JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

للتغلب على قيود الطفرات الكلاسيكية الموجهة للموقع ، تم دمج نظائر البرولين مع تعديلات محددة في العديد من البروتينات الفلورية. نوضح كيف يؤثر استبدال الهيدروجين بالفلور أو الواحد بروابط مزدوجة في بقايا البرولين ("الجراحة الجزيئية") على خصائص البروتين الأساسية ، بما في ذلك طيها وتفاعلها مع الضوء.

Abstract

غالبا ما يكون استبدال بقايا البرولين (Pro) في البروتينات بالطفرات التقليدية الموجهة إلى الموقع بأي من الأحماض الأمينية الأساسية ال 19 المتبقية ضارا بطي البروتين ، وعلى وجه الخصوص ، نضج الكروموفور في بروتينات الفلورسنت الخضراء والمتغيرات ذات الصلة. البديل المعقول هو التلاعب بترجمة البروتين بحيث يتم استبدال جميع بقايا Pro - على وجه التحديد بنظيراتها ، وهي طريقة تعرف باسم دمج الضغط الانتقائي (SPI). يمكن استخدام التعديلات الكيميائية المدمجة كنوع من "الجراحة الجزيئية" لتشريح التغييرات القابلة للقياس بدقة أو حتى التلاعب بعقلانية بخصائص البروتين المختلفة. هنا ، توضح الدراسة فائدة طريقة SPI لدراسة دور البرولينات في تنظيم بنية β برميل نموذجية للمتغيرات الطيفية لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) مع 10-15 برولينات في تسلسلها: بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) ، NowGFP ، و KillerOrange. توجد المخلفات الاحترافية في أقسام الربط بين خيوط β الفردية وتشكل أغطية الإغلاق للسقالة البرميلية ، وبالتالي فهي مسؤولة عن عزل الكروموفور عن الماء ، أي خصائص التألق. تم إجراء تجارب دمج الضغط الانتقائي مع (4 R) - فلوروبرولين (R-Flp) ، (4 S) - فلوروبرولين (S-Flp) ، 4،4-ثنائي فلورو برولين (Dfp) ، و 3،4-ديهيدروبرولين (Dhp) باستخدام سلالة E. coli المختمنة بالبرولين كمضيف تعبير. وجدنا أن البروتينات الفلورية مع S-Flp و Dhp نشطة (أي الفلورسنت) ، في حين أن النظيرين الآخرين (Dfp و R-Flp) أنتجا بروتينات مختلة وظيفيا وغير مطوية. أظهر فحص امتصاص UV-Vis وملفات تعريف الانبعاثات الفلورية بعض التغييرات المميزة في البروتينات التي تحتوي على نظائرها Pro. أظهر فحص الملامح الحركية القابلة للطي في متغيرات EGFP عملية إعادة طي متسارعة في وجود S-Flp ، في حين كانت العملية مشابهة للنوع البري في البروتين الذي يحتوي على Dhp. تعرض هذه الدراسة قدرة طريقة SPI على إنتاج تعديلات طفيفة على بقايا البروتين على المستوى الذري ("الجراحة الجزيئية") ، والتي يمكن اعتمادها لدراسة البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. وهو يوضح نتائج بدائل البرولين مع نظائرها الكيميائية الوثيقة على الخصائص القابلة للطي والطيفية في فئة البروتينات الفلورية β برميل.

Introduction

يسمح الطفرات الكلاسيكية الموجهة للموقع بتباديل أي تسلسل بروتين مشفر جينيا موجودا عن طريق التلاعب بالكودون على مستوى الحمض النووي. لدراسة طي البروتين واستقراره ، غالبا ما يكون من المستحسن استبدال الأحماض الأمينية المماثلة بنظيراتها المماثلة. ومع ذلك ، فإن طفرات البروتين التقليدية تقتصر بالتأكيد على بدائل مماثلة هيكليا بين الأحماض الأمينية الأساسية مثل Ser / Ala / Cys و Thr / Val و Glu / Gln و Asp / Asn و Tyr / Phe ، والتي توجد في ذخيرة الشفرة الوراثية القياسية. من ناحية أخرى ، لا توجد مثل هذه الاحتمالات للأحماض الأمينية الأساسية الأخرى مثل Trp أو Met أو His أو Pro ، والتي غالبا ما تلعب أدوارا هيكلية ووظيفية أساسية في البروتينات1. النهج المثالي لدراسة هذه التفاعلات في سياق البنية الداخلية المحددة للغاية للبروتينات وعملية طيها هو توليد تعديلات متساوية غير مدمرة. في الواقع ، عندما يتم إدخال نظائر الأحماض الأمينية متساوي الستيريك لهذه الأحماض الأمينية الأساسية ، والمعروفة أيضا باسم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NCAAs) ، في البروتينات ، فإنها تسمح بتغييرات طفيفة حتى على مستوى الذرات المفردة أو مجموعات الذرات مثل H / F ، CH2 / S / Se / Te المعروفة باسم "الطفرات الذرية"2. تنتج هذه "الجراحة الجزيئية" بروتينات معدلة تنتج خصائصها فقط عن تبادل الذرات المفردة أو مجموعات الذرات ، والتي يمكن تحليلها في الحالات المواتية ، ويمكن ترشيد التغييرات المكتشفة. وبهذه الطريقة ، يمتد نطاق تخليق البروتين لدراسة طي البروتين وبنيته إلى ما هو أبعد من طفرات الحمض النووي الكلاسيكية. لاحظ أن البروتينات الناتجة عن الطفرات الموجهة للموقع يشار إليها عادة باسم "الطفرات" ، في حين يشار إلى البروتينات التي تحتوي على أحماض أمينية أساسية بديلة باسم "المتغيرات" 3 أو "البروتينات" 4 أو "متجانسات البروتين"5.

يظهر بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، الذي تم تحديده لأول مرة في الكائن البحري Aequorea Victoria ، تألقا أخضر ساطعا عند تعرضه للضوء فوق البنفسجي إلى الأزرق 6,7. اليوم ، يستخدم GFP بشكل شائع كأداة وضع علامات حساسة للغاية للتصور الروتيني للتعبير الجيني وتوطين البروتين في الخلايا عبر الفحص المجهري الفلوري. وقد أثبتت GFP أيضا أنها مفيدة في مختلف الدراسات الفيزيائية الحيوية8،9،10 والطبية الحيوية 11،12 ، وكذلك في هندسة البروتين13،14،15. مكن التحليل الدقيق لهيكل GFP من إنشاء العديد من المتغيرات التي تتميز بالاستقرار المتنوع والتألق الأقصى16,17. معظم متغيرات GFP المستخدمة في البيولوجيا الخلوية والجزيئية هي بروتينات أحادية اللون سواء في المحلول أو في البلورة18. تنظيمها الهيكلي الرئيسي نموذجي لجميع أفراد عائلة GFP ، بغض النظر عن أصلهم الجيني ، ويتكون من 11 خيوطا β تشكل ما يسمى برميل β ، في حين أن الحلزون α المتشابك يمر عبر مركز البرميل ويحمل الكروموفور (الشكل 1A). يتطلب النضج الذاتي للكروموفور (الشكل 1B) تحديد المواقع الدقيقة للسلاسل الجانبية المحيطة به في المكان المركزي للبروتين. يتم الحفاظ على العديد من هذه السلاسل الجانبية بشكل كبير في متغيرات GFP الأخرى19. في معظم البروتينات الفلورية من قناديل البحر مثل Aequorea Victoria ، يتكون الكروموفور الباعث للأخضر من حلقتين عطريتين ، بما في ذلك حلقة الفينول من Tyr66 والبنية الحلقية غير المتجانسة المكونة من خمسة أعضاء من إيميدازولينون (الشكل 1B). الكروموفور ، عندما يكون جزءا لا يتجزأ من مصفوفة البروتين بشكل صحيح ، يكون مسؤولا عن التألق المميز للبروتين بأكمله. يقع في وسط الهيكل ، في حين أن هيكل البرميل يعزله عن الوسط المائي20. إن تعرض الكروموفور للمياه السائبة سيؤدي إلى إخماد التألق ، أي فقدان التألق21.

يعد الطي السليم للبنية الشبيهة بالبرميل ضروريا لحماية الكروموفور من التبريد الفلوري22. تلعب بقايا البرولين (Pro) دورا خاصا في التنظيم الهيكلي ل GFP23. كونها غير قادرة على دعم β ، فإنها تشكل حلقات ربط مسؤولة عن الحفاظ على بنية البروتين ككل. ليس من المستغرب أن توجد 10-15 بقايا برولين في كل من GFPs المشتقة من Aequorea و Anthoathecata. يتم حفظ بعضها بشكل كبير في أنواع أخرى من البروتينات الفلورية β البرميل. من المتوقع أن يؤثر البرولين بشكل حاسم على خصائص الطي بسبب ميزاته الهندسية الغريبة. على سبيل المثال، في GFPs المشتقة من Aequorea، من بين بقايا البرولين العشرة (الشكل 2A)، تشكل تسعة منها ترانس وواحد فقط يشكل رابطة رابطة الدول المستقلة - الببتيد (Pro89). Pro58 ضروري ، أي غير قابل للتبديل مع بقية الأحماض الأمينية الأساسية ال 19. قد تكون هذه البقايا مسؤولة عن تحديد الموقع الصحيح لبقايا Trp57 ، والتي تم الإبلاغ عنها لتكون حاسمة لنضج الكروموفور وإجمالي GFP القابل للطي24. الجزء PVPWP مع ثلاثة بقايا برولين (Pro54 ، Pro56 ، Pro58) و Trp57 هو الجزء الأساسي من "الغطاء السفلي" في هيكل GFP من الشكل 1A. تم العثور على الشكل الهيكلي PVPWP في العديد من البروتينات مثل السيتوكروم وقنوات البوتاسيوم المنشطة بالجهد حقيقي النواة25. بدائل البرولين إلى الألانين في المواضع 75 و 89 ضارة أيضا بالتعبير عن البروتين والطي وإلغاء نضج الكروموفور. Pro75 و Pro89 هما جزء من "الجفن العلوي" الذي يدفن الكروموفور (الشكل 1A) ويتم حفظهما عبر بروتينات الفلورسنت β 11 التي تقطعت بها السبل23. هذان "الغطاءان" يبقيان الكروموفور مستبعدا من المذيب المائي ، حتى عندما يتم كسر البنية الثلاثية المستقرة جزئيا26. تحمي هذه البنية الجزيئية المحددة الفلوروفور من التبريد الفلوري التصادمي (الديناميكي) ، على سبيل المثال ، عن طريق الماء أو الأكسجين أو غيرها من الأربطة القابلة للانتشار.

