Rückstandsspezifischer Austausch von Prolin durch Prolinanaloga in fluoreszierenden Proteinen: Wie die "molekulare Chirurgie" des Rückgrats die Faltung und Stabilität beeinflusst

Zusammenfassung

Um die Einschränkungen der klassischen ortsgesteuerten Mutagenese zu überwinden, wurden Prolinanaloga mit spezifischen Modifikationen in mehrere fluoreszierende Proteine eingebaut. Wir zeigen, wie sich der Ersatz von Wasserstoff durch Fluor oder des Einzelnen durch Doppelbindungen in Prolinresten ("molekulare Chirurgie") auf grundlegende Proteineigenschaften auswirkt, einschließlich ihrer Faltung und Wechselwirkung mit Licht.

Zusammenfassung

Der Ersatz von Prolin(Pro)-Resten in Proteinen durch die traditionelle ortsgerichtete Mutagenese durch eine der verbleibenden 19 kanonischen Aminosäuren ist oft schädlich für die Proteinfaltung und insbesondere die Chromophorreifung in grün fluoreszierenden Proteinen und verwandten Varianten. Eine vernünftige Alternative besteht darin, die Translation des Proteins so zu manipulieren, dass alle Pro-Reste restspezifisch durch Analoga ersetzt werden, eine Methode, die als selektiver Druckeinbau (SPI) bekannt ist. Die eingebauten chemischen Modifikationen können als eine Art "molekulare Chirurgie" genutzt werden, um messbare Veränderungen fein zu sezieren oder sogar verschiedene Proteineigenschaften rational zu manipulieren. Hier zeigt die Studie die Nützlichkeit der SPI-Methode, um die Rolle von Prolinen bei der Organisation der typischen β-Barrel-Struktur von spektralen Varianten des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) mit 10-15 Prolinen in ihrer Sequenz zu untersuchen: Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), NowGFP und KillerOrange. Pro-Rückstände liegen in Verbindungsabschnitten zwischen einzelnen β-Strängen vor und bilden die Schließdeckel des Fassgerüsts, so dass sie für die Isolierung des Chromophors von Wasser, d.h. die Fluoreszenzeigenschaften, verantwortlich sind. Selektivdruck-Inkorporationsexperimente mit (4 R)-Fluorprolin (R-Flp), (4S)-fluorprolin (S-Flp), 4,4-Difluorprolin (Dfp) und 3,4-Dehydroprolin (Dhp) wurden unter Verwendung eines Prolin-auxotrophen E. coli-Stammes als Expressionshost durchgeführt. Wir fanden heraus, dass fluoreszierende Proteine mit S-Flp und Dhp aktiv sind (d.h. fluoreszierend), während die anderen beiden Analoga (Dfp und R-Flp) dysfunktionale, fehlgefaltete Proteine produzierten. Die Untersuchung von UV-Vis-Absorptions- und Fluoreszenzemissionsprofilen zeigte nur wenige charakteristische Veränderungen in den Proteinen, die Pro-Analoga enthielten. Die Untersuchung der faltkinetischen Profile in EGFP-Varianten zeigte einen beschleunigten Refaltungsprozess in Gegenwart von S-Flp, während der Prozess dem Wildtyp in dem Protein ähnelte, das Dhp enthielt. Diese Studie zeigt die Fähigkeit der SPI-Methode, subtile Modifikationen von Proteinresten auf atomarer Ebene zu erzeugen ("molekulare Chirurgie"), die für die Untersuchung anderer Proteine von Interesse übernommen werden können. Es veranschaulicht die Ergebnisse des Prolinersatzes mit engen chemischen Analoga auf die faltenden und spektroskopischen Eigenschaften in der Klasse der β-Barrel-fluoreszierenden Proteine.

Einleitung

Die klassische ortsgesteuerte Mutagenese ermöglicht die Permutation jeder existierenden genkodierten Proteinsequenz durch Codon-Manipulation auf DNA-Ebene. Um die Proteinfaltung und -stabilität zu untersuchen, ist es oft wünschenswert, ähnliche Aminosäuren durch ähnliche Gegenstücke zu ersetzen. Die traditionelle Proteinmutagenese beschränkt sich jedoch definitiv auf strukturell ähnliche Ersatzstoffe unter kanonischen Aminosäuren wie Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, die im genetischen Standardcode-Repertoire vorhanden sind. Auf der anderen Seite gibt es keine solchen Möglichkeiten für andere kanonische Aminosäuren wie Trp, Met, His oder Pro, die in Proteinen oft eine wesentliche strukturelle und funktionelle Rolle spielen¹. Ein idealer Ansatz, um diese Wechselwirkungen im Kontext der hochspezifischen inneren Architektur von Proteinen und ihres Faltungsprozesses zu untersuchen, besteht darin, nicht-disruptive isosterische Modifikationen zu erzeugen. In der Tat, wenn isosterische Aminosäureanaloga dieser kanonischen Aminosäuren, auch bekannt als nicht-kanonische Aminosäuren (ncAAs), in Proteine eingefügt werden, ermöglichen sie subtile Veränderungen sogar auf der Ebene einzelner Atome oder Atomgruppen wie H / F, CH 2 / S / Se / Te, die als "atomare Mutationen^{" bekannt sind2}. Eine solche "molekulare Chirurgie" erzeugt veränderte Proteine, deren Eigenschaften ausschließlich aus dem Austausch einzelner Atome oder Gruppen von Atomen resultieren, die in günstigen Fällen analysiert und die nachgewiesenen Veränderungen rationalisiert werden können. Auf diese Weise wird der Umfang der Proteinsynthese zur Untersuchung der Proteinfaltung und -struktur weit über die klassische DNA-Mutagenese hinaus erweitert. Beachten Sie, dass Proteine, die durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden, normalerweise als "Mutanten" bezeichnet werden, während Proteine mit substituierten kanonischen Aminosäuren als "Varianten" ³, "Alloproteine^"4 oder "Proteinkongenere"⁵ bezeichnet werden.

Das grün fluoreszierende Protein (GFP), das erstmals im Meeresorganismus Aequorea victoria identifiziert wurde, zeigt eine hellgrüne Fluoreszenz, wenn es ultraviolettem bis blauem Licht ausgesetzt^{wird 6,7}. GFP wird heute häufig als hochempfindliches Markierungswerkzeug zur routinemäßigen Visualisierung der Genexpression und Proteinlokalisation in Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. GFP hat sich auch in verschiedenen biophysikalischen 8,9,10- und biomedizinischen 11,12-Studien sowie im ^{Protein-Engineering 13,14,15} als nützlich erwiesen. Die rigorose Analyse der GFP-Struktur ermöglichte die Erstellung zahlreicher Varianten, die sich durch unterschiedliche Stabilität und Fluoreszenzhöchstwerte^16,17 auszeichnen. Die meisten GFP-Varianten, die in der Zell- und Molekularbiologie verwendet werden, sind monomere Proteine sowohl in Lösung als auch im Kristall¹⁸. Ihre strukturelle Hauptorganisation ist unabhängig von ihrer phylogenetischen Herkunft typisch für alle Mitglieder der GFP-Familie und besteht aus 11 β-Strängen, die ein sogenanntes β-Fass bilden, während eine geknickte α-Helix durch die Mitte des Fasses verläuft und das Chromophor trägt (Abbildung 1A). Die autokatalytische Reifung des Chromophors (Abbildung 1B) erfordert die präzise Positionierung der ihn umgebenden Seitenketten an der zentralen Stelle des Proteins; Viele dieser Seitenketten sind in anderen GFP-Varianten^{stark erhalten 19}. In den meisten fluoreszierenden Proteinen von Quallen wie Aequorea victoria besteht das grün emittierende Chromophor aus zwei aromatischen Ringen, darunter ein Phenolring von Tyr66 und die fünfgliedrige heterocyclische Struktur von Imidazolinon (Abbildung 1B). Das Chromophor ist, wenn es richtig in die Proteinmatrix eingebettet ist, für die charakteristische Fluoreszenz des gesamten Proteins verantwortlich. Es befindet sich in der Mitte der Struktur, während die Fassstruktur es vom wässrigen Medium²⁰ isoliert. Die Exposition des Chromophors gegenüber dem Massenwasser würde zu einer Fluoreszenzlöschung führen, d. h. zu einem Verlust der Fluoreszenz²¹.

Die richtige Faltung der tonnenartigen Struktur ist für den Schutz des Chromophors vor Fluoreszenzlöschung^{unerlässlich 22}. Prolin (Pro)-Rückstände spielen eine besondere Rolle bei der strukturellen Organisation von GFP²³. Da sie nicht in der Lage sind, einen β-Strang zu unterstützen, bilden sie Verbindungsschleifen, die für die Aufrechterhaltung der Proteinstruktur als Ganzes verantwortlich sind. Es überrascht nicht, dass 10-15 Prolinreste sowohl in Aequorea- als auch in Anthoathecata-abgeleiteten GFPs gefunden werden; Einige von ihnen sind in anderen Arten von fluoreszierenden β-Barrel-Proteinen stark konserviert. Es wird erwartet, dass Proline aufgrund ihrer besonderen geometrischen Eigenschaften die Falteigenschaften entscheidend beeinflussen. Zum Beispiel bilden in Aequorea-abgeleiteten GFPs von den zehn Prolinresten (Abbildung 2A) neun Trans- und nur einer bildet eine cis-Peptidbindung (Pro89). Pro58 ist essentiell, d.h. nicht austauschbar mit dem Rest der 19 kanonischen Aminosäuren. Dieser Rückstand könnte für die korrekte Positionierung des Trp57-Rückstands verantwortlich sein, von dem berichtet wurde, dass er für die Chromophorreifung und die gesamte GFP-Faltung^{entscheidend ist 24}. Das Fragment PVPWP mit drei Prolinresten (Pro54, Pro56, Pro58) und Trp57 ist der wesentliche Teil des "unteren Deckels" in der GFP-Struktur aus Abbildung 1A. Das PVPWP-Strukturmotiv findet sich in mehreren Proteinen wie Cytochromen und eukaryotischen spannungsaktivierten Kaliumkanälen²⁵. Prolin-zu-Alanin-Substitutionen an den Positionen 75 und 89 sind auch schädlich für die Proteinexpression und -faltung und schaffen die Chromophorreifung ab. Pro75 und Pro89 sind Teil des "oberen Deckels", der den Chromophor vergräbt (Abbildung 1A) und sind über 11-strängige β-Barrel-fluoreszierende Proteine^{konserviert 23}. Diese beiden "Deckel" halten das Chromophor vom wässrigen Lösungsmittel ausgeschlossen, auch wenn die stabile tertiäre Struktur teilweise gebrochen wurde²⁶. Eine solche spezifische molekulare Architektur schützt das Fluorophor vor kollisionaler (dynamischer) Fluoreszenzlöschung, z. B. durch Wasser, Sauerstoff oder andere diffusible Liganden.

