECM) como o colágeno podem ser usadas para diferentes tipos de células.
3. Insira a tubulação na porta de entrada aberta, empurre o êmbolo até que a fibronectina humana saia da outra porta de entrada e, em seguida, aperte-a. Repita este processo para o resto das portas até que todos os canais, compartimento de tecido e tubulação estejam preenchidos com a solução de fibronectina humana. Remova a agulha, mas mantenha a tubulação de 4 polegadas de comprimento inserida e sem arrepiar.
   NOTA: Certifique-se de que a tubulação está cheia de fibronectina antes de ser fixada.
4. Para desgasear, conecte a tubulação nãoclamped a um tanque de nitrogênio comprimido através do Primer Pneumatic, ajuste a pressão para ~5 psi e execute por ~15 min.
5. Depois de 15 min, verifique sob o microscópio para ter certeza de que não há bolhas de ar presas no dispositivo. Se houver bolhas de ar presas no canal ou compartimento de tecido, reconecte o dispositivo ao Primer Pneumático para desgassar novamente, ou seja, repita o passo 1.4.
   NOTA: O microscópio invertido é usado em todas as etapas que envolvem microscopia neste protocolo.
6. Remova o dispositivo do Primer Pneumático. Incubar o dispositivo a 37 °C por 1h, depois lave todos os canais e compartimento de tecido com mídia de cultura HLMVEC pré-aquecida (Tabela de Materiais), semelhante ao passo 1.3. O BMFA está pronto para semeadura celular.
   NOTA: Antes de remover/inserir uma tubulação da porta, primeiro coloque uma gota de água com uma pipeta ao redor da base da tubulação da porta de entrada para evitar que o ar entre no dispositivo.

2. Semeadura bMFA com HLMVEC

1. Cultura HLMVEC para 60%- 80% de confluência de acordo com o protocolo do fornecedor em um frasco T-25.
2. Aspirar mídia cultural HLMVEC a partir de frasco de cultura celular. Lave duas vezes com PBS.
3. Adicione 2 mL de solução pré-aquecida de trippsin-EDTA (37 °C) no frasco T-25. Incubar por 3-5 min em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO₂) até que a maioria das células sejam separadas do frasco.
   NOTA: O tempo de incubação pode variar para diferentes tipos de células e concentração de trypsin-EDTA.
4. Adicione 2 mL de Solução de Neutralização de Trypsin (TNS, 37 °C) ao frasco para neutralizar o trypsin-EDTA.
5. Toque suavemente no frasco para ajudar a dissociar as células. Em seguida, transfira a solução de suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
6. Centrifugar por 5 min a 150 x g para pelotar as células endoteliais. Remova as células supernascidas e resuspendas em 3 mL de mídia de cultura celular. Conte o número de células com um hemócito.
7. Centrifugar novamente por 5 min a 150 x g para pelotar as células. Remova o supernatante e resuspenda as células para a densidade de semeadura desejada de 20 x 10⁶/mL.
   NOTA: Dependendo dos tipos de células e da confluência, cerca de 2 x 10⁶ células endoteliais podem ser coletadas de dois frascos T-25, e com a densidade de semeadura de 20 x 10⁶/mL, 100 μL da célula de suspensão celular (2 x 10⁶ células endoteliais), é suficiente para semear 5 dispositivos.
8. Monte uma seringa de 1 mL na bomba de seringa programável, conecte tubos à agulha cega.
9. Desenhe ~20 μL da suspensão da célula para dentro da tubulação, certificando-se de que a suspensão da célula está apenas no tubo, não no barril de seringa.
10. Tire o grampo de uma porta de saída do dispositivo. Conecte a tubulação a uma entrada do dispositivo. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar seja introduzida no canal.
11. Inicie a bomba com uma vazão de 4-8 μL/min. Observe o dispositivo sob um microscópio.
12. Quando os canais estiverem cheios de células, pare a bomba, aperte a saída e corte a tubulação de entrada.
    NOTA: Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar no dispositivo.
13. Coloque o dispositivo na incubadora por 4h a 5% de CO₂ e 37 °C.
14. Após a incubação de 4h, prepare outra seringa cheia de mídia de cultura celular fresca. Monte a seringa em uma bomba de seringa, conecte a seringa à porta de entrada e remova o grampo de uma porta de saída.
15. Execute uma nova mídia através do dispositivo por cerca de 5 min a 4-8 μL/min para lavar células flutuantes/nãoectadas.