من أجل إجراء الهندسة الجزيئية لبنية GFP ، ينبغي للمرء أن يدخل بدائل الأحماض الأمينية في البنية الأساسية للبروتين. تم إجراء العديد من الطفرات على GFP ، مما يوفر للمتغيرات استقرارا مرتفعا ، وطي سريع وموثوق به ، وخصائص فلورية متغيرة17. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، تعتبر طفرة بقايا البرولين نهجا محفوفا بالمخاطر بسبب حقيقة أنه لا يمكن لأي من الأحماض الأمينية الأساسية ال 19 المتبقية استعادة المظهر التوافقي لبقايا البرولين27 بشكل صحيح. وهكذا ، تم تطوير نهج بديل ، حيث يتم استبدال بقايا البرولين بهياكل أخرى قائمة على البرولين ، يطلق عليها اسم نظائر البرولين28. نظرا لتركيبته الكيميائية الدورية الفريدة ، يظهر البرولين انتقالين توافقيين مميزين (الشكل 1C): 1) تجعد حلقة البرولين ، وهي عملية سريعة تنطوي على تنظيم العمود الفقري ، والتي تؤثر في المقام الأول على زاوية التواء φ ، و 2) رابطة الببتيد cis/trans isomerization ، وهي عملية بطيئة تؤثر على طي العمود الفقري عبر زوايا التواء ω. نظرا لطبيعته البطيئة ، فإن الانتقال الأخير مسؤول عادة عن خطوات الحد من المعدل في عملية طي البروتين بأكمله. وقد تبين سابقا أن رابطة الببتيد CIS/trans isomerization حول بعض بقايا البرولين تتميز بخطوات بطيئة في طي متغيرات GFP. على سبيل المثال ، يتميز تكوين رابطة الدول المستقلة والببتيد في Pro89 بالخطوة البطيئة في عملية الطي لأنه يعتمد على انتقال الرابطة من trans إلى cis29. يمكن تحقيق إعادة طي أسرع بعد استبدال Pro89 بحلقة ببتيد متحولة بالكامل ، أي عن طريق إلغاء حدث الأيزومرات من رابطة الدول المستقلة إلى الترانس 30. بالإضافة إلى أيزومرات رابطة الدول المستقلة / عبر ، قد تولد انتقالات الثقب أيضا تغييرات عميقة في طي البروتين بسبب تنظيم العمود الفقري والتعبئة داخل البروتين الداخلي27,31.

تؤدي التعديلات الكيميائية إلى تغيير التحولات التوافقية الجوهرية لبقايا البرولين ، مما يؤثر على قدرة البروتين على الطي. بعض نظائر البرولين هي مرشحات جذابة بشكل خاص لاستبدال البرولين في البروتينات لأنها تسمح بالتلاعب ودراسة خصائص الطي. على سبيل المثال ، (4R) - فلوروبرولين (R-Flp) ، (4S) - فلوروبرولين (S-Flp) ، 4،4-ثنائي فلورو برولين (Dfp) ، و 3،4-ديهيدروبرولين (Dhp) هي أربعة نظائر (الشكل 1D) تختلف اختلافا طفيفا عن البرولين من حيث كل من الحجم الجزيئي والقطبية32. في الوقت نفسه ، يعرض كل تناظري تجعد حلقة مميزة: S-Flp يستقر في C 4-endo pucker ، R-Flp يستقر في C 4-exo pucker ، Dfp لا يظهر أي تفضيل واضح للبكر ، بينما يلغي Dhp التجعد (الشكل 1D)33. باستخدام هذه النظائر في بنية البروتين ، يمكن للمرء أن يتلاعب بالانتقال التوافقي لبقايا البرولين ، ومع هذا ، يؤثر على خصائص متغيرات GFP الناتجة.

في هذا العمل ، شرعنا في دمج المجموعة المعينة من نظائر البرولين (الشكل 1D) في بنية متغيرات GFP باستخدام طريقة دمج الضغط الانتقائي (SPI ، الشكل 3)34. استبدال بقايا الأحماض الأمينية بأقرب نظائرها متساوية البنية هو مفهوم التكنولوجيا الحيوية المطبق في تصميم البروتين35,36. وبالتالي ، فإن تأثيرات نظائر البرولين في بروتين نموذجي توضح قدرتها على العمل كأدوات في هندسة البروتين37. تم إنتاج البروتينات التي تحتوي على نظائرها المرغوبة في سلالات E. coli المعدلة غير القادرة على إنتاج البرولين (البرولين-أوكسوتروفي). وبالتالي ، يمكن إجبارهم على قبول استبدال الركائز في عملية التخليق الحيوي للبروتين38. يتم تمكين هذا الاستبدال العالمي للبرولين من خلال مرونة الركيزة الطبيعية لمركب أمينواسيل-tRNA الداخلي39 ، الإنزيمات الرئيسية التي تحفز أسترة tRNAs مع الأحماض الأمينية المناسبة40. بشكل عام ، كما هو موضح في الشكل 3 ، يتم إجراء النمو الخلوي في وسط محدد حتى يتم الوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط. في الخطوة التالية ، يتم استنفاد الحمض الأميني المراد استبداله داخل الخلايا من نظام التعبير أثناء التخمير ثم يتم استبداله لاحقا بواسطة التناظرية المطلوبة أو ncAA. ثم يتم تحفيز تعبير البروتين المستهدف لدمج الأحماض الأمينية غير الأساسية الخاصة بالبقايا. يحدث استبدال الحمض الأميني cognate مع نظيره بطريقة على نطاق البروتين. على الرغم من أن هذا التأثير الجانبي قد يكون له تأثير سلبي على نمو سلالة المضيف ، إلا أن جودة إنتاج البروتين المستهدف لا تتأثر في الغالب ، لأنه ، في التعبير المؤتلف ، يتم توجيه الموارد الخلوية بشكل أساسي إلى إنتاج البروتين المستهدف41,42. لذلك ، فإن نظام التعبير المنظم بإحكام والقابل للحث والمروجين الأقوياء أمر بالغ الأهمية لكفاءة التأسيس العالية43. يعتمد نهجنا على الدمج المتعدد الخاص بالبقايا ل ncAAs استجابة للكودونات الحسية (إعادة تعيين كودون الحس) ، حيث يمكن التلاعب بعدد المواضع للإدراج التناظري Pro داخل الجين المستهدف عبر الطفرات الموجهة للموقع44. تم تطبيق نهج مماثل في تقريرنا السابق على إعداد الببتيدات المؤتلفة ذات الخصائص المضادة للميكروبات45. في هذا العمل ، قمنا بتطبيق طريقة SPI ، والتي تسمح باستبدال جميع بقايا البرولين بنظائرها ذات الصلة ، لتوليد بروتينات من المتوقع أن تمتلك خصائص فيزيائية كيميائية متميزة غير موجودة في البروتينات المصنعة مع ذخيرة الأحماض الأمينية الأساسية. من خلال توصيف ملف تعريف الطي والتألق للمتغيرات الناتجة ، نهدف إلى عرض آثار البدائل الذرية في متغيرات GFP.

Protocol

1. إدخال بلازميدات التعبير في خلايا الإشريكية القولونية المختصة

  1. امزج 1 نانوغرام من كل عينة من البلازميد ، pQE-80L H 6-EGFP ، pQE-80L H 6-NowGFP ، و pQE-80L H 6-KillerOrange ، مع 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا أو الكهربية من سلالة E. coli K12 المشتقة من Pro-auxotrophic Jm83 (Addgene # 50348 ، أو ATCC # 35607) للتحويل بواسطة طريقة الصدمة الحرارية أو الكهربية وفقا للبروتوكولات المتاحة 46 ، 47.
    ملاحظة: يقوم متجه التعبير pQE-80L EGFP-H 6 بتشفير بروتين فلورسنت أخضر محسن (EGFP) ذو علامة C-terminally 6xHis، ويقوم متجهو التعبير pQE-80L H 6-NowGFP و pQE-80L H 6-KillerOrange بتشفير N-terminally 6xHis-tagged NowGFP 48 أو N-terminally 6xHis-marked KillerOrange 49، على التوالي، كل منهما في العمود الفقري البلازميدي pQE-80L. تخضع جميع الجينات المستهدفة لسيطرة مروج T5 البكتيري الذي ينظمه مشغل lac. تم استخدام مقاومة الأمبيسلين كعلامة اختيار و colE1 كأصل للتكرار. انظر جدول المواد لمزيد من المعلومات حول بلازميد pQE-80L. يمكن استخدام الإشريكية القولونية البديلة المؤيدة للأكسوتروفيك الناشئة عن سلالات K-12 و B للتعبير أيضا ويجب أن تسفر عن نتائج مماثلة. الكتلة الجزيئية المحسوبة للبروتينات البرية من النوع البري H 6-tagged 6 ([M + H] +) (بعد نضج الكروموفور) هي 27,745.33 Da (EGFP- H 6) ، و 27,931.50 Da (H 6-NowGFP) ، و 27,606.09 Da (H 6-KillerOrange). وترد الهياكل الأولية للبروتينات المستهدفة في الجدول 1 (تسطير علامته). تم تحديد الجلوتامين (Q) ضمن تسلسل علامته من NowGFP عن طريق تسلسل الحمض النووي بعد الاستنساخ الفرعي ل NowGFP cDNA المستلم من Pletnev et al.51 في بلازميد pQE-80L. لا يعيق تنقية البروتين أو خصائص البروتين الفلوري.
  2. استعادة الخلايا في 950 ميكرولتر من وسط SOC عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. انشر 50 ميكرولتر من الخلايا المستردة على صفائح لوريا أجار المتوسطة (انظر المادة التكميلية) التي تحتوي على الجلوكوز (10 جم / لتر) والأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل).
  4. احتضان لوحات لوس أنجلوس المتوسطة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. إنتاج البروتينات الفلورية المؤتلفة من النوع البري (إيواء البرولين الأساسي) وإجراءات دمج الضغط الانتقائي (SPI) لإنتاج بروتينات الفلورسنت مع نظائر البرولين (S-Flp ، R-Flp ، Dfp ، Dhp)