Um molekulares Engineering der GFP-Struktur durchzuführen, sollte man Aminosäuresubstitutionen in der Primärstruktur des Proteins einführen. An GFP wurden zahlreiche Mutationen durchgeführt, die Varianten mit erhöhter Stabilität, schneller und zuverlässiger Faltung und variablen Fluoreszenzeigenschaften^{verleihen 17}. Dennoch wird in den meisten Fällen die Mutation von Prolinresten als riskanter Ansatz angesehen, da keine der verbleibenden 19 kanonischen Aminosäuren das Konformationsprofil des Prolinrests²⁷ ordnungsgemäß wiederherstellen kann. So wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, bei dem Prolinreste durch andere Prolin-basierte Strukturen ersetzt werden, die als Prolin-Analoga²⁸ bezeichnet werden. Aufgrund seiner einzigartigen zyklischen chemischen Struktur weist Prolin zwei charakteristische Konformationsübergänge auf (Abbildung 1C): 1) das Prolin-Ring-Puckering, ein schneller Prozess, der die Organisation des Rückgrats mit sich bringt, der in erster Linie den φ Torsionswinkel beeinflusst, und 2) die Peptidbindung cis / trans-Isomerisierung, ein langsamer Prozess, der die Rückgratfaltung über die ω-Torsionswinkel beeinflusst. Aufgrund seiner langsamen Natur ist der letztere Übergang häufig für die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte im Faltungsprozess des gesamten Proteins verantwortlich. Es wurde bereits gezeigt, dass die Peptidbindung cis/trans-Isomerisierung um einige Prolinreste langsame Schritte bei der Faltung von GFP-Varianten aufweist. Zum Beispiel zeigt die Bildung der cis-Peptid-Bindung bei Pro89 den langsamen Schritt im Prozess der Faltung, da sie auf dem Bindungsübergang von trans zu cis²⁹ beruht. Eine schnellere Rückfaltung kann erreicht werden, nachdem Pro89 durch eine All-Trans-Peptid-Schleife ersetzt wurde, d.h. durch Abschaffung eines cis-zu-trans-Isomerisierungsereignisses³⁰. Zusätzlich zur cis/trans-Isomerisierung können die Pucker-Übergänge aufgrund der Rückgratorganisation und -packung im Proteininneren auch tiefgreifende Veränderungen in der Proteinfaltung hervorrufen ^27,31.

Chemische Modifikationen führen zu einer Veränderung der intrinsischen Konformationsübergänge der Prolinreste, wodurch die Faltungsfähigkeit des Proteins beeinträchtigt wird. Bestimmte Prolinanaloga sind besonders attraktive Kandidaten für die Prolinsubstitution in Proteinen, da sie die Manipulation und Untersuchung der Faltungseigenschaften ermöglichen. Zum Beispiel sind (4R)-Fluorprolin (R-Flp), (4S)-Fluorprolin (S-Flp), 4,4-Difluorprolin (Dfp) und 3,4-Dehydroprolin (Dhp) vier Analoga (Abbildung 1D), die sich sowohl in Bezug auf das Molekülvolumen als auch auf die Polarität minimal von Prolin unterscheiden³². Gleichzeitig weist jedes Analogon ein ausgeprägtes Ring-Puckering auf: S-Flp stabilisiert den C-4-Endo-Pucker, R-Flp stabilisiert den C-4-Exo-Pucker, Dfp zeigt keine offensichtliche Pucker-Präferenz, während Dhp das Puckering abschafft (Abbildung 1D)³³. Durch die Verwendung dieser Analoga in der Proteinstruktur kann man mit dem Konformationsübergang der Prolinreste manipulieren und damit die Eigenschaften der resultierenden GFP-Varianten beeinflussen.

In dieser Arbeit haben wir uns vorgenommen, den vorgesehenen Satz von Prolinanaloga (Abbildung 1D) mit Hilfe der selektiven Druckeinbaumethode (SPI, Abbildung 3)³⁴ in die Struktur von GFP-Varianten zu integrieren. Der Ersatz von Aminosäureresten durch ihre nächsten isostrukturellen Analoga ist ein angewandtes biotechnologisches Konzept im Proteindesign^35,36. Somit veranschaulichen die Wirkungen von Prolinanaloga in einem Modellprotein ihr Potenzial, als Werkzeuge im Protein-Engineering^{zu dienen 37}. Die Herstellung von Proteinen, die gewünschte Analoga enthalten, wurde in modifizierten E. coli-Stämmen durchgeführt, die nicht in der Lage sind, Prolin zu produzieren (Prolin-Auxotrophie). So könnten sie gezwungen sein, den Ersatz von Substraten im Prozess der Proteinbiosynthese^{zu akzeptieren 38}. Diese globale Substitution von Prolin wird durch die natürliche Substratflexibilität der endogenen Aminoacyl-tRNA-Synthetasen³⁹ ermöglicht, deren Schlüsselenzyme die Veresterung von tRNAs mit geeigneten Aminosäuren^{katalysieren 40}. Im Allgemeinen, wie in Abbildung 3 dargestellt, wird das Zellwachstum in einem definierten Medium durchgeführt, bis die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht ist. Im nächsten Schritt wird die zu ersetzende Aminosäure während der Fermentation intrazellulär aus dem Expressionssystem abgebaut und anschließend durch das gewünschte Analogon oder ncAA ausgetauscht. Die Zielproteinexpression wird dann für die restspezifische nicht-kanonische Aminosäureinkorporation induziert. Die Substitution der verwandten Aminosäure durch ihr Analogon erfolgt proteomweit. Obwohl sich diese Nebenwirkung negativ auf das Wachstum des Wirtsstamms auswirken kann, wird die Qualität der Zielproteinproduktion meist nicht beeinträchtigt, da bei der rekombinanten Expression die zellulären Ressourcen hauptsächlich auf die Produktion des Zielproteins^41,42 gerichtet sind. Daher sind ein streng reguliertes, induzierbares Expressionssystem und starke Promotoren entscheidend für eine hohe Einarbeitungseffizienz⁴³. Unser Ansatz basiert auf der multiplen restspezifischen Einarbeitung von ncAAs als Reaktion auf Sense-Codons (Sense-Codon-Reassignment), wobei innerhalb des Zielgens die Anzahl der Positionen für die Pro-Analog-Insertion über die ortsgerichtete Mutagenese⁴⁴ manipuliert werden kann. Ein ähnlicher Ansatz wurde in unserem vorherigen Bericht über die Herstellung von rekombinanten Peptiden mit antimikrobiellen Eigenschaften⁴⁵ angewendet. In dieser Arbeit haben wir die SPI-Methode angewendet, die es ermöglicht, alle Prolinreste durch verwandte Analoga zu ersetzen, um Proteine zu erzeugen, von denen erwartet wird, dass sie unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften besitzen, die in Proteinen, die mit dem kanonischen Aminosäurerepertoire synthetisiert werden, nicht vorhanden sind. Durch die Charakterisierung des Faltungs- und Fluoreszenzprofils der resultierenden Varianten wollen wir die Auswirkungen atomarer Substitutionen in Varianten von GFP aufzeigen.

Protokoll

1. Einführung von Expressionsplasmiden in kompetente pro-auxotrophe E. coli-Zellen

1. Mischen Sie 1 ng jedes Probenplasmids, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H 6-NowGFP und pQE-80L H _{6-KillerOrange} mit 50 μL chemisch kompetenter oder elektrokompetenter Zellen des Pro-auxotrophen E. coli K12-abgeleiteten Stammes JM83 (Addgene #50348 oder ATCC #35607) zur Umwandlung durch die Hitzeschockmethode oder Elektroporation gemäß den verfügbaren Protokollen⁴⁶, ⁴⁷.
   HINWEIS: Der Expressionsvektor pQE-80L EGFP-H 6 kodiert ein C-terminally 6xHis-tagged enhanced green fluorescent protein (EGFP), die Expressionsvektoren pQE-80L H 6-NowGFP und pQE-80L H _{6-KillerOrange} kodieren ein N-terminally 6xHis-tagged NowGFP 48 bzw. ein N-terminally 6xHis-tagged KillerOrange ^49, jeweils in einem pQE-80L Plasmid-Backbone. Alle Zielgene stehen unter der Kontrolle eines bakteriellen T5-Promotors, der vom Lac-Operator reguliert wird. Ampicillinresistenz wurde als Selektionsmarker und ColE1 als Ursprung der Replikation verwendet. Weitere Informationen zum Plasmid pQE-80L finden Sie in der Materialtabelle. Alternative pro-auxotrophe E. coli, die aus den Stämmen K-12 und B stammen, können ebenfalls zur Expression verwendet werden und sollten zu ähnlichen Ergebnissen führen. Die berechnete Molekülmasse der H 6-markierten, einzeln protonierten ([M+^H]+) Wildtypproteine (nach Chromophorreifung) beträgt 27.745,33 Da (EGFP-H 6), 27.931,50 Da (H 6-NowGFP) und 27.606,09 Da (H _{6-KillerOrange}). Die Primärstrukturen der Zielproteine sind in Tabelle 1 angegeben (His-Tag unterstrichen). Das Glutamin (Q) innerhalb der His-Tag-Sequenz von NowGFP wurde durch DNA-Sequenzierung nach Subklonierung der von Pletnev et ^al.51 erhaltenen NowGFP-cDNA in das pQE-80L-Plasmid identifiziert. Es behindert nicht die Proteinreinigung oder die Eigenschaften des fluoreszierenden Proteins.
2. Stellen Sie die Zellen in 950 μL SOC-Medium bei 37 °C für 1 h wieder her.
3. Verteilen Sie 50 μL der zurückgewonnenen Zellen auf Luria-Agar (LA)-Mediumplatten (siehe Ergänzungsmaterial), die Glukose (10 g/L) und Ampicillin (100 μg/ml) enthalten.
4. Inkubieren Sie die LA-Mediumplatten bei 37 °C über Nacht oder 30 °C für 24 h.