3. Cultura celular sob fluxo por 48 h

1. Prepare uma seringa cheia de mídia de cultura celular fresca. Monte a seringa em uma bomba de seringa, conecte a seringa a uma porta de entrada e mantenha uma saída aberta. Coloque o dispositivo na incubadora (5% DE CO₂, 37 °C).
2. Programe a bomba de seringa para cultivar células endoteliais sob fluxo usando as seguintes instruções mencionadas na Tabela 1.
3. Verifique o bMFA sob um microscópio após 48 horas de cultura sob fluxo. O HLMVEC deve abranger canais vasculares formando um lúmen completo (Figura 6).
   NOTA: Outros regimes de fluxo podem ser necessários para diferentes tipos de células.

4. Citocina e/ou tratamento terapêutico

NOTA: Como exemplo, esta seção descreve o uso do bMFA para estudar o impacto do tratamento das células com fator-alfa de necrose tumoral (TNF-α) e um novo inibidor anti-inflamatório (inibidor de peptídeos proteína Kinase C delta-TAT, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.

1. Prepare três dispositivos bMFA diferentes usando o protocolo acima (seção 1-3).
2. Carregue três seringas de 1 mL com mídia de cultura celular(TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM), respectivamente.
   NOTA: As citocinas são reconstituídas em meios de cultura celular.
3. Conecte as três seringas a três dispositivos bMFA. Trate o HLMVEC com tampão TNF-α ou inibidor TNF-α + por 4 h a 0,1 μL/min.
   NOTA: Com base em requisitos específicos de estudo, outros coquetéis de citocinas ou citocinas (por exemplo, TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gama (IFN-γ)), podem ser usados para tratar células endoteliais.

5. Isolamento de neutrófilos humanos

1. Use todos os reagentes à temperatura ambiente (RT). Os reagentes incluem mídia de isolamento leucócito, 1x tampão HEPES com Ca²⁺/Mg²⁺ (Tabela 2), 6% Dextran em soro fisiológico normal (0,9% NaCl), solução de NaCl de 3,6% e água desordenada (DI).
2. Pipeta 20 mL de mídia de isolamento de leucócitos em um tubo cônico de 50 mL e cuidadosamente camada 25 mL de sangue sobre a mídia de isolamento de leucócitos. Centrífuga por 40 min a 427 x g no RT.
   NOTA: Faça este passo devagar e com cuidado para evitar misturar a mídia de isolamento de sangue e leucócito.
3. Aspire até ~5 mL acima da camada de glóbulos vermelhos (RBC). A camada branca de buffy em cima da RBC é predominantemente neutrófilos.
4. Adicione o buffer HEPES para dobrar o volume atual (volume existente: buffer HEPES = 1:1).
5. Adicione uma quantidade de 6% de Dextran, que será de 20% do volume final. (volume atual/4 = volume de acréscimo de 6% de Dextran).
6. Inverta o tubo suavemente algumas vezes para misturar bem e deixe o sedimento RBC (~25 min).
7. Pipete cuidadosamente a camada superior (camada rica em neutrófilos) e transfira para um novo tubo de 50 mL, tenha cuidado para não contaminar com RBC sedimentado.
8. Centrifugar por 10 min a 315 x g em RT. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 8 mL de tampão HEPES.
9. Para lise o RBC residual, adicione 24 mL de água DI e misture suavemente por 50 s. Imediatamente, adicione 8 mL de solução NaCl de 3,6%, misture e centrífuga por 10 min a 315 x g no RT.
10. Remova o supernasce, lave a pelota celular com 15 mL de tampão HEPES e centrífuga por 5 min a 315 x g. Resuspend a pelota no buffer HEPES.