  1. الاستزراع الليلي للسلالة المشتقة من الإشريكية القولونية K12 المؤيدة للتغذية المساعدة JM83 التي تؤوي pQE-80L EGFP- H 6 و pQE-80L H 6-NowGFP و pQE-80L H 6-KillerOrange
    1. استخدم طرف ماصة معقم أو حلقة تلقيح لاختيار مستعمرة واحدة من صفيحة متوسطة في لوس أنجلوس وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من وسط مرق الليسوجيني (LB) (انظر المواد التكميلية ؛ تحتوي على 10 جم / لتر جلوكوز ، 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين) في أنبوب مستنبت البوليسترين 14 مل معقم.
      ملاحظة: يوصى بالمستعمرات المحولة حديثا للتلقيح. يجب استخدام الخلايا الموجودة على الألواح المتوسطة LA (من الخطوة 2.2) المخزنة عند 4 درجات مئوية في غضون بضعة أيام.
    2. تنمو زراعة الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 200-250 دورة في الدقيقة.
  2. إنتاج EGFP- H المؤتلف6، ح6-NowGFP و H6-KillerOrange مع البرولين الأصلي ومتغيرات البروتين المقابلة مع نظائرها البرولين
    1. تلقيح 200 مل من NMM الطازج المتوسط (7.5 mM (NH 4)2 SO 4 ، 50 mM K 2 HPO 4 و 22 mM KH 2 PO 4 ، 8.5 mM NaCl ، 1 mM MgSO 4 ، 20 mM D-glucose ، 1 ميكروغرام / مل FeCl 2 ، 1 ميكروغرام / مل CaCl 2، 10 ميكروغرام / مل الثيامين ، 10 ميكروغرام / مل البيوتين ، 0.01 ميكروغرام / مل العناصر النزرة (CuSO 4 ، ZnCl2 ، MnCl 2 ، (NH 4) 2 MoO4) ، الرقم الهيدروجيني ~7.2) مع جميع الأحماض الأمينية الأساسية (50 ملغ / لتر) ؛ انظر المواد التكميلية) مع استكمال 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين مع 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها في قارورة Erlenmeyer سعة 2 لتر.
      ملاحظة: اعتمادا على نوع البروتين ، يمكن اختبار وسائط الزراعة البديلة مثل MOPS المتوسطة 52 ، أملاح الجلوكوز المعدنية المتوسطة 53 ، Davis الحد الأدنى المتوسط54 ، M9 الحد الأدنى المتوسط55 ، أو GMML 56 لتحسين إنتاجية البروتين.
    2. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 220 دورة في الدقيقة لمدة ~ 3 ساعات و 30 دقيقة.
    3. قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) في مقياس الطيف الضوئي كل 30 دقيقة حتى يتم الوصول إلى قيمة OD600 ~ 0.7.
      ملاحظة: لتحديد OD600 في مقياس الطيف الضوئي ، يجب أن يكون طول الكوفيت 1 سم. يتم استخدام وسط الزراعة المقابل للقياس المرجعي ("صفر"). قد يعتمد وقت الحضانة حتى يتم الوصول إلى قيمة OD600 ~ 0.7 على حجم الثقافة. 3 ساعات و 30 دقيقة هي قيمة تقريبية. في تباين للخطوات الفرعية للبروتوكول 2.2.1-2.2.3.، الثقافة من الخطوة الفرعية 2.1.2. يستخدم لتلقيح وسط NMMΔPro الطازج (انظر المادة التكميلية) مع استكمال تركيز محدود من البرولين (على سبيل المثال ، 5 ملغ / لتر بدلا من 50 ملغ / لتر) ، وتزرع الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، يتم إجراء تحديد OD600 كل 30 دقيقة حتى تكون الاختلافات بين القياسات أقل من 0.05. يجب أن يكون الحد الأقصى لقيمة OD600 حوالي 1 (± 0.3). يمكن تعديل تركيز البرولين الأولي المحدود اعتمادا على سلالة التعبير ووسط الزراعة (انظر المناقشة).
    4. قم بتدوير تعليق الخلية لمدة 10 دقائق عند 3000 × g و 4 °C.
    5. صب بلطف supernatant في النفايات.
    6. خطوة الغسيل: أعد تعليق الخلايا في 50 مل من NMMΔAA البارد (بدون أي حمض أميني ، انظر المواد التكميلية) أو NMMΔPro (بدون برولين ، انظر المواد التكميلية) متوسطة عن طريق السحب الدقيق.
      ملاحظة: بالنسبة لخطوة الغسيل هذه ، يمكن استخدام أي من المخازن المؤقتة المذكورة ، لأنه من المهم فقط التخلص من البرولين المتبقي في وسط الحضانة.
    7. افصل الخلايا عن الوسط عن طريق الترسيب عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي عند 3000 × g لمدة 10 دقائق.
    8. صب بلطف supernatant في النفايات.
    9. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 مل من NMMΔPro المتوسطة المكملة مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين في قارورة Erlenmeyer سعة 2 لتر.
      ملاحظة: يمكن فصل تعليق الخلية الناتج إلى عدة عينات متساوية الحجم للحصول على ثقافات بداية متطابقة لمقارنة تعبير البروتين في وجود نظائر Pro أو proline (على سبيل المثال ، الفصل إلى 4 × 50 مل في قوارير Erlenmeyer 100 مل).
    10. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 220 دورة في الدقيقة للاستنفاد الكامل ل Pro.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لاستنفاد Pro تماما من الخلايا.
    11. أضف حجما مناسبا من L-proline أو R-Flp و S-Flp و Dfp و Dhp من محلول مخزون 50 mM لضبط التركيز النهائي 1 mM في تعليق الخلية.
      ملاحظة: كقاعدة عامة، يجب دائما إعداد حلول مخزون جديدة بسعة 50 ملليمتر من مشتقات برو أو برولين قبل الاستخدام. فقط إذا لم يكن التحلل المائي للحمض الأميني المسند أو غير القانوني في محلول مائي مصدر قلق ، يمكن استخدام المخزونات المجمدة أيضا.
    12. أضف 0.5 mM IPTG من محلول مخزون 1 M للحث على التعبير عن البروتين المستهدف.
    13. عبر عن البروتين المستهدف بين عشية وضحاها (12 ساعة) عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 220 دورة في الدقيقة.
    14. قياس OD600 في اليوم التالي.
      ملاحظة: يتم تحديد OD600 لتحديد كمية الخلايا بعد التعبير عن البروتين. تشير قيمة OD600 المنخفضة مقارنة بالقيمة المقاسة قبل خطوة الغسيل 2.2.3 إلى السمية الخلوية للحمض الأميني المورد. في هذه الحالة ، يجب تكرار الإجراء مع تقليل تركيز الأحماض الأمينية الموردة (حتى 0.1 ملليمتر).
    15. جهاز الطرد المركزي وجمع الخلايا البكتيرية في 5000 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وصب supernatant في النفايات.
    16. خطوة الغسيل: أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب الدقيق في 50 مل من المخزن المؤقت للربط (50 ملليمتر Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 150 mM NaCl ، 1 mM DTT) الذي يحتوي على 10٪ من الجلسرين ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب بوليسترين مخروطي 50 مل.
    17. جهاز الطرد المركزي وجمع الخلايا البكتيرية في 5000 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وصب supernatant في النفايات.
    18. قم بتخزين حبيبات الخلية في أنبوب بوليسترين مخروطي 50 مل عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام (تنقية البروتين ، انظر أدناه).

3. إجراء تنقية عينات البروتين بواسطة كروماتوغرافيا تقارب أيون المعدن المجمدة (IMAC)

  1. تحلل الخلايا البكتيرية
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات تحلل الخلايا على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لمنع تدهور البروتين المستهدف.
    1. قم بإذابة حبيبات الخلايا البكتيرية على الجليد أو عند 4 درجات مئوية في أنبوب بوليسترين مخروطي سعة 50 مل لمدة 10-20 دقيقة.
    2. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للربط على الجليد البارد (انظر المادة التكميلية) وقم بماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق حبيبات الخلية.
    3. أضف 100 ميكرولتر من 50 ملغم / مل ليزوزيم ، 100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل DNase I ، 100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل RNase A ، 30 ميكرولتر من 1 م MgCl2. قم بعكس تعليق الخلية بعناية خمس مرات ، واحتفظ بالأنبوب المغلق على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: يحفز الليزوزيم تحلل الخلايا الكيميائي عن طريق تعطيل جدار الخلية البكتيرية.
    4. قم بإلغاء صوت العينة لاضطراب الخلايا باستخدام مجانس الموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال ، 3 مرات لمدة 3 دقائق في أنبوب بوليسترين سعة 50 مل على خليط من الماء المثلج ، نبض 2 ثانية / توقف مؤقت 4 ثوان ، سعة 45٪).
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى لتعطيل الخلايا ، على سبيل المثال ، التجانس عالي الضغط في 20 دورة عند 14000 رطل لكل بوصة مربعة. إذا لزم الأمر، قم بتخفيفه باستخدام مخزن مؤقت ملزم (انظر المواد التكميلية) للوصول إلى الحد الأدنى لحجم الأداة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام كواشف استخراج البروتين لتعطيل الخلايا. راجع جدول المواد للحصول على أمثلة.
    5. جهاز طرد مركزي لمدة 60 دقيقة عند 18000 × جم ، 4 درجات مئوية.
    6. دون حجم السائل للخطوة الفرعية 3.1.9. وصب supernatant في أنبوب البوليسترين 50 مل الطازجة.
    7. قم بمسح supernatant باستخدام مرشح غشاء بقطر مسام 0.45 ميكرومتر.
    8. خذ عينة من "lysate" ل SDS-PAGE (انظر القسم 4. أدناه) ؛ هذا يتوافق مع "جزء البروتين القابل للذوبان" ، supernatant من الخطوة الفرعية 3.1.6.
    9. أضف حجما مساويا ل ddH2O كما هو محدد في الخطوة الفرعية 3.1.6. إعادة تعليق حطام الخلايا من أجل الحفاظ على نفس التخفيف للعينات من أجل تحليل SDS-PAGE اللاحق.
    10. خذ عينة من "الكريات" ل SDS-PAGE (انظر القسم 4. أدناه) ؛ هذا يتوافق مع "جزء البروتين غير القابل للذوبان" ، تعليق حطام الخلية من الخطوة الفرعية 3.1.9.
  2. تنقية كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة (IMAC)
    ملاحظة: يمكن إجراء تنقية البروتين الفلوري المستهدف عند 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة (RT). بالنسبة للخيار الأخير ، انتظر حتى يتوازن الليزات والعمود وجميع المخازن المؤقتة عند RT لمنع تكوين فقاعة الهواء بسبب تبخير الهواء المحبوس في محلول بارد عند وضعه في عمود دافئ.
    1. تنقية العينة باستخدام عمود IMAC FPLC (كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين [أو الأداء] معبأة مسبقا أو معبأة ذاتيا 1 مل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ؛ تعيين الحد الأقصى لضغط العمود إلى 0.3 ميجا باسكال ، ومعدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة ؛ استخدم المخزن المؤقت للربط (انظر المواد التكميلية) لتوازن العمود ، والمخزن المؤقت للغسيل (انظر المادة التكميلية) لخطوة الغسيل ، والمخزن المؤقت للإزالة (انظر المواد التكميلية) لاستخراج البروتين المستهدف.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق نظام FPLC الآلي لتلوين البروتين المستهدف باستخدام مخزن مؤقت للتخليق يعمل على تدرج تركيز إيميدازول خطي (20-200 ملليمتر).
    2. جمع وتجميع الكسور المستوية مع البروتينات الفلورية (اختر اللون الأخضر أو البرتقالي المرئي).
    3. انقل الكسور المجمعة إلى غشاء غسيل الكلى (قطع الوزن الجزيئي (MWCO) من 5000-10000) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بالتحويل ثلاث مرات على الأقل ضد مخزن غسيل الكلى المؤقت أو المخزن المؤقت MS (انظر المواد التكميلية). على سبيل المثال ، قم بإجراء غسيل الكلى لعينة 1-mL ثلاث مرات مقابل 100 مل من المخزن المؤقت لمدة 2 ساعة على الأقل في كل جولة. وللاطلاع على بروتوكول مفصل، يرجى الرجوع إلى Budisa et al.34.
    4. قم بإعداد تخفيف 1:100 أضعاف لجزء الإزالة الدياليزد في المخزن المؤقت PBS (انظر المواد التكميلية).
    5. سجل طيف الامتصاص للعينات المخففة في مقياس الطيف الضوئي UV-Vis.
    6. احسب تركيز البروتين استنادا إلى قانون لامبرت-بير على النحو التالي، باستخدام قيم الأدبيات لمعاملات الانقراض المولي ε عند طول موجي محدد (ل EGFP عند 488 نانومتر ε488 = 55000 سم-1· M-1 ، NowGFP عند 493 نانومتر ε493 = 53,600 سم-1· M-1 ، KillerOrange عند 514 نانومتر ε514 = 22,600 cm-1· م-1):
      figure-protocol-12960 (قانون لامبرت بير)
      ج البروتين = تركيزالبروتين [ملغم/مل]
      A = الامتصاص عند طول موجي محدد
      ε = معامل الانقراض المولي عند طول موجي محدد [M-1·cm-1]
      d = طول مسار كوفيت ، هنا 1 سم
      MW = الوزن الجزيئي للبروتين [g/mol]
      استخدم المخزن المؤقت لغسيل الكلى (انظر المواد التكميلية) للقياس المرجعي ("صفر").
    7. خذ عينة من "eluate" ل SDS-PAGE (انظر القسم 4 أدناه) ، وقم بتحميل 1-10 ميكروغرام من البروتين (محسوب وفقا للخطوة السابقة) لكل عينة جيدا للمواد الهلامية Coomassie Brilliant الملطخة باللون الأزرق.
      ملاحظة: اضبط كميات عينات SDS اعتمادا على طريقة التلطيخ المطبقة وحساسية الصبغة إذا تم استخدام مركبات مختلفة عن Coomassie Brilliant Blue لتلطيخ نطاق البروتين.
    8. قم بتجميد وتخزين عينة البروتين في مخزن غسيل الكلى المؤقت (انظر المواد التكميلية) عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: في ظل ظروف التخزين هذه، يجب أن تكون عينات البروتين مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل. يمكن استخدام أجهزة قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية UV-Vis والفلورية البديلة لتسجيل أطياف الامتصاص والانبعاثات الفلورية للبروتينات المستهدفة. يمكن تطبيق الأطوال الموجية التالية للإثارة لقياسات الانبعاثات الفلورية: 488 نانومتر (EGFP) ، 493 نانومتر (NowGFP) ، و 510 نانومتر (KillerOrange).