2. Herstellung von rekombinanten fluoreszierenden Wildtypproteinen (mit kanonischem Prolin) und Verfahren zur selektiven Druckeinarbeitung (SPI) zur Herstellung fluoreszierender Proteine mit Prolinanaloga (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

1. Übernachtkultur des Pro-auxotrophen E. coli K12-abgeleiteten Stammes JM83 mit pQE-80L EGFP- H 6, pQE-80L H 6-NowGFP und pQE-80L H _{6-KillerOrange}
   1. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze oder Impfschleife, um eine einzelne Kolonie aus einer LA-Mediumplatte auszuwählen und die Zellen in 5 ml Lysogenbrühe (LB) -Medium (siehe Ergänzungsmaterial; mit 10 g / L Glukose, 100 μg / ml Ampicillin) in einem sterilen 14 ml Polystyrol-Kulturröhrchen zu resuspendieren.
      HINWEIS: Frisch transformierte Kolonien werden zur Impfung empfohlen. Zellen auf LA-Mediumplatten (ab Schritt 2.2.), die bei 4 °C gelagert werden, sollten innerhalb weniger Tage verwendet werden.
   2. Züchten Sie die Zellkultur über Nacht bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bei 200-250 U/min.
2. Herstellung von rekombinantem EGFP-H₆, H₆-NowGFP und H₆-KillerOrange mit nativem Prolin und den entsprechenden Proteinvarianten mit Prolinanaloga
   1. Beimpfen Sie 200 mL frisches NMM-Medium (7,5 mM (NH 4)₂SO4, 50 mM K2_HPO4 und 22 mM_KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM_MgSO4, 20 mM D-Glukose, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml _CaCl2, 10 μg/ml Thiamin, 10 μg/ml Biotin, 0,01 μg/ml Spurenelemente (CuSO 4, ZnCl₂, MnCl 2, (NH 4)2 MoO₄), pH ~_7,2) mit allen kanonischen L-Aminosäuren (50 mg/L); siehe Ergänzungsmaterial) ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin mit 2 ml der Nachtkultur in einem 2-L Erlenmeyerkolben.
      HINWEIS: Je nach Art des Proteins können alternative Kultivierungsmedien wie MOPS medium 52, Glukose-Mineralsalze medium⁵³, Davis minimal medium⁵⁴, M9 minimal medium 55 oder GMML⁵⁶ getestet werden, um die Proteinausbeute zu optimieren^.
   2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bei 220 U / min für ~ 3 h 30 min.
   3. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) in einem Spektralphotometer alle 30 Minuten, bis ein OD_600-Wert von ~ 0,7 erreicht ist.
      HINWEIS: Für die OD_{600-Bestimmung} in einem Spektralphotometer sollte die Küvette eine Weglänge von 1 cm haben. Für die Referenzmessung ("Null") wird das entsprechende Kultivierungsmedium verwendet. Die Inkubationszeit bis zum Erreichen eines OD_600-Wertes von ~ 0,7 kann vom Kulturvolumen abhängen. 3 h 30 min ist ein ungefährer Wert. In einer Variation der Protokoll-Teilschritte 2.2.1-2.2.3., die Kultur aus Teilschritt 2.1.2. wird verwendet, um frisches NMMΔPro-Medium (siehe Ergänzungsmaterial) zu impfen, das mit einer begrenzten Konzentration von Prolin (z. B. 5 mg / L anstelle von 50 mg / L) ergänzt wird, und die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 220 U / min gezüchtet. Am nächsten Tag wird die OD_{600-Bestimmung alle 30} Minuten durchgeführt, bis die Unterschiede zwischen den Messungen weniger als 0,05 betragen. Der maximale OD_600-Wert sollte bei etwa 1 (± 0,3) liegen. Die anfängliche, begrenzte Prolinkonzentration kann je nach Expressionsstamm und Kultivierungsmedium angepasst werden (siehe Diskussion).
   4. Drehen Sie die Zellsuspension für 10 min bei 3.000 x g und 4 °C herunter.
   5. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig zu Abfall.
   6. Waschschritt: Resuspendieren Sie die Zellen in 50 ml eiskaltem NMMΔAA-Medium (ohne Aminosäure, siehe Ergänzungsmaterial) oder NMMΔPro (ohne Prolin, siehe Zusatzmaterial) durch sorgfältiges Pipettieren.
      HINWEIS: Für diesen Waschschritt kann einer der beiden angegebenen Puffer verwendet werden, da es nur wichtig ist, Restprolin im Inkubationsmedium loszuwerden.
   7. Trennen Sie die Zellen vom Medium durch Sedimentation bei 4 °C in einer Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min.
   8. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig zu Abfall.
   9. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Zellpellet in 200 ml NMMΔPro-Medium, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, in einen 2-L-Erlenmeyerkolben zu resuspendieren.
      HINWEIS: Die resultierende Zellsuspension kann in mehrere Proben gleichen Volumens getrennt werden, um identische Startkulturen für den Vergleich der Proteinexpression in Gegenwart von Pro- oder Prolinanaloga zu erhalten (z. B. Trennung in 4 x 50 ml in 100 ml Erlenmeyerkolben).
   10. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bei 220 U / min für die vollständige Erschöpfung von Pro.
       HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um Pro vollständig aus Zellen zu erschöpfen.
   11. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von L-Prolin oder R-Flp, S-Flp, Dfp und Dhp aus 50 mM Stammlösung hinzu, um die Endkonzentration von 1 mM in der Zellsuspension einzustellen.
       HINWEIS: In der Regel sollten frische 50-mM-Aktienlösungen von Pro- oder Prolinderivaten immer vor der Verwendung vorbereitet werden. Nur wenn die Hydrolyse der jeweiligen kanonischen oder nicht-kanonischen Aminosäure in einer wässrigen Lösung kein Problem darstellt, können auch gefrorene Vorräte verwendet werden.
   12. Fügen Sie 0,5 mM IPTG aus einer 1 M Stammlösung hinzu, um die Zielproteinexpression zu induzieren.
   13. Drücken Sie das Zielprotein über Nacht (12 h) bei 37 °C in einem Orbitalshaker bei 220 U/min aus.
   14. Messen Sie OD₆₀₀ am nächsten Tag.
       HINWEIS: Die OD_{600-Bestimmung} wird durchgeführt, um die Menge der Zellen nach der Proteinexpression zu quantifizieren. Ein niedrigerer OD_600-Wert im Vergleich zu dem vor dem Waschschritt 2.2.3 gemessenen Wert zeigt die Zytotoxizität der zugeführten Aminosäure an. In diesem Fall sollte der Vorgang wiederholt werden, wobei die Konzentration der zugeführten Aminosäure minimiert wird (bis zu 0,1 mM).
   15. Zentrifugieren und sammeln Sie die Bakterienzellen bei 5.000 x g und 4 °C für 10 min und dekantieren Sie den Überstand zu Abfall.
   16. Waschschritt: Resuspendieren Sie die Zellen durch sorgfältiges Pipettieren in 50 mL Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) mit 10% Glycerin und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 mL konisches Polystyrolröhrchen.
   17. Zentrifugieren und sammeln Sie die Bakterienzellen bei 5.000 x g und 4 °C für 10 min und dekantieren Sie den Überstand zu Abfall.
   18. Lagern Sie das Zellpellet in einem 50 ml konischen Polystyrolröhrchen bei -20 °C oder -80 °C bis zur weiteren Verwendung (Proteinreinigung, siehe unten).