6. Experimento de adesão e migração de neutrófilos com bMFA

1. Resuspend os neutrófilos humanos isolados (15 milhões) em 999 μL de tampão HEPES.
2. Adicione 1 μL CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) solução de estoque de corante (10 mM) à suspensão de neutrófilo para obter uma concentração de trabalho de 10 μM CFDA-SE e incubar por 10 minutos na RT. Lave as células duas vezes com tampão HEPES por centrifugação por 5 min a 315 x g.
3. Conte os neutrófilos usando um hemótmetro e resuspende em 2 milhões de neutrófilos/mL com mídia de cultura celular, TNF-α (10 ng/mL) e TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM), respectivamente; incubar por 15 min no RT antes do início do experimento.
4. Prepare uma seringa preenchida com 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), o quimioattractant para o estudo, na mídia de cultura celular. Pegue bMFA e abra uma porta de entrada e uma porta de saída.
   NOTA: Estas condições experimentais são usadas para imitar as condições de sepse que incluem uma resposta inflamatória sistêmica com altos níveis de citocinas/quimioterapias circulantes. Além disso, fMLP, um peptídeo gram-negativo derivado de bactérias, é usado para modelar a presença de bactérias no pulmão (ou seja, compartimento de tecido).
5. Remova a tubulação da porta do compartimento do tecido e insira a tubulação fMLP. Injete ~20 μL de fMLP no compartimento tecidual para todos os bMFA, exceto aquele tratado apenas com mídia de cultura celular. Em seguida, corte a tubulação e aperte-a.
6. Encha a seringa com ~200 μL de suspensão de neutrófilo e monte a seringa na bomba de seringa.
7. Coloque o dispositivo no estágio do microscópio invertido (Tabela de Materiais).
8. Inicie a bomba a uma vazão de 1 μL/min e espere até que uma pequena gota da suspensão de neutrófilo saia da tubulação. Insira a tubulação na porta de entrada. Consulte a Figura 7 para a configuração.

7. Adquira imagens

1. Use a função Digitalizar grande imagem no software de análise de imagens do microscópio (Tabela de Materiais) para obter o mapa de adesão em bMFA (Figura 8) 10 min após o início do experimento. A maioria dos neutrófilos entram na BMFA durante os primeiros 10 minutos.
   NOTA: Mantenha a luz da fluorescência desligada ao não tirar imagens para reduzir o fotobleaching.
2. Durante a próxima hora, faça imagens timelapse (1 imagem a cada 5 minutos) do compartimento de tecido (Figura 8B,C) para análise de migração para obter o mapa de migração.

8. Análise de imagem digital

1. Para o mapa de adesão, conte o número de neutrófilos aderidos em cada vaso. Para cada bifurcação, crie uma região circular de interesse (ROI) com diâmetro igual a duas vezes o diâmetro do vaso e conte o número de neutrófilos aderidos.
2. Use a contagem manual ou a função automatizada de contagem de objetos para quantificar o número de neutrófilos que adusinam em cada vaso e região de bifurcação.
3. Use o mapa de taxa de corte da rede gerada usando simulação CFD¹⁷ para determinar a taxa de tesoura em cada vaso. Em seguida, plote o número de neutrófilos aderidos em um determinado vaso contra a taxa de corte naquele vaso para criar um mapa de taxa de corte na bMFA, como mostrado na Figura 9A.
4. Os neutrófilos são contados como migrados se cruzaram o endotélio para o compartimento tecidual. Conte o número de neutrófilos migrados em 10 minutos, 15 min, 30 min e 60 min. Plote o número de neutrófilos migrados versus o tempo, como mostrado na Figura 9B.

Resultados

Após 48h de cultura sob fluxo de cisalhamento na BMFA, as células endoteliais cobriam a superfície dos canais vasculares na BMFA e se alinhavam na direção do fluxo (Figura 6). A microscopia confocal indicou que todas as superfícies dos canais vasculares estavam cobertas por células endoteliais, formando um lúmen 3D completo em bMFA¹⁸.

Usando este protocolo, um mapa de adesão de neutrófilos pode ser adquirido, mostrando que há uma...

Discussão

O bMFA reproduz as condições de topografia e fluxo das redes microvasculares in vivo e pode ser usado para estudar a interação celular leucócito-endotelial e a função endotelial in vitro em condições fisiologicamente realistas. Na microvasculatura de camundongos ou humanos, a geometria das redes microvasculares são auto-similares e fractais, e o número reynolds << 1, indicando que a geometria vascular não afeta significativamente os padrões de fluxo. Portanto, o bFMA pode ser usado para est...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)	SynVivo	SMN1-C001	Exclusive at SynVivo
Blunt needle	Jensen Global	JG24-0.5
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C70-500
CFDA, SE	ThermoFisher	C1157
Dextran, 250,000, Powder	Spectrum Chemical Mfg. Corp	DE-130
Ficoll-Paque Premium	GE Health Care	17-5442-02	Leukocyte isolation media
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506
Hepes	Fisher Scientific	AAJ1692630
Human fibronectin	Fisher Scientific	33-016-015	use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	cc-3202	Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells	Lonza	cc-2527	use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments Inc.		Microscope
NIS-elements, 5.20.01	Nikon Instruments Inc.		Imaging software
PBS	Fisher Scientific	MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3007	Syringe Pump
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha	R&D Systems	210-TA
Slide clamp	SynVivo
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640-500
Synvivo Pneumatic Primer	SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)	Lonza	cc-5034
Tygon tubing	Fisher Scientific	50-206-8921	Tubing