4. إعداد عينة SDS-PAGE

  1. تحديد الامتصاص A عند 280 نانومتر (A280nm) للعينات "eluate" و "lysate" و "pellet" من القسم 3. اضبط حجم المسبار لتحقيق A280nm = 2 عن طريق إضافة كمية مناسبة من المخزن المؤقت للإزالة (يجب أن يكون حجم المسبار النهائي 80 ميكرولتر على الأقل).
  2. امزج العينة بنسبة 4:1 (v/v) مع مخزن مؤقت لصبغة تحميل SDS بمعدل 5x (انظر المواد التكميلية) عن طريق السحب ، على سبيل المثال ، 80 ميكرولتر من العينة مع 20 ميكرولتر من مخزن مؤقت تحميل SDS 5x.
  3. تغلي عينات SDS عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام مائي أو كتلة حرارية لتشويه البروتينات.
  4. اسمح للعينات أن تبرد إلى RT وقم بتدوير المجسات بسرعة 13000 × g لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي دقيق قبل التحميل على الجل.
  5. استخدم 5-10 ميكرولتر ل Coomassie Brilliant SDS-PAGE الملون باللون الأزرق. للحصول على تفاصيل إجراء SDS-PAGE ، راجع57.
    ملاحظة: اضبط كميات عينة SDS اعتمادا على طريقة التلطيخ المطبقة وحساسية الصبغة. يجب فحص نتيجة SDS-PAGE بعناية للتأكد من أن العينات تحتوي على أكثر من 95٪ من إجمالي البروتين في نطاق يتوافق مع الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين المطلوب. لهذا ، التقط صورة للهلام الملطخ ب Coomassie وقارن شدة شريط البروتين للوزن الجزيئي المطلوب مع شدة جميع النطاقات الأخرى في الممر (إن وجدت) بواسطة قياس الكثافة. لتقييم كثافة شدة النطاق ، يمكن استخدام البرنامج ImageJ58. ولإثبات دمج ال NCAAs المطلوبة تجريبيا في البروتين محل الاهتمام، ينبغي إجراء تحليل كتلة البروتين السليم بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) مقترنة بقياس الطيف الكتلي لوقت الطيران بالتأين بالرش الكهربائي (LC-ESI-TOF-MS) على النحو الموصوف59 (انظر قسم البروتوكول 5 وجدول المواد الوارد فيه للحصول على المعدات المثالية).

5. انبعاث التألق من المتغيرات البروتين

  1. قبل الإجراء، تحقق من نتيجة تجربة SDS-PAGE للتأكد من أن نقاء العينة >95٪ (راجع الملاحظة بعد الخطوة 4.5.)
  2. اضبط عينات كل متغير بروتين نقي على تركيز 0.3 ميكرومتر، مع أخذ قيمة الامتصاص المحسوبة عند الطول الموجي المناسب كمرجع (الخطوة الفرعية 3.2.5). تأكد من أن حجم العينة النهائي التقريبي هو 200 ميكرولتر.
  3. دع العينات المخففة تتوازن لمدة 1 ساعة في RT.
  4. انقل العينات إلى كوفيت كوارتز طوله 1 سم وقم بقياس طيف انبعاث التألق للعينات باستخدام مطياف التألق (انظر جدول المواد) بتطبيق الأطوال الموجية للإثارة التالية: 488 نانومتر (ل EGFP) ، 493 نانومتر (ل NowGFP) ، 510 نانومتر (ل KillerOrange).

6. إزالة وإعادة طي متغيرات EGFP

  1. قبل الإجراء، تحقق من نتيجة تجربة SDS-PAGE للتأكد من أن نقاء العينة >95٪ (راجع الملاحظة بعد الخطوة 4.5.)
  2. قم بإعداد عينتين لكل متغير بروتين نقي من الحجم النهائي 2 ميكرولتر بتركيز 300 ميكرومتر (انظر تحديد تركيز البروتين في الخطوات الفرعية 3.2.4-3.2.6).
  3. أضف 18 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS 1.11x (انظر المواد التكميلية) التي تحتوي على 8.89 مليون يوريا و 5.56 ملليمتر DTT إلى 2 ميكرولتر من كل متغير بروتين منقى (للحصول على 1x PBS يحتوي على 8 M يوريا و 5 mM DTT) للحث على تمسخ.
    ملاحظة: بالنسبة للخطوات 6.4-6.6، قم بمعالجة كل عينة على حدة.
  4. احتضان العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
  5. قم بتخفيف العينات 20 ميكرولتر 100 ضعف عن طريق إضافة 1980 ميكرولتر من 1x PBS (انظر المواد التكميلية) التي تحتوي على 5 mM DTT للحث على إعادة التشبع ، مما يؤدي إلى تركيز البروتين النهائي 0.3 μM ونقل 200 ميكرولتر من العينات على الفور إلى كوفيت كوارتز 1 سم.
    ملاحظة: من المهم جدا العمل بسرعة هنا لأن التشبع يبدأ على الفور.
  6. أدخل كوفيت الكوارتز في مطياف التألق المناسب (انظر جدول المواد) وراقب إعادة طي البروتين في العينات عن طريق الحصول على طيف فلوري كل 3 ثوان على مدار 30 دقيقة. لكل متغير بروتين ، استخدم إثارة التألق 295 نانومتر للعينة الأولى وإثارة التألق 488 نانومتر للعينة الثانية.
  7. انقل العينات القابلة لإعادة الطي إلى أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأغلق الغطاء وخزن العينات في RT في الظلام لمدة 24 ساعة للسماح بإعادة الطي الكامل لمتغيرات EGFP.
  8. قم بقياس انبعاث التألق لعينات البروتين المطوية وفقا للخطوة 6.6 باستخدام نفس الطول الموجي للإثارة كما كان من قبل لالتقاط نقطة النهاية الزمنية لاستعادة التألق.

النتائج

في بداية الدراسة ، اخترنا ثلاثة أنواع مختلفة من البروتين الفلوري تشترك في بنية GFP الأم. كان أول بروتين تم اختياره هو EGFP ، وهو متغير هندسي مشتق من GFP الأصلي من قنديل البحر Aequorea victoria الذي يحتوي على طفرات Phe64Leu / Ser65Thr. البروتين الثاني المختار كان NowGFP 51,60. وهو أيضا متغير من A. victoria GFP مشتق من الطفرات في عدة خطوات عبر البروتينات الفلورية السابقة. يحتوي NowGFP على 18 طفرة مقارنة بسابقه المباشر بروتين الفلورسنت "Cerulean"61. في المقابل ، فإن بروتين "Cerulean" هو مشتق من بروتين الفلورسنت السماوي المحسن (ECFP) 62,63 ، وهو بروتين تم اختياره مسبقا بواسطة التطور المختبري الموجه ويحتوي على كروموفور قائم على التربتوفان. يستخدم كلاهما EGFP و NowGFP على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية والدراسات الفيزيائية الحيوية ، ويحتويان على عشرة بقايا برولين محفوظة في هياكلهما. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي NowGFP على بقايا البرولين الحادية عشرة في الموضع 230 ، والتي ظهرت بسبب تاريخ الطفرة الواسع لهذا المتغير البروتيني. البروتين الثالث الذي تم اختياره هو بروتين الفلورسنت KillerOrange64,65. وهو مشتق من كروموبروتين anm2CP من جنس الهيدروزوان Anthoathecata. يحتوي تسلسل البروتين على 15 بقايا برولين ، ويعتمد الكروموفور على التربتوفان بدلا من بقايا التيروزين. تم الإبلاغ عن هياكل الأشعة السينية عالية الدقة لجميع البروتينات الثلاثة المختارة (الشكل 2)51,65,66.