3. Reinigungsverfahren von Proteinproben durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC)

1. Bakterielle Zelllyse
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte der Zelllyse auf Eis oder bei 4 ° C durch, um den Abbau des Zielproteins zu verhindern.
   1. Tauen Sie das Bakterienzellpellet auf Eis oder bei 4 °C in einem 50 ml konischen Polystyrolröhrchen für 10-20 min auf.
   2. Fügen Sie 10 ml eiskalten Bindungspuffer hinzu (siehe Ergänzungsmaterial) und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Zellpellet wieder zu suspendieren.
   3. 100 μL 50 mg/ml Lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNase I, 100 μL 1 mg/ml RNase A, 30 μL 1 M_MgCl2 hinzufügen. Kehren Sie die Zellsuspension fünfmal vorsichtig um und halten Sie das geschlossene Rohr 60 min lang auf Eis oder bei 4 °C.
      HINWEIS: Lysozym induziert chemische Zelllyse, indem es die bakterielle Zellwand stört.
   4. Beschallen Sie die Probe auf Zellaufschluss mit einem Ultraschall-Homogenisator (z. B. 3 mal für 3 min in einem 50 ml Polystyrolröhrchen auf einem Eis-Wasser-Gemisch, Puls 2 s / Pause 4 s, 45% Amplitude).
      HINWEIS: Alternativ können auch andere Zellaufschlussverfahren eingesetzt werden, z.B. Hochdruckhomogenisierung in 20 Zyklen bei 14.000 psi. Falls erforderlich, verdünnen Sie mit einem Bindepuffer (siehe Ergänzungsmaterial), um das minimale Instrumentenvolumen zu erreichen. Darüber hinaus können Proteinextraktionsreagenzien für Zellaufschluss verwendet werden. Beispiele finden Sie in der Materialtabelle .
   5. Zentrifuge für 60 min bei 18.000 x g, 4 °C.
   6. Notieren Sie sich das Flüssigkeitsvolumen für Teilschritt 3.1.9. und gießen Sie den Überstand in ein frisches 50 ml Polystyrolrohr.
   7. Reinigen Sie den Überstand mit einem Membranfilter mit 0,45 μm Porendurchmesser.
   8. Nehmen Sie eine Probe von "Lysat" für SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4. unten); Dies entspricht der "löslichen Proteinfraktion", dem Überstand aus Teilschritt 3.1.6.
   9. Fügen Sie ein gleiches Volumen von ddH 2 O hinzu_,wie in Teilschritt 3.1.6 festgelegt. die Zelltrümmer zu resuspendieren, um die gleiche Verdünnung der Proben für die anschließende SDS-PAGE-Analyse aufrechtzuerhalten.
   10. Nehmen Sie eine Probe von "Pellet" für SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4. unten); Dies entspricht der "unlöslichen Proteinfraktion", der Zelltrümmersuspension aus Teilschritt 3.1.9.
2. Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) Reinigung
   HINWEIS: Die Reinigung des fluoreszierenden Zielproteins kann bei 4 °C oder bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden. Warten Sie bei der letzteren Option, bis sich das Lysat, die Säule und alle Puffer bei RT ausgleichen, um die Bildung von Luftblasen aufgrund der Verdampfung von Luft, die in kalter Lösung eingeschlossen ist, beim Platzieren in einer warmen Säule zu verhindern.
   1. Reinigen Sie die Probe mit einer 1 ml vorverpackten oder selbstverpackten IMAC FPLC (Fast Protein [oder Performance] Liquid Chromatography) Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers; Stellen Sie den maximalen Säulendruck auf 0,3 MPa und den Durchfluss auf 1 ml/min ein; Verwenden Sie den Bindungspuffer (siehe Ergänzungsmaterial) für die Säulenausgleichung, den Waschpuffer (siehe Zusatzmaterial) für den Waschschritt und den Elutionspuffer (siehe Ergänzungsmaterial) für die Zielproteinelution.
      HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes FPLC-System angewendet werden, um das Zielprotein mit Elutionspuffer zu eluieren, der einen linearen Imidazol-Konzentrationsgradienten (20-200 mM) ausführt.
   2. Sammeln und poolen Sie die Eluatfraktionen mit fluoreszierenden Proteinen (wählen Sie nach sichtbarer grüner oder oranger Farbe).
   3. Die gepoolten Fraktionen gemäß Herstellerangaben in eine Dialysemembran (Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) von 5.000-10.000) überführen und mindestens dreimal gegen Dialysepuffer oder MS-Puffer dialysieren (siehe Ergänzungsmaterial). Führen Sie beispielsweise die Dialyse einer 1-ml-Probe dreimal gegen 100 ml Puffer für mindestens 2 Stunden pro Runde durch. Ein detailliertes Protokoll finden Sie in Budisa et ^al.34.
   4. Bereiten Sie eine 1:100-fache Verdünnung der dialysierten Elutionsfraktion im PBS-Puffer vor (siehe Ergänzungsmaterial).
   5. Zeichnen Sie das Absorptionsspektrum der verdünnten Proben in einem UV-Vis-Spektralphotometer auf.
   6. Berechnen Sie die Proteinkonzentration basierend auf dem Lambert-Beer-Gesetz wie folgt unter Verwendung von Literaturwerten der molaren Extinktionskoeffizienten ε bei bestimmten Wellenlängen (für EGFP bei 488 nm ε₄₈₈ = 55.000 ^cm-1· ^M-1, NowGFP bei 493 nm ε₄₉₃ = 53.600 ^cm-1· ^M-1, KillerOrange bei 514 nm ε₅₁₄ = 22.600 ^cm-1· ^M-1):
      (Lambert-Bier-Gesetz)
      _c-Protein = Proteinkonzentration [mg/ml]
      A = Absorption bei bestimmter Wellenlänge
      ε = molarer Extinktionskoeffizient bei bestimmter Wellenlänge [M-1·^cm-1]
      d = Küvettenbahnlänge, hier 1 cm
      MW = Molekulargewicht des Proteins [g/mol]
      Verwenden Sie Dialysepuffer (siehe Ergänzungsmaterial) für die Referenzmessung ("Null").
   7. Nehmen Sie eine Probe "Eluat" für SDS-PAGE (siehe Abschnitt 4 unten), laden Sie 1-10 μg Protein (berechnet nach dem vorherigen Schritt) pro Probe gut für Coomassie Brilliant Blue-gefärbte Gele.
      HINWEIS: Passen Sie die SDS-Probenmengen in Abhängigkeit von der angewendeten Färbemethode und der Empfindlichkeit des Farbstoffs an, wenn andere Verbindungen als Coomassie Brilliant Blue für die Proteinbandfärbung verwendet werden.
   8. Die Proteinprobe einfrieren und in Dialysepuffer (siehe Ergänzungsmaterial) bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Unter dieser Lagerbedingung sollten Proteinproben mindestens 6 Monate lang stabil sein. Alternative Labor-UV-Vis- und Fluoreszenzspektralphotometer können zur Aufzeichnung von Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren von Zielproteinen eingesetzt werden. Die folgenden Anregungswellenlängen können für Fluoreszenzemissionsmessungen verwendet werden: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) und 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE Probenvorbereitung

1. Bestimmung der Absorption A bei 280 nm (A_280nm) für die Proben "Eluat", "Lysat" und "Pellet" aus Abschnitt 3. Passen Sie das Sondenvolumen an, um A_280nm = 2 zu erreichen, indem Sie eine geeignete Menge an Elutionspuffer hinzufügen (das endgültige Sondenvolumen sollte mindestens 80 μL betragen).
2. Mischen Sie die Probe in einem Verhältnis von 4:1 (v/v) mit 5x SDS-Beladungsfarbstoffpuffer (siehe Zusatzmaterial) durch Pipettieren, z. B. 80 μL der Probe mit 20 μL 5x SDS-Ladepuffer.
3. Kochen Sie die SDS-Proben bei 95 °C für 5 min in einem Wasserbad oder Wärmeblock, um die Proteine zu denaturieren.
4. Lassen Sie die Proben auf RT abkühlen und drehen Sie die Sonden mit 13.000 x g für 1 min in einer Mikrozentrifuge herunter, bevor Sie auf das Gel geladen werden.
5. Verwenden Sie 5-10 μL für Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Einzelheiten zum SDB-PAGE-Verfahren finden Sie^{in 57}.
   HINWEIS: Passen Sie die SDS-Probenmengen in Abhängigkeit von der angewendeten Färbemethode und der Empfindlichkeit des Farbstoffs an. Das Ergebnis der SDS-PAGE sollte sorgfältig überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Proben mehr als 95% des Gesamtproteins in einer Bandbreite enthalten, die dem erwarteten Molekulargewicht des gewünschten Proteins entspricht. Machen Sie dazu ein Foto des Coomassie-gefärbten Gels und vergleichen Sie die Intensität der Proteinbande des gewünschten Molekulargewichts mit der Intensität aller anderen Banden in der Lane (falls vorhanden) durch Densitometrie. Zur densitometrischen Auswertung von Bandintensitäten kann die Software ImageJ⁵⁸ eingesetzt werden. Um den Einbau der gewünschten ncAAs in das interessierende Protein experimentell nachzuweisen, sollte eine intakte Proteinmassenanalyse mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit der Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wie beschrieben^{durchgeführt werden 59} (siehe Protokollabschnitt 5 und Materialtabelle darin für beispielhafte Geräte).

5. Fluoreszenzemission von Proteinvarianten

1. Überprüfen Sie vor dem Verfahren das Ergebnis des SDS-PAGE-Experiments, um sicherzustellen, dass die Reinheit der Proben >95 % beträgt (siehe HINWEIS nach Schritt 4.5).
2. Die Proben jeder gereinigten Proteinvariante werden auf eine Konzentration von 0,3 μM eingestellt, wobei der berechnete Absorptionswert bei der entsprechenden Wellenlänge als Referenz verwendet wird (Unterschritt 3.2.5.). Stellen Sie sicher, dass das ungefähre endgültige Probenvolumen 200 μl beträgt.
3. Lassen Sie die verdünnten Proben bei RT 1 h lang ausgleichen.
4. Überführen Sie die Proben in eine 1 cm große Quarzküvette und messen Sie ein Fluoreszenzemissionsspektrum der Proben mit einem Fluoreszenzspektrometer (siehe Materialtabelle) mit den folgenden Anregungswellenlängen: 488 nm (für EGFP), 493 nm (für NowGFP), 510 nm (für KillerOrange).

6. Denaturierung und Umfaltung von EGFP-Varianten

1. Überprüfen Sie vor dem Verfahren das Ergebnis des SDS-PAGE-Experiments, um sicherzustellen, dass die Reinheit der Proben >95 % beträgt (siehe HINWEIS nach Schritt 4.5).
2. Für jede gereinigte Proteinvariante werden zwei Proben mit einem Endvolumen von 2 μl bei einer Konzentration von 300 μM hergestellt (siehe Bestimmung der Proteinkonzentration in den Teilschritten 3.2.4-3.2.6).
3. 18 μL 1,11x PBS-Puffer (siehe Ergänzungsmaterial) mit 8,89 m Harnstoff und 5,56 mM DTT zu 2 μL jeder gereinigten Proteinvariante (um 1x PBS mit 8 M Harnstoff und 5 mM DTT zu erhalten), um eine Denaturierung zu induzieren.
   HINWEIS: Verarbeiten Sie in den Schritten 6.4 bis 6.6 jede Probe separat.
4. Inkubieren Sie die Proben für 5 min bei 95 °C.
5. Verdünnen Sie die 20-μL-Proben 100-fach, indem Sie 1980 μL 1x PBS (siehe Zusatzmaterial) mit 5 mM DTT hinzufügen, um eine Renaturierung zu induzieren, was eine endgültige Proteinkonzentration von 0,3 μM ergibt, und übertragen Sie sofort 200 μL der Proben in eine 1-cm-Quarzküvette.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, hier schnell zu arbeiten, da die Renaturierung sofort beginnt.
6. Setzen Sie die Quarzküvette in ein geeignetes Fluoreszenzspektrometer ein (siehe Materialtabelle) und überwachen Sie die Proteinrückfaltung in den Proben, indem Sie alle 3 s über 30 min ein Fluoreszenzspektrum erfassen. Verwenden Sie für jede Proteinvariante eine Fluoreszenzanregung von 295 nm für die erste Probe und eine Fluoreszenzanregung von 488 nm für die zweite.
7. Überführen Sie die refoldenden Proben in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, schließen Sie den Deckel und lagern Sie die Proben bei RT 24 h lang im Dunkeln, um eine vollständige Nachfaltung der EGFP-Varianten zu ermöglichen.
8. Messen Sie die Fluoreszenzemission von gefalteten Proteinproben gemäß Schritt 6.6 mit der gleichen Anregungswellenlänge wie zuvor, um den zeitlichen Endpunkt der Fluoreszenzrückgewinnung zu erfassen.

Ergebnisse

Zu Beginn der Studie wählten wir drei verschiedene fluoreszierende Proteinvarianten aus, die sich die übergeordnete GFP-Architektur teilen. Das erste ausgewählte Protein war EGFP, eine technische Variante, die aus dem ursprünglichen GFP der Qualle Aequorea victoria gewonnen wurde und Phe64Leu/Ser65Thr-Mutationen enthält. Das zweite ausgewählte Protein war NowGFP ^51,60. Es ist auch eine Variante von A. victoria GFP, die durch Mutagenese in mehreren Schritten über vorhergehende fluoreszierende Proteine gewonnen wird. NowGFP enthält 18 Mutationen im Vergleich zu seinem unmittelbaren Vorgänger Fluoreszenzprotein "Cerulean"⁶¹. Das "Cerulean"-Protein wiederum ist ein Derivat des Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP)^62,63, eines Proteins, das zuvor durch gerichtete Laborevolution ausgewählt wurde und ein Tryptophan-basiertes Chromophor enthält. Sowohl EGFP als auch NowGFP sind in der Zellbiologie und in biophysikalischen Studien weit verbreitet und enthalten zehn konservierte Prolinreste in ihren Strukturen. Darüber hinaus weist NowGFP einen elften Prolinrest an Position 230 auf, der aufgrund der umfangreichen Mutationsgeschichte dieser Proteinvariante auftrat. Das dritte ausgewählte Protein war das fluoreszierende KillerOrange^{Protein 64,65}. Es ist ein Derivat des Chromoproteins anm2CP aus der Hydrozoengattung Anthoathecata. Die Proteinsequenz enthält 15 Prolinreste, und das Chromophor basiert eher auf einem Tryptophan als auf einem Tyrosinrest. Hochauflösende Röntgenstrukturen wurden für alle drei ausgewählten Proteine berichtet (Abbildung 2)51,65,66.

Im ersten Schritt wurden Prolinanaloga (Abbildung 1D) durch selektive Druckeinarbeitung in alle Prolinpositionen von drei Modellproteinen (EGFP, NowGFP und KillerOrange) eingebaut (SPI, ein Schema des Verfahrens ist in Abbildung 3 dargestellt). Instrumentell wurde der prolin-auxotrophe E. coli K12-Stamm JM83⁶⁷ zur Expression der Proteine in Gegenwart von Prolin und Analoga verwendet (Abbildung 1D), wodurch Wildtyp- bzw. modifizierte Proteine erblieben. Pellets aus Zellen, die das native Protein exprimierten, und Varianten, die S-Flp und Dhp trugen, hatten aufgrund des intakten Chromophors die typische helle Farbe, während Varianten, die R-Flp und Dfp enthielten, farblos blieben, was auf eine Fehlfaltung und Ablagerung von entfaltetem Protein in Einschlusskörpern hinweist (Abbildung 4A). Die SDS-PAGE-Analyse der exprimierten Proben bestätigte das Vorhandensein von unlöslichen R-Flp-haltigen Proteinen (Abbildung 4B-D), was weitere Untersuchungen ausschloss. Obwohl dies den Rahmen der vorliegenden Studie sprengen würde, sollte beachtet werden, dass Proteinlöslichkeits- und Fehlfaltungsprobleme bis zu einem gewissen Grad durch In-vitro-Refaltungsverfahren ^{gelindert werden können 68}. Im Gegensatz dazu wurden native Proteine sowie S-Flp- und Dhp-haltige Varianten hauptsächlich in den löslichen Fraktionen gefunden (Abbildung 4B-D). Der Wildtyp, sowie S-Flp- und Dhp-haltige Varianten, konnten in Fluoreszenzstudien weiter isoliert und charakterisiert werden. Lösliche Proteine wurden durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt, was 20-30 mg/L Kulturvolumen für EGFP, 60-80 mg für NowGFP und KillerOrange ergab, deren Ausbeuten für Wildtyp- und modifizierte Proteine sehr ähnlich waren. Die mit Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) gekoppelte Analyse bestätigte die erwartete Identität und Reinheit der auf diese Weise erhaltenen Isolate (Abbildung 5). In den Massenspektren erzeugte jeder Prolinersatz mit S-Flp eine Verschiebung von +18 Da pro Prolinrest in der Sequenz, während für den Prolin-zu-Dhp-Ersatz die Verschiebung −2 Da pro Rest betrug.

Im nächsten Schritt wurden Lichtabsorptions- und Emissionsspektren aufgezeichnet, um die möglichen Auswirkungen des Einbaus nicht-kanonischer Prolinanaloga auf die spektroskopischen Eigenschaften der fluoreszierenden Elternproteine zu analysieren (Abbildung 6). UV-Vis-Absorptionsspektren zeigten eine typische Bandbreite um 280 nm, die für aromatische Rückstände, Tyrosin und Tryptophan charakteristisch ist, während die Chromophorabsorption bei 488 nm für EGFP und 493 nm für NowGFP gefunden wurde (Abbildung 6A,B). In KillerOrange umfasste der Chromophor-Absorptionsbereich zwei Banden (Abbildung 6C), die zwei möglichen Konfigurations- und Ladungszuständen des komplexen Chromophors entsprechen. Das Band um 510 nm ist bekannt als der Zustand, aus dem Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute ^49,65 auftritt. Bei den Prolinersatzvarianten wurde folgendes beobachtet: Der Einbau von Dhp veränderte die Absorptionsspektren von EGFP und NowGFP nicht, während S-Flp eine verbesserte UV-Absorption erzeugte. Letzteres kann durch induzierte Unterschiede in den Tryptophan-Rückstandsmikroumgebungen erklärt werden, insbesondere Trp57 zwischen drei S-Flp im PVPWP-Motiv (Abbildung 6A,B)69. Eine trivialere Erklärung für eine höhere UV-Absorption kann jedoch von einem erhöhten Anteil an falsch gefaltetem Protein herrühren. Da die Konzentration des Proteins durch Quantifizierung der Absorptionsmerkmale beurteilt wurde, kann das Vorhandensein eines Proteins mit einem falsch reifen Chromophor die Absorption erhöhen, während dieser Anteil nicht in die Gesamtkonzentration einbezogen wird (Abbildung 6A,B). Zur Unterstützung dieser Hypothese beobachteten wir, dass der S-Flp-haltige EGFP ein deutlich reduziertes Verhältnis von Chromophor gegenüber kombinierter Tryptophan- und Tyrosinabsorption (_ε(CRO)/ε_(Tyr+Trp) = 0,96) im Vergleich zu einem höheren Wert (1,57) im Elternprotein aufwies (Tabelle 2)⁷⁰. Das Vorhandensein einer nicht-fluoreszierenden Fraktion im S-Flp-haltigen EGFP wird ein wichtiger Faktor bei der weiteren Analyse der Proteineigenschaften sein. In der KillerOrange-Variante, die S-Flp enthielt, wurde eine erhöhte Absorption neben einer Rotverschiebung im Chromophorband beobachtet. Diese Tatsache deutete darauf hin, dass die Chromophorbildung eine Konfiguration mit einer großen Fluoreszenzquantenausbeute begünstigte (Abbildung 6C).

Anschließend analysierten wir die Fluoreszenzspektren der Proteine, die bei Anregung bei den entsprechenden maximalen Absorptionswellenlängen aufgezeichnet wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Spektren für die untersuchten fluoreszierenden Proteinvarianten mit Prolin und Ersatz, S-Flp und Dhp im Wesentlichen identisch blieben. Dieses Ergebnis impliziert, dass die Analoga die chemische Umgebung des Chromophors in keinem Fall verändert haben (Abbildung 6G-I). Trotz dieser Tatsache wurden deutliche Unterschiede in den Fluoreszenzspektren von KillerOrange beobachtet, die bei der Anregung bei 295 nm und damit bei der Tryptophan-Anregung aufgezeichnet wurden. Dieses Experiment verfolgt den Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) oder die direkte exzitonische Kopplung, die zwischen den Tryptophan-Seitenketten und dem reifen Chromophor auftritt, da sich beide in einem kurzen Abstand von nicht mehr als 25 Å befinden. Bei EGFP- und NowGFP-Varianten wurden bei der Messung der Emissionsspektren mit einer Anregung von 295 nm eine starke Chromophoremission neben kaum einer Tryptophanemission beobachtet (Abbildung 6D,E). Die Varianten, die S-Flp enthielten, wiesen jedoch eine etwas größere tryptophanspezifische Emission auf. Diese Beobachtung kann mit einem ungezählten Beitrag des entfalteten Apoproteins in Verbindung gebracht werden, das Tryptophans enthält, aber nicht das reife Chromophor. In KillerOrange wurde eine deutlich erhöhte Tryptophan-spezifische Emission beobachtet, was auf einen Mangel an Fluoreszenzlöschung über den erwarteten Mechanismus der Anregungsenergieübertragung oder der exzitonischen Kopplung hinweist. Die Proteinvarianten, die Prolin und S-Flp enthielten, zeigten eine vergleichbare Tryptophan-Emission neben dem bevorzugten rotverschobenen Fluoreszenzmerkmal einer hohen Quantenausbeute. Im Gegensatz dazu zeigte die Variante, die Dhp enthielt, eine drastische Abnahme der Chromophorfluoreszenzintensität, vermutlich aufgrund geringfügiger struktureller Effekte (Abbildung 6F).