في الخطوة الأولى ، تم دمج نظائر البرولين (الشكل 1D) في جميع مواضع البرولين لثلاثة بروتينات نموذجية (EGFP و NowGFP و KillerOrange) عن طريق دمج الضغط الانتقائي (SPI ، يتم إعطاء مخطط للإجراء في الشكل 3). ومن الناحية الأدائية، استخدمت سلالة الإشريكية القولونية K12 JM8367 للتعبير عن البروتينات في وجود البرولين والنظير (الشكل 1D)، مما أسفر عن بروتينات من النوع البري والمعدلة، على التوالي. كان للكريات من الخلايا التي تعبر عن البروتين الأصلي والمتغيرات التي تحمل S-Flp و Dhp اللون المشرق النموذجي بسبب الكروموفور السليم ، في حين ظلت المتغيرات التي تحتوي على R-Flp و Dfp عديمة اللون ، مما يشير إلى سوء الطي وترسب البروتين غير المطوي في أجسام التضمين (الشكل 4A). وتحقق تحليل SDS-PAGE للعينات المعبر عنها من وجود بروتينات غير قابلة للذوبان تحتوي على R-Flp (الشكل 4B-D)، مما حال دون إجراء مزيد من التحقيقات. على الرغم من أن هذا خارج نطاق هذه الدراسة ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تخفيف مشاكل ذوبان البروتين وسوء الطي إلى حد ما من خلال إجراءات إعادة الطي في المختبر 68. في المقابل ، تم العثور على البروتينات الأصلية وكذلك المتغيرات الحاملة ل S-Flp و Dhp بشكل رئيسي في الكسور القابلة للذوبان (الشكل 4B-D). يمكن عزل النوع البري ، وكذلك المتغيرات التي تحتوي على S-Flp و Dhp ، ووصفها في دراسات التألق. تم تنقية البروتينات القابلة للذوبان بواسطة كروماتوغرافيا تقارب أيون المعادن المجمدة (IMAC) ، مما أدى إلى إنتاج 20-30 مجم / لتر من حجم المستنبت ل EGFP ، و 60-80 mg ل NowGFP و KillerOrange ، التي كانت غلتها للبروتينات البرية والمعدلة متشابهة للغاية. وأكد التحليل المقترن بالكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي (LC-MS) الهوية والنقاء المتوقعين للعزلات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة (الشكل 5). في الأطياف الكتلية، أنتج كل استبدال برولين مع S-Flp إزاحة +18 Da لكل بقايا برولين في التسلسل، بينما بالنسبة لاستبدال البرولين إلى Dhp، كان التحول -2 Da لكل بقايا.

في الخطوة التالية ، تم تسجيل أطياف امتصاص الضوء والانبعاثات لتحليل الآثار المحتملة لدمج نظائر البرولين غير القانونية على الخصائص الطيفية للبروتينات الفلورية الأم (الشكل 6). أظهرت أطياف امتصاص UV-Vis نطاقا نموذجيا يبلغ حوالي 280 نانومتر مميزا للمخلفات العطرية والتيروزين والتريبتوفان ، في حين تم العثور على امتصاص الكروموفور عند 488 نانومتر ل EGFP ، و 493 نانومتر ل NowGFP (الشكل 6A ، B). في KillerOrange ، كانت منطقة امتصاص الكروموفور تتألف من نطاقين (الشكل 6C) ، والتي تتوافق مع حالتين تكوينيتين وشحنتين محتملتين للكروموفور المعقد. يعرف النطاق حول 510 نانومتر بالحالة التي يحدث منها التألق مع إنتاجية كمية عالية49,65. في متغيرات استبدال البرولين ، لوحظ ما يلي: لم يغير دمج Dhp أطياف الامتصاص ل EGFP و NowGFP ، في حين أن S-Flp أنتج امتصاصا معززا للأشعة فوق البنفسجية. ويمكن تفسير هذا الأخير من خلال الاختلافات المستحثة في البيئات الدقيقة المتبقية من التربتوفان، ولا سيما Trp57 المحصورة بين ثلاثة S-Flp في شكل PVPWP (الشكل 6A، B)69. ومع ذلك ، قد ينبع تفسير أكثر تافهة لامتصاص أعلى للأشعة فوق البنفسجية من زيادة جزء من البروتين المطوي بشكل غير صحيح. نظرا لأن تركيز البروتين تم تقييمه عن طريق التحديد الكمي لميزات الامتصاص ، فإن وجود بروتين يحتوي على كروموفور ناضج بشكل غير صحيح يمكن أن يزيد من الامتصاص ، في حين لا يتم حساب هذا الجزء في التركيز الكلي (الشكل 6A ، B). ودعما لهذه الفرضية، لاحظنا أن EGFP المحتوي على S-Flp أظهر انخفاضا ملحوظا في نسبة الكروموفور مقابل التربتوفان المشترك وامتصاص التيروزين (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0.96) مقارنة بقيمة أعلى (1.57) في البروتين الأم (الجدول 2)70. سيكون وجود جزء غير فلورسنت في EGFP المحتوي على S-Flp عاملا مساهما مهما في مزيد من التحليل لخصائص البروتين. في متغير KillerOrange الذي يحتوي على S-Flp ، لوحظ امتصاص معزز إلى جانب انزياح أحمر في نطاق الكروموفور. أشارت هذه الحقيقة إلى أن تكوين الكروموفور يفضل التكوين ذو العائد الكمومي الفلوري الكبير (الشكل 6C).

في وقت لاحق ، قمنا بتحليل أطياف التألق للبروتينات المسجلة عند الإثارة عند الأطوال الموجية القصوى للامتصاص المقابلة. أظهرت النتائج أن الأطياف ظلت متطابقة بشكل أساسي لمتغيرات البروتين الفلوري التي تم فحصها والتي تحمل البرولين والبدائل ، S-Flp و Dhp. تشير هذه النتيجة إلى أن النظير لم يغير البيئة الكيميائية للكروموفور على أي حال (الشكل 6G-I). على الرغم من هذه الحقيقة ، شوهدت اختلافات ملحوظة في أطياف التألق من KillerOrange المسجلة عند الإثارة عند 295 نانومتر ، وبالتالي على إثارة التربتوفان. تتعقب هذه التجربة نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) أو الاقتران المثير المباشر الذي يحدث بين السلاسل الجانبية للتريبتوفان والكروموفور الناضج حيث يقع كلاهما على مسافة قصيرة لا تزيد عن 25 Å. بالنسبة لمتغيرات EGFP و NowGFP ، عندما تم قياس أطياف الانبعاثات باستخدام إثارة 295 نانومتر ، لوحظ انبعاث كروموفور قوي إلى جانب بالكاد أي انبعاث تريبتوفان (الشكل 6D ، E). ومع ذلك ، أظهرت المتغيرات التي تحتوي على S-Flp انبعاثا أكبر قليلا خاصا بالتريبتوفان. يمكن ربط هذه الملاحظة بمساهمة غير محسوبة من البروتين المرتفع الذي تم الكشف عنه والذي يحتوي على التربتوفان ولكن ليس الكروموفور الناضج. شوهدت زيادة كبيرة في الانبعاثات الخاصة بالتريبتوفان في KillerOrange ، مما يشير إلى عدم وجود تبريد فلوري عبر الآلية المتوقعة لنقل طاقة الإثارة أو الاقتران المثير. أظهرت متغيرات البروتين التي تحتوي على البرولين و S-Flp انبعاثا مماثلا للتريبتوفان إلى جانب ميزة التألق الأحمر المفضلة ذات العائد الكمومي العالي. في المقابل ، أظهر المتغير الذي يحتوي على Dhp انخفاضا حادا في كثافة تألق الكروموفور ، على الأرجح بسبب التأثيرات الهيكلية الطفيفة (الشكل 6F).

بعد ذلك ، قارنا خصائص الطي للبروتينات من خلال إجراء تجربة تكشف / إعادة التشبع. وسجلت أطياف الانبعاثات الفلورية في الحالة المطوية (القسم 5 من البروتوكول)، وبعد تمسخ المواد الكيميائية، وبعد ذلك، في عملية إعادة الطي التي رصدت على مدى 24 ساعة (القسم 6 من البروتوكول). تم تسجيل الأطياف عند الإثارة عند كل من الأطوال الموجية ذات الصلة ، 295 نانومتر ، وعند الحد الأقصى لأطياف امتصاص الكروموفورات ، في حين يتم تقديم التألق الناتج على أنه طبيعي إلى القيمة القصوى لكل بروتين (الشكل 7). في نهاية البروتوكول ، لاحظنا أن متغيرات EGFP يمكن أن تتكرر ، في حين أن متغيرات NowGFP و KillerOrange - بمجرد تشويهها - ظلت مكشوفة (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، فإن قدرات إعادة الطي للبروتينات الفلورية الأصلية تختلف اختلافا كبيرا. تجدر الإشارة إلى أن KillerOrange قد تم تطويره كمحسس للضوء بدءا من متغير بروتين الكروموبروتين الهيدروزواني KillerRed65,71 ، وعادة ما تتخلف إعادة طيه على الرغم من بنية β البرميل القوية. في تجاربنا ، وجدنا أن تألق كروموفور EGFP من النوع البري تعافى جزئيا فقط ، على الرغم من أن التألق الخاص بالتريبتوفان كان أكبر بعد التشبع (الشكل 7A ، D). لوحظ سلوك مماثل بشكل أساسي في المتغير الذي يحتوي على Dhp (الشكل 7C ، F). في EGFP المحتوي على S-Flp ، لوحظت نتيجة مماثلة عندما تم إجراء الإثارة عند الطول الموجي الخاص بالتريبتوفان البالغ 295 نانومتر (الشكل 7B). ومن اللافت للنظر أن التألق تعافى إلى امتداد أعلى بكثير عندما كان الكروموفور متحمسا عند 488 نانومتر (الشكل 7E). يبدو أن S-Flp يحفز عائدا أفضل بكثير من إعادة الطي مقارنة بالخيارين الآخرين. ومع ذلك ، لم يلاحظ هذا التأثير المفيد عند استخدام إثارة 295 نانومتر بسبب التفاعلات الجزيئية غير المعروفة.