Als nächstes verglichen wir die Faltungseigenschaften der Proteine, indem wir ein Entfaltungs- / Renaturierungsexperiment durchführten. Fluoreszenzemissionsspektren wurden im gefalteten Zustand (Protokollabschnitt 5), nach chemischer Denaturierung und anschließend im Prozess der über einen Zeitraum von 24 h überwachten Refolding (Protokollabschnitt 6) aufgezeichnet. Die Spektren wurden bei Anregung bei beiden relevanten Wellenlängen, 295 nm, und bei den Maxima der Absorptionsspektren der Chromophoren aufgezeichnet, während die resultierende Fluoreszenz als auf den Maximalwert für jedes Protein normalisiert dargestellt wird (Abbildung 7). Am Ende des Protokolls beobachteten wir, dass EGFP-Varianten wieder gefaltet werden konnten, während die NowGFP- und KillerOrange-Varianten - einmal denaturiert - entfaltet blieben (Daten nicht gezeigt). So variierten die Rückfaltungskapazitäten der ursprünglichen Fluoreszenzproteine erheblich. Bemerkenswert ist, dass KillerOrange als Photosensibilisator ab der Hydrozoen-Chromoproteinvariante KillerRed^65,71 entwickelt wurde und seine Umfaltung trotz der robusten ^{β-Barrel-Struktur} typischerweise hinterherhinkt. In unseren Experimenten fanden wir heraus, dass sich die Wildtyp-EGFP-Chromophorfluoreszenz nur teilweise erholte, obwohl die Tryptophan-spezifische Fluoreszenz nach der Renaturierung größer war (Abbildung 7A, D). Im Wesentlichen wurde ein ähnliches Verhalten in der Variante beobachtet, die Dhp enthielt (Abbildung 7C,F). Bei S-Flp-haltigem EGFP wurde ein ähnliches Ergebnis beobachtet, wenn die Anregung bei der Tryptophan-spezifischen Wellenlänge von 295 nm durchgeführt wurde (Abbildung 7B). Auffallend ist, dass sich die Fluoreszenz in einem viel höheren Ausmaß erholte, wenn der Chromophor bei 488 nm angeregt wurde (Abbildung 7E). Es scheint, dass S-Flp im Vergleich zu den anderen beiden Varianten eine viel bessere Ausbeute an Nachfalten induziert. Dieser positive Effekt wurde jedoch bei Verwendung einer 295-nm-Anregung aufgrund unbekannter molekularer Wechselwirkungen nicht beobachtet.

Anschließend wurde die Refaltungsgeschwindigkeit überwacht, indem die Fluoreszenz sowohl von Tryptophan als auch von Chromophor getrennt aufgezeichnet wurde, während der Endpunkt des Prozesses bei 24 h nach Beginn der Renaturierung bestimmt wurde. Nur EGFP-Varianten zeigten eine relativ schnelle Refolding-Kinetik, die zuverlässig ausgewertet werden konnte, während sich keine der denaturierten NowGFP- und KillerOrange-Varianten auf einen Wert erholen konnte, der weitere quantitative Messungen ermöglichte. Im EGFP war die Tryptophan-Emissionsrückgewinnung doppelt so schnell (abgeschlossen in 750 s) im Vergleich zur Rückgewinnung der Chromophoremission (abgeschlossen in 1.500 s), was auf die Komplexität der zugrunde liegenden Prozesse hinweist (Abbildung 8). Bei beiden Anregungswellenlängen war die Rückfaltungsrate durch das Vorhandensein von S-Flp erhöht, in Übereinstimmung mit Literaturdaten²⁵. Gleichzeitig zeigte die Dhp-haltige Variante ein Umfaltungsprofil ähnlich dem Wildtyp.

Abbildung 1: Strukturgerüst für grün fluoreszierendes Protein (GFP), Chromophorbildung, Prolinkonformationsübergänge und synthetische Analoga, die in dieser Studie verwendet wurden. (A) Die Struktur von GFP besteht aus den β-Strängen, die einen nahezu perfekten Lauf bilden (d. h. eine "Dose" mit den Abmessungen 4,2 nm x 2,4 nm), die an beiden Enden durch α-spiralförmige Deckel verschlossen ist. Das 27-kDa-GFP-Protein zeigt eine tertiäre Struktur, die aus elf β-Strängen, zwei kurzen α-Helices und dem Chromophor in der Mitte besteht. Die Konformationszustände benachbarter Proline sind mit der Chromophorbildung verbunden. (B ) Die autokatalytische Reifung (Kondensation) des Chromophors erfolgt an den Resten Ser65, Tyr66 und Gly67 und verläuft in mehreren Schritten: Erstens Torsionsanpassungen im Polypeptid-Rückgrat, um den Carboxylkohlenstoff von Thr65 in die Nähe des Amidstickstoffs von Gly67 zu bringen. Dann erfolgt die Bildung eines heterocyclischen Imidazolin-5-on-Ringsystems bei nukleophilem Angriff auf dieses Kohlenstoffatom durch den Amidstickstoff von Glycin und anschließender Dehydratisierung. Schließlich gewinnt das System sichtbare Fluoreszenz, wenn die Oxidation der Tyrosin-alpha-beta-Kohlenstoffbindung durch molekularen Sauerstoff zur Erweiterung des konjugierten Systems des Imidazolin-Ringsystems führt, am Ende einschließlich des Tyrosin-Phenylrings und seines Para-Sauerstoff-Substituenten. Das resultierende Para-Hydroxybenzyliden-Imidazolinon-Chromophor in der Mitte des β-Zylinders wird vollständig vom Bulk-Lösungsmittel getrennt. (C ) Die Skelettstrukturformeln und -geometrien von 1) dem Prolinring (Pucker) und 2) der vorhergehenden Amidbindung stellen die wichtigsten Konformationsübergänge des Prolinrests dar. (D) Die in dieser Arbeit verwendeten Prolin-Analoga arbeiten mit den bezeichneten Prolin-Ring-Puckern. Die Figur wurde mit ChemDraw und Discovery Studio Visualizer generiert. Die GFP-Struktur stammt aus dem PDB-Struktureintrag 2Q6P. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Fluoreszierende Proteine, die in dieser Studie verwendet wurden. Die Panels zeigen die Banddarstellung der typischen β-Barrel-Strukturen von drei verschiedenen Varianten fluoreszierender Proteine: EGFP, NowGFP und KillerOrange, wobei die Bandfarbe die Farbe der Fluoreszenzemission jeder Variante darstellt. Prolinrückstände (Ein-Buchstaben-Code) werden als Sticks hervorgehoben und die entsprechenden Positionen annotiert. Chromophore sind mit anfänglicher Aminosäurezusammensetzung fett gedruckt. Alle Strukturdarstellungen wurden mit PyMol basierend auf den folgenden PDB-Struktureinträgen erstellt: 2Q6P für EGFP, 4RYS für NowGFP, 4ZFS für KillerOrange. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Flussdiagrammdarstellung der SPI-Methode zur rückstandsspezifischen Einarbeitung von nicht-kanonischen Prolinanaloga. Ein prolin-auxotropher Escherichia coli (E. coli) Wirtsstamm, der das Gen von Interesse auf einem Expressionsplasmid trägt, wird in einem definierten Minimalmedium mit allen 20 kanonischen Aminosäuren gezüchtet, bis ein OD₆₀₀ von ~0,7 erreicht ist, an dem sich die Zellkultur in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase befindet. Die Zellen werden geerntet und in frisches Minimalmedium übertragen, das 19 kanonische Aminosäuren und ein Prolinanalogon enthält. Nach der Zugabe eines Induktors wird die Proteinexpression über Nacht durchgeführt. Schließlich wird das Zielprotein durch Zelllyse isoliert und vor der weiteren Analyse gereinigt. In einer Variation des Protokolls werden die Zellen in einem definierten Minimalmedium mit 19 kanonischen Aminosäuren gezüchtet, und Prolin wird in einer begrenzten Menge (z. B. ein Fünftel der Konzentration der anderen Aminosäuren) hinzugefügt. Durch dieses Maß erschöpfen die Zellen Prolin im Medium, bevor sie die logarithmische Wachstumsphase verlassen können, und dann wird anschließend das Analogon hinzugefügt und das Protein von Interesse wird induziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Expressionsanalyse von EGFP-, NowGFP- und KillerOrange-Varianten. (A) Zellpellets aus 1 ml Expressionskultur, normalisiert auf OD₆₀₀ = 2. SDS-SEITEN-Analyse von (B) EGFP-, (C) NowGFP- und (D) KillerOrange-Varianten. Lösliche (S) und unlösliche Fraktionen (I) jedes fluoreszierenden Proteinderivats wurden auf 15% Acrylamidgel geladen, sowie eluierte Fraktionen (E) aus IMAC von löslichen Proteinen. PageRuler Unstained Protein Ladder wurde als Marker (M) in den mit (M) gekennzeichneten Bahnen verwendet. Die erwarteten Regionen des jeweiligen Proteins werden eingerahmt. Eingearbeitete Aminosäuren an Prolinpositionen sind Pro, R-Flp, S-Flp und Dhp (in (A) Zellpellets aus fluoreszierenden Proteinvarianten mit Dfp anstelle von Dhp sind gezeigt). Die Gele wurden mit 1% (w/v) Coomassie Brillant Blue gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Massenspektrometrische Analyse fluoreszierender Proteinvarianten. (A) Repräsentative dekonvolutierte ESI-MS-Spektren von H 6-markiertem EGFP (schwarz), S-Flp-EGFP (orange) und Dhp-EGFP (cyan), wobei die Position der Hauptmassenspitzen als Zahlen (in Da) angegeben ist. Die berechneten Molekülmassen [M+H^]+ der H_6-markierten Proteine sind: Für EGFP 27,745,33 Da (beobachtet 27,746,15 Da); für S-FLP-EGFP 27 925,33 Da (beobachtet 27 925,73 Da); für Dhp-EGFP 27,725,33 Da (beobachtet 27,726,01 Da). (B) Repräsentative dekonvolutierte ESI-MS-Spektren von H 6-markierten NowGFP (schwarz), S-Flp-NowGFP (orange) und Dhp-NowGFP (cyan), wobei die Position der Hauptmassenspitzen als Zahlen (in Da) angegeben ist. Die berechneten Massen der H_6-markierten Proteine sind: Für jetzt GFP 27.931,50 Da (beobachtet 27.946,46 Da; der Unterschied von ~ 16 Da ist wahrscheinlich auf die Oxidation eines Methionins im Protein zurückzuführen); für S-FLP-NowGFP 28,129,50 Da (beobachtet 28,130,08 da); für Dhp-NowGFP 27,909,50 Da (beobachtet 27,910,22 Da). (C) Repräsentative dekonvolutierte ESI-MS-Spektren von H 6-markierten KillerOrange (schwarz), S-Flp-KillerOrange (orange) und Dhp-KillerOrange (cyan) mit der Position der Hauptmassenspitzen als Zahlen (in Da). Die berechneten Massen der H_6-markierten Proteine sind: Für KillerOrange 27,606,09 Da (beobachtet 27,605,91 Da); für S-FLP-KillerOrange 27,876.09 Da (beobachtet 27,876.08 da); für Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da (beobachtet 27,575.93 da). Abweichungen zwischen den beobachteten und berechneten Molekülmassen von etwa 1 Da liegen im Fehlerbereich der ESI-MS-Geräte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Lichtabsorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren fluoreszierender Proteinvarianten. Normalisierte UV-Vis-Absorptionsspektren werden für die Varianten (A) von EGFP, (B) von NowGFP und (C) von KillerOrange gezeigt. Spektren wurden auf das Maximum der Chromophor-Absorption (etwa 500 nm) normalisiert. Normalisierte Fluoreszenzemissionsspektren werden der Varianten (D,G) von EGFP, (E,H) von NowGFP und (F,I) von KillerOrange gezeigt. Spektren in (D,E,F) wurden bei Anregung mit ultraviolettem Licht (295 nm) gemessen, für die Spektren in (G,H,I) 488 nm, 493 nm und 510 nm Licht wurden für die Anregung verwendet, und die Spektren wurden auf die jeweiligen Maxima der Chromophoremission (etwa 500 nm) normalisiert. In jedem Panel entsprechen schwarze Kurven den Spektren der fluoreszierenden Proteinvariante mit nativem Prolin, orangefarbene Kurven zeigen die Spektren von S-Flp-substituierten Proteinen an und blaue Kurven entsprechen Dhp-substituierten Proteinen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Fluoreszenzemissionsspektren von EGFP-Varianten in Refolding-Experimenten. Normalisierte Fluoreszenzemissionsspektren von 0,3 μM-Lösungen fluoreszierender Proteinvarianten im nativen Zustand und nach Denaturierung und Rückfaltung: Spektren in (A,B,C) wurden bei Anregung mit ultraviolettem Licht (295 nm) (A) für EGFP, (B) für S-Flp-EGFP und (C) für Dhp-EGFP gemessen. Spektren in (D,E,F) wurden bei Anregung mit grünem Licht (488 nm) (D) für EFGP, (E) für S-Flp-EGFP und (F) für Dhp-EGFP gemessen. Die Emissionsspektren der nativen (schwarze Kurven) und gefalteten Proben (grün entspricht EGFP, orange für S-Flp-EGFP bzw. blau für Dhp-EGFP) jeder Proteinvariante werden auf die maximale Fluoreszenz des entsprechenden nativen Zustands normiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Überwachung der Proteinfaltung und Chromophorreifung von EGFP-Varianten mit Fluoreszenz. (A) Fluoreszenzemission im Bereich der Trp-Fluoreszenz (Emission wurde auf 330 nm festgelegt), aufgezeichnet bei Anregung mit ultraviolettem Licht (295 nm). (B) Entwicklung der Fluoreszenzamplitude im Bereich der Chromophoremission bei Anregung mit grünem Licht (488 nm). Die zeitabhängigen Fluoreszenzspuren wurden auf Einheit (100%) entsprechend der am Ende des Überwachungsintervalls erreichten Fluoreszenzamplitude normalisiert. In jedem Panel entsprechen schwarze Kurven den Spektren der fluoreszierenden Proteinvariante mit nativem Prolin, orangefarbene Kurven zeigen die Spektren von S-Flp-substituierten Proteinen und blaue Kurven entsprechen Dhp-substituierten Proteinen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Bauen	Aminosäuresequenzen (6xSein Tag unterstrichen):
EGFP-H6	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFP	MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK MSLKFICTTGKLPVPWPTLTTTTTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrange	MRGSHHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHSVPRITSAIGSDQD

Tabelle 1: Primärstrukturen der Zielproteine. Seine Tags werden in jeder Sequenz unterstrichen.

λ [nm]	ε [M-1·cm-1] (EGFP)	ε [M-1·cm-1] (S-FLP-EGFP)	ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)	31.657 (± 1.341)	22.950 (± 290)	27.800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)	20.116 (± 172)	23.800 (± 715)	17.300 (± 554)
Werte für den Extinktionskoeffizienten ε (in M-1·cm-1) werden aus aufgezeichneten UV-Vis-Absorptionsspektren geeigneter EGFP-Varianten unter Verwendung bekannter Proteinkonzentrationen berechnet. Die gewählte Wellenlänge bei 280 nm entspricht der maximalen Absorption von aromatischen Rückständen, Tyrosin und Tryptophan, und 488 nm stellt die Wellenlänge der Chromophorabsorption dar.

Tabelle 2: Extinktionskoeffizienten (ε) von EGFP-Varianten bei ausgewählten Wellenlängen. Die Werte für den Extinktionskoeffizienten ε (in M-1·^cm-1) werden aus aufgezeichneten UV-Vis-Absorptionsspektren geeigneter ^{EGFP-Varianten} unter Verwendung bekannter Proteinkonzentrationen berechnet. Die gewählte Wellenlänge von 280 nm entspricht der maximalen Absorption von aromatischen Resten, Tyrosin und Tryptophan, während 488 nm die maximale Chromophor-Absorptionswellenlänge darstellt.

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Diskussion

In der Natur treten typischerweise Manipulationen mit Proteinstrukturen und -funktionen aufgrund von Mutationen auf, dem Phänomen, das zu einem Austausch einer Aminosäureidentität an bestimmten Positionen in der Proteinsequenz führt. Dieser natürliche Mechanismus wird weithin als biotechnologische Methode für das Protein-Engineering in Form von Mutagenese angewendet und stützt sich auf das Repertoire der 20 kanonischen Aminosäuren, die an dem Prozess beteiligt sind. Der Austausch von Prolinresten ist jedoch problematisch. Aufgrund seiner speziellen Backbone-Gruppenarchitektur ist es kaum austauschbar mit den verbleibenden 19 Rückständen für den Ersatz⁷². Zum Beispiel ist Prolin typischerweise als sekundärer Strukturbrecher in Polypeptidsequenzen bekannt, da es schlecht mit den häufigsten Sekundärstrukturen, d.h. α-Helix und β-Stränge, kompatibel ist. Diese Prolin-Eigenschaft geht leicht verloren, wenn der Rest zu einer anderen Aminosäure aus dem gemeinsamen Repertoire mutiert wird. Der Ersatz von Prolin durch seine chemischen Analoga bietet einen alternativen Ansatz, der es ermöglicht, die grundlegenden Rückgratmerkmale des Elternprolinrests beizubehalten, während er seine spezifischen Konformationsübergänge verzerrt oder Modulationen des molekularen Volumens und der Polarität erzeugt. Beispielsweise ist es möglich, Bakterienkulturen mit analogen Strukturen wie Hydroxy-, Fluor-, Alkyl-, Dehydroprolinen, Strukturen mit variablen Ringgrößen und mehr zu versorgen und so die Produktion eines Proteins zu erleichtern, das spezifische Prolinrestveränderungen enthält.

Die in dieser Studie beschriebene SPI-Methode (Selective Pressure Incorporation) ermöglicht einen globalen, d.h. rückstandsspezifischen Ersatz aller Proline im Zielprotein durch verwandte chemische Analoga. Die Bedeutung der Methode spiegelt sich in der Tatsache wider, dass SPI die Erstellung von Sequenzänderungen ermöglicht, die für gängige Mutagenesetechniken unzugänglich sind. Zum Beispiel ermöglicht es die Produktion eines Zielproteins, das eher kleine strukturelle Veränderungen enthält, die typischerweise einen oder zwei Atomersatz / -deletionen / -zusätze nicht überschreiten können, wie in dieser Studie gezeigt. Solche Proteinmodifikationen werden als "atomare Mutationen" ^{bezeichnet73,74}. In einem fluoreszierenden Protein wie GFP kann das Ergebnis dieses molekularen Eindringens in der Faltungsgeschwindigkeit, den lokalen Polaritäten, der Proteinpackung und der Stabilität der beteiligten Strukturmerkmale gesehen werden. Die Veränderungen der Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften werden indirekt durch den Einfluss auf Proteinfaltungs- und Rückstandsmikroumgebungen erzeugt. Die Präzision der molekularen Veränderungen, die von SPI durchgeführt werden, ist typischerweise viel höher als bei Mutationen von Prolinen zu anderen kanonischen Resten, wobei letztere typischerweise schädlich für die Proteinfaltung, -produktion und -isolierung sind.

Als Produktionsmethode nutzt der SPI-Ansatz die Substrattoleranz der Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Tasche gegenüber chemischen Analoga der nativen Aminosäure. Die Synthetase ist für die korrekte Identifizierung der Aminosäurestruktur verantwortlich, während der Einbau in Proteine nachgelagert im Translationsprozess erfolgt. Instrumentell werden die Proteinproduktion, -isolierung und -reinigung in SPI in einer Weise durchgeführt, die für alle anderen rekombinanten Proteinexpressionstechniken typisch ist. Mit einigen Ergänzungen des Protokolls jedoch wie folgt: Prolin, das zum Ersatz bestimmt ist, wird zu Beginn des Fermentationsprozesses bereitgestellt, so dass die Zellen wachsen und ihre intakte Zellmaschinerie entwickeln können. Die Zellkultur darf jedoch nicht die maximale optische Dichte erreichen, um die Zellen in der logarithmischen Phase optimal für die Proteinexpression zu halten. Es gibt zwei Hauptvariationen der SPI-Methode an dieser Stelle. In der ersten wird die Konzentration von Prolin im anfänglichen Wachstumsmedium (einem chemisch definierten Medium) so eingestellt, dass die Erschöpfung von Prolin ohne äußeres Eindringen erfolgt. Die Zellen erschöpfen Prolin im Medium, bevor sie die logarithmische Wachstumsphase verlassen können, und anschließend wird das Analogon hinzugefügt und die Produktion des interessierenden Proteins induziert. In der zweiten Version der Methode werden die Zellen in dem Prolin-haltigen Medium bis zur Mitte ihrer logarithmischen Phase gezüchtet. An dieser Stelle sollten die Zellen herausgenommen und physisch in ein anderes Medium übertragen werden, das nicht mehr Prolin, sondern nur das Analogon enthält, mit anschließender Induktion des interessierenden Proteins. In beiden Versionen werden das analoge und das Proteininduktionsreagenz den vorgezüchteten Zellen zur Verfügung gestellt. Die Isolierung und Aufreinigung des Wildtyp-Proteins erfolgt auf die gleiche Weise wie bei den Varianten. Prinzipiell kann jede verfügbare Pro-auxotrophe Sorte als Ausdruckshost verwendet werden. Dennoch sind Ausdruckstests ratsam, um den am besten geeigneten Host zu identifizieren. Auch Tests verschiedener chemisch definierter Medien können verwendet werden, um die Proteinausbeute zu optimieren.