في وقت لاحق ، تم رصد سرعة إعادة الطي عن طريق تسجيل التألق لكل من التربتوفان ، والكروموفور ، بشكل منفصل ، في حين تم تحديد نقطة نهاية العملية في 24 ساعة بعد بدء إعادة التشبع. فقط متغيرات EGFP أظهرت حركية سريعة الطي نسبيا يمكن تقييمها بشكل موثوق ، في حين لم يتمكن أي من متغيرات NowGFP و KillerOrange المشوهة من التعافي إلى قيمة مكنت من إجراء المزيد من القياسات الكمية. في EGFP ، كان استرداد انبعاثات التربتوفان أسرع مرتين (اكتمل في 750 ثانية) مقارنة باستعادة انبعاثات الكروموفور (اكتمل في 1500 ثانية) ، مما يشير إلى تعقيد العمليات الأساسية (الشكل 8). في كل من الأطوال الموجية للإثارة ، تم رفع معدل إعادة الطي من خلال وجود S-Flp ، بالاتفاق مع بيانات الأدبيات25. في الوقت نفسه ، أظهر المتغير الذي يحتوي على Dhp ملفا قابلا للطي مشابها للنوع البري.

figure-results-10357
الشكل 1: سقالة هيكلية لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، وبناء الكروموفور ، والتحولات التوافقية للبرولين ، والنظير الاصطناعي المستخدم في هذه الدراسة. (أ ) يتكون هيكل GFP من خيوط β تشكل برميلا مثاليا تقريبا (أي "علبة" بأبعاد 4.2 نانومتر × 2.4 نانومتر) مغطاة من كلا الطرفين بأغطية حلزونية α. يظهر بروتين GFP 27 kDa بنية ثلاثية تتكون من أحد عشر خيطا β ، واثنين من الحلزونات α القصيرة ، والكروموفور في المنتصف. ترتبط الحالات التوافقية للبرولينات المجاورة بتكوين الكروموفور. (ب ) يحدث النضج (التكثيف) الذاتي للكروموفور في بقايا Ser65 و Tyr66 و Gly67 ، ويستمر في عدة خطوات: أولا ، التعديلات الالتوائية في العمود الفقري متعدد الببتيد لجعل كربون الكربوكسيل من Thr65 بالقرب من نيتروجين الأميد في Gly67. ثم ، يحدث تكوين نظام حلقة إيميدازولين -5-one غير متجانس الحلقات عند الهجوم النووي على ذرة الكربون هذه بواسطة نيتروجين أميد الجلايسين والجفاف اللاحق. وأخيرا ، يكتسب النظام تألقا مرئيا عندما تؤدي أكسدة رابطة الكربون التيروزين ألفا بيتا بواسطة الأكسجين الجزيئي إلى تمديد النظام المترافق لنظام حلقة إيميدازولين ، في النهاية بما في ذلك حلقة فينيل التيروزين وبديلها شبه الأكسجين. يتم فصل كروموفور بارا هيدروكسي بنزيلدين إيميدازولينون الناتج في وسط برميل β تماما عن المذيب السائب. (ج ) تمثل صيغ الهيكل العظمي وهندسته 1) حلقة البرولين (اللفائف) و 2) رابطة الأميد السابقة التحولات التوافقية الرئيسية لبقايا البرولين. (د) نظائر البرولين المستخدمة في هذا العمل مع النتوءات الحلقية المعينة بالبرولين. تم إنشاء الرقم باستخدام ChemDraw و Discovery Studio Visualizer. هيكل GFP هو من إدخال هيكل PDB 2Q6P. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-12231
الشكل 2: البروتينات الفلورية المستخدمة في هذه الدراسة. تعرض اللوحات تمثيل الشريط للهياكل النموذجية β البرميل لثلاثة أنواع مختلفة من البروتينات الفلورية: EGFP و NowGFP و KillerOrange ، مع لون الشريط الذي يمثل لون انبعاث التألق لكل متغير. يتم تمييز بقايا البرولين (رمز مكون من حرف واحد) كعصي ، ويتم شرح المواضع المناسبة. تظهر الكروموفور مع تكوين الأحماض الأمينية الأولية بالخط العريض. تم إنتاج جميع تمثيلات الهيكل باستخدام PyMol استنادا إلى إدخالات هيكل PDB التالية: 2Q6P ل EGFP ، 4RYS ل NowGFP ، 4ZFS ل KillerOrange. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-13088
الشكل 3: عرض مخطط انسيابي لطريقة SPI لدمج نظائر البرولين غير القانونية الخاصة بالبقايا. تزرع سلالة مضيفة من الإشريكية القولونية (E. coli) تحمل الجين محل الاهتمام على بلازميد التعبير في وسط الحد الأدنى المحدد مع جميع الأحماض الأمينية الأساسية 20 حتى يتم الوصول إلى OD600 من ~ 0.7 حيث تكون مزرعة الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط. يتم حصاد الخلايا ونقلها إلى وسط صغير طازج يحتوي على 19 حمضا أمينيا أساسيا وتناظرية برولين. بعد إضافة محفز ، يتم إجراء التعبير عن البروتين بين عشية وضحاها. وأخيرا ، يتم عزل البروتين المستهدف عن طريق تحلل الخلايا وتنقيته قبل إجراء مزيد من التحليل. في شكل مختلف من البروتوكول ، تزرع الخلايا في وسط الحد الأدنى المحدد مع 19 حمضا أمينيا أساسيا ، ويضاف البرولين بكمية محدودة (على سبيل المثال ، خمس تركيز الأحماض الأمينية الأخرى). من خلال هذا المقياس ، تستنفد الخلايا البرولين في الوسط قبل أن تتمكن من الخروج من مرحلة النمو اللوغاريتمي ، وبعد ذلك ، يتم إضافة التناظرية ، ويتم تحفيز إنتاج البروتين محل الاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-14400
الشكل 4: تحليل التعبير لمتغيرات EGFP و NowGFP و KillerOrange. (أ) كريات الخلايا من 1 مل من ثقافة التعبير ، وتطبيعها إلى OD600 = 2. تحليل صفحة SDS للمتغيرات ( B ) EGFP ، ( C ) NowGFP ، و (D) KillerOrange. تم تحميل الكسور القابلة للذوبان (S) وغير القابلة للذوبان (I) من كل مشتق بروتين فلورسنت على هلام أكريلاميد بنسبة 15٪ ، بالإضافة إلى كسور مستنفدة (E) من IMAC من البروتينات القابلة للذوبان. تم استخدام سلم البروتين غير الملون PageRuler كعلامة (M) في الممرات المشار إليها ب (M). يتم تأطير المناطق المتوقعة من البروتين المعين. الأحماض الأمينية المدمجة في مواضع البرولين هي Pro و R-Flp و S-Flp و Dhp (في (A) كريات الخلايا من متغيرات البروتين الفلورسنت التي تتضمن Dfp بدلا من Dhp). كانت المواد الهلامية ملطخة بنسبة 1٪ (ث / v) Coomassie Brillant Blue. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-15567
الشكل 5: التحليل الطيفي الكتلي لمتغيرات البروتين الفلورسنت. (أ) تمثيل أطياف ESI-MS غير المعقدة من H 6-الموسومة EGFP (أسود) و S-Flp-EGFP (برتقالي) و Dhp-EGFP (سماوي) مع موقع قمم الكتلة الرئيسية المقدمة كأرقام (في Da). الكتل الجزيئية المحسوبة [M+H]+ للبروتينات H6-tagged هي: بالنسبة ل EGFP 27,745.33 Da (لوحظ 27,746,15 Da)؛ وبالنسبة ل EGFP 27,745.33 Da (لوحظ 27,746,15 Da)؛ وبالنسبة ل EGFP 27,745.33 Da (لوحظ 27,746,15 Da)؛ وبالنسبة ل EGFP 27,745.33 Da (لوحظ 27,746,15 Da)؛ وبالنسبة ل EGFP 27 ل S-Flp-EGFP 27,925.33 Da (لوحظ 27,925.73 Da) ؛ ل Dhp-EGFP 27,725.33 Da (لوحظ 27,726.01 Da). (ب) تمثيل أطياف ESI-MS غير المعقدة من H 6-الموسومة NowGFP (أسود) و S-Flp-NowGFP (برتقالي) و Dhp-NowGFP (سماوي) مع موقع قمم الكتلة الرئيسية المقدمة كأرقام (في Da). الكتل المحسوبة للبروتينات H6-tagged هي: بالنسبة ل NowGFP 27,931.50 Da (لوحظ 27,946.46 Da ؛ الفرق ~ 16 Da ربما يرجع إلى أكسدة الميثيونين في البروتين) ؛ ل S-Flp-NowGFP 28,129.50 Da (لوحظ 28,130.08 Da) ؛ ل Dhp-NowGFP 27,909.50 Da (لوحظ 27,910.22 Da). (ج) تمثيل أطياف ESI-MS غير المعقدة من H 6-KillerOrange (أسود) و S-Flp-KillerOrange (برتقالي) و Dhp-KillerOrange (سماوي) مع موقع قمم الكتلة الرئيسية المقدمة كأرقام (في Da). الكتل المحسوبة للبروتينات H6-tagged هي: بالنسبة ل KillerOrange 27,606.09 Da (لوحظ 27,605.91 Da) ؛ ل S-Flp-KillerOrange 27,876.09 Da (لوحظ 27,876.08 Da) ؛ ل Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da (لوحظ 27,575.93 Da). تقع الانحرافات بين الكتل الجزيئية المرصودة والمحسوبة لحوالي 1 Da ضمن نطاق الخطأ لمعدات ESI-MS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-17488
الشكل 6: أطياف امتصاص الضوء وانبعاث التألق لمتغيرات البروتين الفلورسنت. تظهر أطياف امتصاص UV-Vis الطبيعية للمتغيرات (A) من EGFP و (B) من NowGFP و (C) من KillerOrange. تم تطبيع الأطياف إلى أقصى حد من امتصاص الكروموفور (حوالي 500 نانومتر). تظهر أطياف الانبعاثات الفلورية الطبيعية للمتغيرات (D ، G) من EGFP ، (E ، H) من NowGFP ، و (F ، I) من KillerOrange. تم قياس الأطياف في (D ، E ، F) عند الإثارة بالأشعة فوق البنفسجية (295 نانومتر) ، بالنسبة للأطياف في (G ، H ، I) تم استخدام 488 نانومتر و 493 نانومتر و 510 نانومتر للإثارة ، على التوالي ، وتم تطبيع الأطياف إلى الحد الأقصى المعني من انبعاثات الكروموفور (حوالي 500 نانومتر). في كل لوحة ، تتوافق المنحنيات السوداء مع أطياف متغير البروتين الفلوري مع البرولين الأصلي ، وتشير المنحنيات البرتقالية إلى أطياف البروتينات البديلة ل S-Flp ، وتتوافق المنحنيات الزرقاء مع البروتينات البديلة ل Dhp. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-18803
الشكل 7: أطياف الانبعاثات الفلورية لمتغيرات EGFP في تجارب إعادة الطي. أطياف انبعاث الفلور الطبيعية من محاليل 0.3 ميكرومتر لمتغيرات البروتين الفلورسنت في الحالة الأصلية وبعد تمسخ وإعادة الطوي: تم قياس الأطياف في (A ، B ، C) عند الإثارة بالأشعة فوق البنفسجية (295 نانومتر) (A) ل EGFP ، (B) ل S-Flp-EGFP ، و (C) ل Dhp-EGFP. تم قياس الأطياف في (D، E، F) عند الإثارة بالضوء الأخضر (488 نانومتر) (D) ل EFGP، (E) ل S-Flp-EGFP، و (F) ل Dhp-EGFP. يتم تطبيع أطياف الانبعاثات الأصلية (المنحنيات السوداء) والعينات المعاد طيها (الأخضر يتوافق مع EGFP والبرتقالي إلى S-Flp-EGFP والأزرق إلى Dhp-EGFP ، على التوالي) لكل متغير بروتين إلى أقصى قدر من التألق في الحالة الأصلية المناسبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-19949
الشكل 8: رصد طي البروتين ونضج الكروموفور لمتغيرات EGFP مع التألق. (أ ) انبعاث التألق في منطقة التألق Trp (تم ضبط الانبعاث على 330 نانومتر) المسجل عند الإثارة بالأشعة فوق البنفسجية (295 نانومتر). (ب) تطور سعة التألق في منطقة انبعاث الكروموفور عند الإثارة بضوء أخضر (488 نانومتر). تم تطبيع آثار التألق المعتمدة على الوقت إلى الوحدة (100٪) وفقا لسعة التألق التي تم الوصول إليها في نهاية فترة الرصد. في كل لوحة ، تتوافق المنحنيات السوداء مع أطياف متغير البروتين الفلوري مع البرولين الأصلي ، وتشير المنحنيات البرتقالية إلى أطياف البروتينات البديلة ل S-Flp والمنحنيات الزرقاء تتوافق مع البروتينات البديلة ل Dhp. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بناءتسلسل الأحماض الأمينية (6xHis العلامة تحتها):
EGFP-H6MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHHHH
H6-NowGFPMRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-القاتل البرتقاليMRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

الجدول 1: الهياكل الأولية للبروتينات المستهدفة. يتم تسطير علاماته في كل تسلسل.

λ [نانومتر]ε [M-1·cm-1] (EGFP)ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)31,657 (± 1,341)22,950 (± 290)27,800 (± 542)
280 (≡ صور + Trp)20,116 (± 172)23,800 (± 715)17,300 (± 554)
يتم حساب قيم معامل الانقراض ε (في M-1·cm-1) من أطياف امتصاص UV-Vis المسجلة لمتغيرات EGFP المناسبة باستخدام تركيزات البروتين المعروفة. الطول الموجي المحدد عند 280 نانومتر يتوافق مع الحد الأقصى لامتصاص المخلفات العطرية والتيروزين والتريبتوفان ، ويمثل 488 نانومتر الطول الموجي لامتصاص الكروموفور.

الجدول 2: معاملات الانقراض (ε) لمتغيرات EGFP عند أطوال موجية مختارة. يتم حساب قيم معامل الانقراض ε (في M-1·cm-1) من أطياف امتصاص UV-Vis المسجلة لمتغيرات EGFP المناسبة باستخدام تركيزات البروتين المعروفة. يتوافق الطول الموجي المحدد البالغ 280 نانومتر مع الحد الأقصى لامتصاص المخلفات العطرية والتيروزين والتريبتوفان ، في حين يمثل 488 نانومتر الحد الأقصى للطول الموجي لامتصاص الكروموفور.

المواد التكميلية: إعداد حلول المخزون والمخازن المؤقتة يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

في الطبيعة ، تحدث التلاعب بهياكل البروتين ووظائفه عادة بسبب الطفرات ، وهي الظاهرة التي تؤدي إلى تبادل هوية الأحماض الأمينية في مواقع معينة في تسلسل البروتين. يتم تطبيق هذه الآلية الطبيعية على نطاق واسع كطريقة للتكنولوجيا الحيوية لهندسة البروتين في شكل طفرات ، وتعتمد على ذخيرة الأحماض الأمينية الأساسية 20 المشاركة في العملية. بيد أن تبادل مخلفات البرولين يمثل إشكالية. نظرا لبنية المجموعة الأساسية الخاصة بها ، فهي بالكاد قابلة للتبديل مع البقايا ال 19 المتبقية لاستبدال72. على سبيل المثال ، يعرف البرولين عادة باسم قاطع البنية الثانوي في تسلسلات polypeptide بسبب سوء توافقه مع الهياكل الثانوية الأكثر شيوعا ، أي α-helix و β-strand. يتم فقدان ميزة البرولين هذه بسهولة عندما يتم تحور البقايا إلى حمض أميني آخر من الذخيرة الشائعة. يوفر استبدال البرولين بنظائره الكيميائية نهجا بديلا ، والذي يمكن من الحفاظ على ميزات العمود الفقري الأساسية لبقايا البرولين الأم مع فرض التحيز على انتقالاته التشكيلية المحددة أو إنتاج تعديلات للحجم الجزيئي والقطبية. على سبيل المثال ، من الممكن تزويد الثقافات البكتيرية بهياكل تناظرية مثل الهيدروكسي ، الفلورو ، الألكيل ، ديهيدروبرولين ، الهياكل ذات أحجام الحلقات المتغيرة وأكثر من ذلك ، مما يسهل إنتاج بروتين يحتوي على تغييرات محددة في بقايا البرولين.

تسمح طريقة دمج الضغط الانتقائي (SPI) الموصوفة في هذه الدراسة باستبدال عالمي ، أي بديل خاص بالبقايا لجميع البرولينات في البروتين المستهدف بنظائرها الكيميائية ذات الصلة. تنعكس أهمية الطريقة من خلال حقيقة أن SPI يسمح بإنشاء تغييرات تسلسل لا يمكن الوصول إليها من قبل تقنيات الطفرات الشائعة. على سبيل المثال ، يسمح بإنتاج بروتين مستهدف يحتوي على تغييرات هيكلية صغيرة إلى حد ما قد لا تتجاوز عادة واحدة أو اثنتين من عمليات استبدال / حذف / إضافة الذرة ، كما هو موضح في هذه الدراسة. ويطلق على هذه التعديلات البروتينية اسم "الطفرات الذرية"73,74. في بروتين الفلورسنت مثل GFP ، يمكن رؤية نتيجة هذا الاختراق الجزيئي في سرعة الطي ، والقطبية المحلية ، وتعبئة البروتين ، واستقرار السمات الهيكلية المعنية. يتم إنتاج التغيرات في خصائص الامتصاص والتألق بشكل غير مباشر بسبب التأثير على طي البروتين والبيئات الدقيقة المتبقية. عادة ما تكون دقة التغيرات الجزيئية التي يقوم بها SPI أعلى بكثير ، مقارنة بطفرات البرولين إلى المخلفات الأساسية الأخرى ، وعادة ما تكون الأخيرة ضارة بطي البروتين وإنتاجه وعزله.

كطريقة إنتاج ، يستخدم نهج SPI تحمل الركيزة لجيب سينثيتاز aminoacyl-tRNA نحو النظائر الكيميائية للحمض الأميني الأصلي. ال synthetase هو المسؤول عن التحديد الصحيح لبنية الأحماض الأمينية ، في حين أن الاندماج في البروتينات يحدث في اتجاه مجرى النهر في عملية الترجمة. من الناحية الأداتية ، يتم تنفيذ إنتاج البروتين وعزله وتنقيته في SPI بطريقة نموذجية لأي تقنيات أخرى للتعبير عن البروتين المؤتلف. ومع ذلك ، مع بعض الإضافات إلى البروتوكول على النحو التالي: يتم توفير البرولين ، الذي لا بد من استبداله ، في بداية عملية التخمير ، بحيث يمكن للخلايا أن تنمو وتطور آلاتها الخلوية السليمة. ومع ذلك ، لا يسمح لمزرعة الخلايا بالوصول إلى أقصى كثافة بصرية ، للحفاظ على الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية المثلى للتعبير عن البروتين. هناك نوعان من الاختلافات الرئيسية لطريقة SPI في هذه المرحلة. في الأول ، يتم ضبط تركيز البرولين في وسط النمو الأولي (وسط محدد كيميائيا) بحيث يحدث استنفاد البرولين دون أي تدخل خارجي. تستنفد الخلايا البرولين في الوسط قبل أن تتمكن من الخروج من مرحلة النمو اللوغاريتمي ، وبعد ذلك ، يتم إضافة التناظرية ، ويتم تحفيز إنتاج البروتين محل الاهتمام. في الإصدار الثاني من الطريقة ، تزرع الخلايا في الوسط الذي يحتوي على البرولين حتى منتصف مرحلتها اللوغاريتمية. في هذه المرحلة ، يجب إخراج الخلايا ونقلها جسديا إلى وسط آخر ، لم يعد يحتوي على البرولين ، فقط التناظرية ، مع تحريض لاحق للبروتين محل الاهتمام. في كلا الإصدارين ، يتم توفير كاشف تحريض البروتين والتناظري للخلايا المزروعة مسبقا. يتم إجراء عزل وتنقية البروتين من النوع البري بنفس الطريقة التي يتم بها إجراء المتغيرات. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام كل سلالة Pro-auxotrophic المتاحة كمضيف تعبير. ومع ذلك ، ينصح بإجراء اختبارات التعبير لتحديد المضيف الأنسب. أيضا ، يمكن استخدام اختبارات الوسائط المختلفة المحددة كيميائيا لتحسين إنتاج البروتين.

هناك متطلبات معينة فيما يتعلق بالنظيرات الكيميائية التي يجب مراعاتها ل SPI ، مثل الذوبان والتركيز. يعتمد التوافر الأيضي وامتصاص الأحماض الأمينية على عدد الجزيئات الذائبة في الوسط. لزيادة قابلية ذوبان مركب معين ، يمكن اختيار الظروف الحمضية أو القلوية قليلا. نظرا لأن الجزيئات الاصطناعية يمكن أن تسبب تأثيرات مثبطة للنمو بسبب سميتها الخلوية ، فيجب خفض التركيز إلى الحد الأدنى لتجنب إجهاد الخلايا75.