Es gibt bestimmte Anforderungen an die chemischen Analoga, die für SPI berücksichtigt werden müssen, wie Löslichkeit und Konzentration. Die metabolische Verfügbarkeit und Aufnahme von Aminosäuren hängt von der Anzahl der gelösten Moleküle im Medium ab. Um die Löslichkeit einer bestimmten Verbindung zu erhöhen, können leicht saure oder alkalische Bedingungen gewählt werden. Da die künstlichen Moleküle aufgrund ihrer Zelltoxizität wachstumshemmende Wirkungen hervorrufen können, sollte die Konzentration auf ein Minimum gesenkt werden, um Zellstress^{zu vermeiden 75}.

Eine kleine Schwäche von SPI ist die Abnahme der Inkorporationseffizienz mit einer größeren Anzahl von Positionen, die ausgetauscht werden müssen. Prinzipiell kann eine Reduktion der Aminosäurefrequenz innerhalb des Zielbiomoleküls durch ortsgerichtete Mutagenese dieses Problem lösen. Die strukturellen und funktionellen Eigenschaften eines gewünschten Proteins können jedoch durch die Veränderung der Primärstruktur beeinflusst werden.

Wie bereits erwähnt, ermöglicht SPI einen rückstandsspezifischen Ersatz der kanonischen Aminosäure. Dies bedeutet, dass nicht-kanonische Aminosäuren in jede Position der kanonischen Aminosäure innerhalb des Zielproteins eingefügt werden, einschließlich konservierter Rückstände, die für die Proteinfunktion oder -faltung unerlässlich sind. Alternative Methoden zur standortspezifischen Einbindung sind die einzige Möglichkeit, dieses Problem^{zu überwinden 3}. In den letzten Jahrzehnten wurde die orthogonale Paarmethode entwickelt, die Proteine mit modifizierten Resten an vordefinierten Stellen herstellen kann. Die häufigste Modifikation dieser Methode wird als Stop-Codon-Unterdrückung bezeichnet. Diese Methode basiert auf einem entwickelten orthogonalen Translationssystem für die ortsspezifische Einarbeitung synthetischer Aminosäuren⁷⁶. Mehr als 200 Aminosäuren mit unterschiedlichen Seitenkettenmodifikationen wurden bisher mit diesem Ansatz in Proteine eingebaut⁷⁷. Diese Translationssysteme sind jedoch immer noch nicht für die Insertion von Prolinanaloga in Zielproteine geeignet. Darüber hinaus wird die Leistung der Methode bei geringfügigen Aminosäuremodifikationen als gering angesehen, da eine gewisse Hintergrundpromiskuität der Aminoacyl-tRNA-Synthetase typischerweise in den technischen Translationssystemen verbleibt.

Mit SPI produzierten wir eine Reihe von β-Barrel-fluoreszierenden Proteinvarianten und untersuchten die Ergebnisse des Austauschs von Prolin mit seinen unnatürlichen Analoga. Im Falle des Prolinersatzes mit R-Flp und Dfp wurde vom Expressionswirt ein dysfunktionales Protein produziert. Der Effekt wird wahrscheinlich durch eine Fehlfaltung von Proteinen hervorgerufen. Letzteres könnte von der von R-Flp geförderten C4-Exo-Konformation herrühren,^{die von den} Elternproteinstrukturen^{ungünstig ist 27}. Bei Dfp wird die Fehlfaltung wahrscheinlich durch die verminderte Geschwindigkeit der Trans-to-cis-Peptidbindungsisomerisierung am Prolinrest²⁷ erzeugt. Letzteres gehört bekanntermaßen zu den begrenzenden Schritten im kinetischen Profil der Proteinfaltung, die die β-Barrel-Bildung und die anschließende Chromophorreifung beeinflusst. Tatsächlich führte die Proteinproduktion für beide Aminosäuren, R-Flp und Dfp, zu einem aggregierten und unlöslichen Protein. Folglich konnte keine Chromophorbildung stattfinden, und die Fluoreszenz ging vollständig verloren. Bei S-Flp und Dhp wurde jedoch die richtige Proteinreifung beobachtet, was zu fluoreszierenden Proteinproben für jede Analog/Protein-Kombination führte. Trotz einiger Modulationen der Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften des Proteins blieben diese weitgehend denen der Wildtypproteine ähnlich. Die Wirkung der Aminosäuresubstitution wurde in den Refolding-Kinetik-Studien aufgedeckt. Letzteres zeigte eine schnellere Umfaltung im Falle eines Ersatzes mit S-Flp. Modellstudien haben gezeigt, dass dieser Rückstand eine gewisse Verbesserung der Trans-to-cis-Amid-Rotationsgeschwindigkeit bewirken und zur Bildung ^der C4-Endo-Konformation führen kann. Beide Faktoren werden wahrscheinlich zu den positiven kinetischen Effekten dieses Rückstands in EGFP beitragen. Im Gegensatz dazu produzierte Dhp kinetische Faltungsprofile, die dem Mutterprotein maximal ähnlich waren. Die Vielfalt der Ergebnisse, die durch rein atomare Mutationen in den untersuchten fluoreszierenden Proteinen erzeugt werden, veranschaulicht das Potenzial der SPI-Produktionsmethode bei der Veränderung der Zielproteineigenschaften. Die Proteinveränderungen, die durch Prolinersatz mit den Analoga induziert werden, haben weitere Auswirkungen auf das Engineering der Enzyme^78,79,80 und der Ionenkanäle^81,82 sowie auf das allgemeine Engineering der Proteinstabilität.

Die grundlegende Einschränkung der SPI-Methode ist ihr "Alles-oder-Keine" -Modus beim Austausch von Prolin-Residenzen mit verwandten Analoga. Es wäre von großem Vorteil, genau auswählen zu können, welche Prolinreste durch die Analoga ersetzt werden sollen und welche unverändert bleiben sollen. Derzeit gibt es jedoch keine Technik, die eine so ausgeklügelte Produktion mit einem mikrobiellen Produktionswirt durchführen könnte. Die chemische Synthese der Proteine 83,84 sowie die zellfreie Produktion^85,86 sind die beiden alternativen Methoden, die positionsspezifische Prolinmodifikationen erzeugen können. Dennoch sind sie aufgrund ihrer operativen Komplexität und geringen Produktionsausbeute im Vergleich zur Produktion in lebenden Zellen unterlegen. Bis jetzt bleibt SPI der operationell einfachste und robusteste Ansatz für die Herstellung komplexer Proteine mit atomaren Mutationen. Durch die Einführung unnatürlicher Aminosäureersatzstoffe erlaubt die Methode, Proteineigenschaften gezielt zu modifizieren, wie dies hier durch Veränderungen in der Faltung und Lichtabsorption/-emission von fluoreszierenden Proteinen, die durch Prolinersatz erzeugt werden, veranschaulicht wird.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	VWR	HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642	LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)	Carl Roth	3029.1
Agar-agar	Carl Roth	5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)	Sigma-Aldrich	277908
Ammonium peroxydisulphate (APS)	Carl Roth	9592.2	≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	A4418
Ampicillin sodium salt	Carl Roth	K029
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
Coomassie Brillant Blue R 250	Carl Roth	3862
Copper sulfate (CuSO4)	Carl Roth	CP86.1
D-glucose	Carl Roth	6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Carl Roth	2367.3	≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT)	Carl Roth	6908
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	Carl Roth	P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Carl Roth	X987
DNase I	Sigma-Aldrich	D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)	Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)	10731181	cation exchange resin
Ethanol	Carl Roth	9065.1
Formic acid	VWR	HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865	LC-MS grade required
Glacial acetic acid	Carl Roth	3738.5	100 %, p. a.
Glycerol	Carl Roth	3783
Imidazole	Carl Roth	X998
Hydrogen chlroide (HCl)	Merck	295426
Iron(II) chloride (FeCl2)	Sigma-Aldrich	380024
Isopropanol	Carl Roth	AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Magnesium chloride (MgCl2)	Carl Roth	KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth	8283.2
Manganese chloride (MnCl2)	Sigma-Aldrich	63535
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth	6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
RNase A	Carl Roth	7156
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth	T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)	Carl Roth	0183
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)	Carl Roth	5429
Tryptone	Carl Roth	8952
Yeast extract	Carl Roth	2363
Zinc chloride (ZnCl2)	Sigma-Aldrich	229997
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A8381
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	A0884
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
L-glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2128
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126
L-glycine	Sigma-Aldrich	G7126
L-histidine	Sigma-Aldrich	H8000
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500
(4S)-fluoroproline	Bachem	4033274	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline	Bachem	4033275	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline	Bachem	4003545	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline	Enamine	EN400-17448	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000	Spectrum Medical Industries	Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA	GE Healthcare	HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL	Carl Roth	EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL	Carl Roth	T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL	Carl Roth	T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile)	Carl Roth	TA19
pQE-80L plasmid vector	Qiagen	no longer available	replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83	Addgene	50348	https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83	ATCC	35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL	Fisher Scientific	Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Carl Roth	CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS	Sigma-Aldrich	Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm	with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL	Sigma-Aldrich	Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software	Agilent	MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes	Eppendorf	5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system	GE Healthcare	ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer	Perkin Elmer	LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption	Microfluidics	LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation	Infors HT	Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)	GE Healthcare	P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption	Omnilab	Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182	with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer	Biochrom	ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer	Perkin Elmer	LAMBDA 950 UV/Vis/NIR