نقطة ضعف طفيفة في SPI هي انخفاض كفاءة التأسيس مع أعداد أكبر من المواقف التي تحتاج إلى تبادل. من حيث المبدأ ، يمكن أن يؤدي تقليل تردد الأحماض الأمينية داخل الجزيء الحيوي المستهدف عن طريق الطفرات الموجهة إلى الموقع إلى حل هذه المشكلة. ومع ذلك ، قد تتأثر الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتين المطلوب بتغيير البنية الأولية.

كما ذكرنا من قبل ، يسمح SPI باستبدال الأحماض الأمينية الأساسية الخاصة بالبقايا. وهذا يعني أنه يتم إدخال الأحماض الأمينية غير الأساسية في كل موضع من الحمض الأميني الأساسي داخل البروتين المستهدف ، بما في ذلك المخلفات المحفوظة التي لا غنى عنها لوظيفة البروتين أو الطي. الطرق البديلة للتأسيس الخاص بالموقع هي الإمكانية الوحيدة للتغلب على هذه المشكلة3. في العقود القليلة الماضية ، تم تطوير طريقة الزوج المتعامد التي يمكن أن تنتج بروتينات تحتوي على بقايا معدلة في مواقع محددة مسبقا. يعرف التعديل الأكثر شيوعا لهذه الطريقة باسم قمع الكودون التوقفي. تعتمد هذه الطريقة على نظام ترجمة متعامد هندسي مخصص لدمج الأحماض الأمينية الاصطناعية76 في موقع محدد. تم دمج أكثر من 200 حمض أميني مع تعديلات مختلفة في السلسلة الجانبية في البروتينات حتى الآن باستخدام هذا النهج77. ومع ذلك ، لا تزال أنظمة الترجمة هذه غير مناسبة لإدخال نظائر البرولين في البروتينات المستهدفة. علاوة على ذلك ، يعتبر أداء الطريقة منخفضا في حالة التعديلات الطفيفة على الأحماض الأمينية لأن بعض الاختلاط في الخلفية لسينثيتاز أمينواسيل-tRNA يبقى عادة في أنظمة الترجمة الهندسية.

باستخدام SPI ، أنتجنا عددا من متغيرات البروتين الفلوري β برميل ودرسنا نتائج تبادل البرولين مع نظائره غير الطبيعية. في حالة استبدال البرولين ب R-Flp و Dfp ، تم إنتاج بروتين مختل وظيفيا بواسطة مضيف التعبير. من المحتمل أن ينتج التأثير عن طريق سوء طي البروتين. قد ينشأ هذا الأخير من تشكيل C 4-exo الذي تروج له R-Flp ، والذي لا تفضله هياكل البروتين الأم27. مع Dfp ، من المرجح أن ينتج سوء الطي عن طريق السرعة المتناقصة لأيزومرات رابطة الببتيد عبر رابطة الدول المستقلة عند بقايا البرولين27. ومن المعروف أن هذا الأخير هو من بين الخطوات المحددة في المظهر الحركي للبروتين القابل للطي الذي يؤثر على تكوين برميل β ونضج الكروموفور اللاحق. في الواقع ، بالنسبة لكل من الأحماض الأمينية ، R-Flp و Dfp ، أدى إنتاج البروتين إلى بروتين مجمع وغير قابل للذوبان. وبالتالي ، لا يمكن أن يحدث تكوين الكروموفور ، وتم فقدان التألق بالكامل. ومع ذلك ، مع S-Flp و Dhp ، لوحظ نضج البروتين المناسب ، مما أدى إلى عينات بروتين الفلورسنت لكل تركيبة تناظرية / بروتينية. على الرغم من بعض التعديلات في ميزات الامتصاص والتألق للبروتين ، إلا أنها ظلت مشابهة إلى حد كبير لتلك الموجودة في البروتينات البرية. تم الكشف عن تأثير استبدال الأحماض الأمينية في دراسات الحركية القابلة للطي. وقد أظهرت دراسات نموذج S-Flp أن هذه البقايا قد تولد بعض التحسن في سرعة دوران الأميد العابر إلى رابطة الدول المستقلة وتؤدي إلى تكوين التشكيل C4-endo. ومن المرجح أن يسهم هذان العاملان في الآثار الحركية المفيدة لهذه البقايا في EGFP. في المقابل ، أنتجت Dhp ملامح قابلة للطي حركية تشبه إلى حد كبير البروتين الأم. يوضح تنوع النتائج الناتجة عن مجرد طفرات ذرية في بروتينات الفلورسنت التي تم فحصها إمكانات طريقة إنتاج SPI في تغيير خصائص البروتين المستهدفة. إن تغيرات البروتين الناجمة عن استبدال البرولين مع نظائرها لها آثار أخرى في هندسة الإنزيمات78,79,80 والقنوات الأيونية81,82 ، وكذلك في الهندسة العامة لاستقرار البروتين.

القيد الأساسي لطريقة SPI هو وضع "الكل أو لا شيء" في تبادل البرولين الموجود مع النظير ذي الصلة. وسيكون من المفيد جدا أن تكون قادرا على الاختيار بدقة، أي بقايا البرولين ينبغي الاستعاضة عنها بنظائرها، وأيها ينبغي أن يظل دون تعديل. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، لا توجد تقنية يمكنها إجراء مثل هذا الإنتاج المتطور باستخدام مضيف إنتاج ميكروبي. التوليف الكيميائي للبروتينات 83,84 ، وكذلك الإنتاج الخالي من الخلايا 85,86 ، هما الطريقتان البديلتان اللتان يمكنهما إنتاج تعديلات البرولين الخاصة بالموقف. ومع ذلك ، فإن تعقيدها التشغيلي وانخفاض غلة الإنتاج يجعلها أقل شأنا مقارنة بالإنتاج في الخلايا الحية. اعتبارا من الآن ، لا يزال SPI هو النهج الأكثر بساطة وقوة من الناحية التشغيلية لإنتاج البروتينات المعقدة التي تحمل طفرات ذرية. من خلال إدخال بدائل الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، تسمح هذه الطريقة بتعديل ميزات البروتين بطريقة مستهدفة ، كما هو موضح هنا من خلال التغييرات في الطي وامتصاص الضوء / انبعاث البروتينات الفلورية الناتجة عن بدائل البرولين.

Disclosures

يكشف المؤلفون عن جميع وأي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (مجموعة التميز "توحيد الأنظمة في التحفيز") إلى T.F. و N.B. ومن قبل الوزارة الاتحادية للتعليم والعلوم (برنامج BMBF "HSP 2020" ، مشروع TU-WIMIplus SynTUBio) إلى F.-J.S. و T.M.T.T.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileVWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)Carl Roth3029.1
Agar-agarCarl Roth5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
Ammonium peroxydisulphate (APS)Carl Roth9592.2≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
Ampicillin sodium saltCarl RothK029
BiotinSigma-AldrichB4501
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
Coomassie Brillant Blue R 250Carl Roth3862
Copper sulfate (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-glucoseCarl Roth6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT)Carl Roth6908
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)Carl RothP749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)Carl RothX987
DNase ISigma-AldrichD5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)10731181cation exchange resin
EthanolCarl Roth9065.1
Formic acidVWRHiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865LC-MS grade required
Glacial acetic acidCarl Roth3738.5100 %, p. a.
GlycerolCarl Roth3783
ImidazoleCarl RothX998
Hydrogen chlroide (HCl)Merck295426
Iron(II) chloride (FeCl2)Sigma-Aldrich380024
IsopropanolCarl RothAE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI6758
LysozymeSigma-AldrichL6876
Magnesium chloride (MgCl2)Carl RothKK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4)Carl Roth8283.2
Manganese chloride (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.3
PageRuler Unstained Protein LadderThermo Fisher Scientific26614
Potassium chloride (KCl)Carl Roth6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
RNase ACarl Roth7156
Sodium chloride (NaCl)Carl RothP029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl RothT879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
ThiamineSigma-AldrichT4625
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma-AldrichT6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)Carl Roth5429
TryptoneCarl Roth8952
Yeast extractCarl Roth2363
Zinc chloride (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
L-alanineSigma-AldrichA7627
L-arginineSigma-AldrichA5006
L-asparagineSigma-AldrichA8381
L-aspartic acidSigma-AldrichA0884
L-cysteineSigma-AldrichC7352
L-glutamic acidSigma-AldrichG2128
L-glutamineSigma-AldrichG3126
L-glycineSigma-AldrichG7126
L-histidineSigma-AldrichH8000
L-isoleucineSigma-AldrichI2752
L-leucineSigma-AldrichL8000
L-lysineSigma-AldrichL5501
L-methionineSigma-AldrichM9625
L-phenylalanineSigma-AldrichP2126
L-prolineSigma-AldrichP0380
L-serineSigma-AldrichS4500
L-threonineSigma-AldrichT8625
L-tryptophanSigma-AldrichT0254
L-tyrosineSigma-AldrichT3754
L-valineSigma-AldrichV0500
(4S)-fluoroprolineBachem4033274Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroprolineBachem4033275Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroprolineBachem4003545Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroprolineEnamineEN400-17448Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mLFisher Scientific14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000Spectrum Medical IndustriesSpectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTAGE HealthcareHisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mLCarl RothEP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mLCarl RothT550.1
Luer-Lock syringe, 50 mLCarl RothT552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLEppendorf30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile)Carl RothTA19
pQE-80L plasmid vectorQiagenno longer availablereplaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83Addgene50348https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83ATCC35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mLFisher ScientificCorning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneCarl RothCCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MSSigma-AldrichSupelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mmwith conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mLSigma-AldrichSupelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MSAgilentAgilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis softwareAgilentMassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubesEppendorf5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubesEppendorf5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) systemGE HealthcareÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometerPerkin ElmerLS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruptionMicrofluidicsLM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivationInfors HTMinitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)GE HealthcareP-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruptionOmnilabBandelin SONOPULS HD 3200, 5650182with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometerBiochromULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometerPerkin ElmerLAMBDA 950 UV/Vis/NIR

References

  1. Agostini, F., Völler, J. -. S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. . FPbase avGFP Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011)
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822 (2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200 (2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -. B., Zhou, J. -. M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680 (2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, (2009).
  36. Budisa, N. . Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551 (2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287 (2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
  56. Wang, Y. -. S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , (2021).
  58. . ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021)
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017 (2018).
  60. . FPbase NowFFP Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021)
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896 (2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. . FPbase mKillerOrange Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021)
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740 (2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, (2017).
  76. Völler, J. -. S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697 (2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198 (2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved