Intercambio específico de residuos de prolina por análogos de prolina en proteínas fluorescentes: cómo la "cirugía molecular" de la columna vertebral afecta el plegamiento y la estabilidad

Resumen

Para superar las limitaciones de la mutagénesis clásica dirigida al sitio, se incorporaron análogos de prolina con modificaciones específicas en varias proteínas fluorescentes. Mostramos cómo la sustitución del hidrógeno por flúor o del simple por dobles enlaces en residuos de prolina ("cirugía molecular") afecta a las propiedades fundamentales de las proteínas, incluyendo su plegamiento e interacción con la luz.

Resumen

La sustitución de los residuos de prolina (Pro) en las proteínas por la mutagénesis tradicional dirigida al sitio por cualquiera de los 19 aminoácidos canónicos restantes a menudo es perjudicial para el plegamiento de proteínas y, en particular, la maduración del cromóforo en proteínas fluorescentes verdes y variantes relacionadas. Una alternativa razonable es manipular la traducción de la proteína para que todos los residuos de Pro sean reemplazados específicamente por análogos, un método conocido como incorporación selectiva de presión (SPI). Las modificaciones químicas incorporadas se pueden utilizar como una especie de "cirugía molecular" para diseccionar finamente los cambios medibles o incluso manipular racionalmente las diferentes propiedades de las proteínas. Aquí, el estudio demuestra la utilidad del método SPI para estudiar el papel de las prolinas en la organización de la estructura típica de β-barril de variantes espectrales de la proteína fluorescente verde (GFP) con 10-15 prolinas en su secuencia: proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), NowGFP y KillerOrange. Los residuos Pro están presentes en las secciones de conexión entre β y constituyen las tapas de cierre del andamio del barril, siendo así responsables del aislamiento del cromóforo del agua, es decir, las propiedades de fluorescencia. Los experimentos de incorporación selectiva de presión con (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) y 3,4-dehidroprolina (Dhp) se realizaron utilizando una cepa de E. coli prolina-auxotrófica como huésped de expresión. Encontramos que las proteínas fluorescentes con S-Flp y Dhp son activas (es decir, fluorescentes), mientras que los otros dos análogos (Dfp y R-Flp) produjeron proteínas disfuncionales y mal plegadas. La inspección de los perfiles de absorción UV-Vis y emisión de fluorescencia mostró pocas alteraciones características en las proteínas que contienen análogos Pro. El examen de los perfiles cinéticos de plegamiento en variantes de EGFP mostró un proceso de repliegue acelerado en presencia de S-Flp, mientras que el proceso fue similar al tipo salvaje en la proteína que contiene Dhp. Este estudio muestra la capacidad del método SPI para producir modificaciones sutiles de residuos de proteínas a nivel atómico ("cirugía molecular"), que pueden adoptarse para el estudio de otras proteínas de interés. Ilustra los resultados de los reemplazos de prolina con análogos químicos cercanos en las propiedades de plegamiento y espectroscópicos en la clase de proteínas fluorescentes de barril β.

Introducción

La mutagénesis clásica dirigida al sitio permite la permutación de cualquier secuencia de proteínas codificada por genes existente mediante la manipulación de codones a nivel de ADN. Para estudiar el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, a menudo es deseable reemplazar aminoácidos similares con contrapartes similares. Sin embargo, la mutagénesis proteica tradicional se limita definitivamente a reemplazos estructuralmente similares entre aminoácidos canónicos como Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, que están presentes en el repertorio de código genético estándar. Por otro lado, no existen tales posibilidades para otros aminoácidos canónicos como Trp, Met, His o Pro, que a menudo desempeñan funciones estructurales y funcionales esenciales en las proteínas¹. Un enfoque ideal para estudiar estas interacciones en el contexto de la arquitectura interna altamente específica de las proteínas y su proceso de plegamiento es generar modificaciones isotéricas no disruptivas. De hecho, cuando los análogos de aminoácidos isostéricos de estos aminoácidos canónicos, también conocidos como aminoácidos no canónicos (ncAA), se insertan en las proteínas, permiten cambios sutiles incluso a nivel de átomos individuales o grupos atómicos como H / F, CH₂ / S / Se / Te conocidos como "mutaciones atómicas"². Dicha "cirugía molecular" produce proteínas alteradas cuyas propiedades resultan únicamente del intercambio de átomos individuales o grupos de átomos, que en casos favorables pueden ser analizados, y los cambios detectados pueden ser racionalizados. De esta manera, el alcance de la síntesis de proteínas para estudiar el plegamiento y la estructura de las proteínas se extiende mucho más allá de la mutagénesis clásica del ADN. Tenga en cuenta que las proteínas generadas por la mutagénesis dirigida al sitio generalmente se denominan "mutantes", mientras que las proteínas con aminoácidos canónicos sustituidos se denominan "variantes" ³, "aloproteínas"⁴ o "congéneres de proteínas"⁵.

La proteína verde fluorescente (GFP), identificada por primera vez en el organismo marino Aequorea victoria, exhibe fluorescencia verde brillante cuando se expone a la luz ultravioleta a azul ^6,7. Hoy en día, GFP se utiliza comúnmente como una herramienta de etiquetado altamente sensible para la visualización rutinaria de la expresión génica y la localización de proteínas en las células a través de la microscopía fluorescente. GFP también ha demostrado ser útil en varios estudios biofísicos ^8,9,10 y biomédicos ^11,12, así como en ingeniería de proteínas 13,14,15. El análisis riguroso de la estructura GFP permitió la creación de numerosas variantes caracterizadas por una estabilidad variada y fluorescencia máxima^16,17. La mayoría de las variantes de GFP utilizadas en biología celular y molecular son proteínas monoméricas tanto en solución como en el cristal¹⁸. Su organización estructural principal es típica de todos los miembros de la familia GFP, independientemente de su origen filogenético, y consiste en 11 hebras β que forman un llamado β-barril, mientras que una α-hélice torcida corre por el centro del barril y lleva el cromóforo (Figura 1A). La maduración autocatalítica del cromóforo (Figura 1B) requiere el posicionamiento preciso de las cadenas laterales que lo rodean en el lugar central de la proteína; muchas de estas cadenas laterales están muy conservadas en otras variantes de GFP¹⁹. En la mayoría de las proteínas fluorescentes de medusas como Aequorea victoria, el cromóforo emisor de verde consiste en dos anillos aromáticos, incluido un anillo de fenol de Tyr66 y la estructura heterocíclica de cinco miembros de imidazolinona (Figura 1B). El cromóforo, cuando está correctamente incrustado en la matriz proteica, es responsable de la fluorescencia característica de toda la proteína. Se encuentra en el centro de la estructura, mientras que la estructura del barril lo aísla del medio acuoso²⁰. La exposición del cromóforo al agua a granel daría lugar a un enfriamiento de la fluorescencia, es decir, pérdida de fluorescencia²¹.

El plegado adecuado de la estructura en forma de barril es esencial para proteger el cromóforo contra el enfriamiento por fluorescencia²². Los residuos de prolina (Pro) desempeñan un papel especial en la organización estructural de GFP²³. Al no poder soportar una cadena de β, constituyen bucles de conexión responsables de mantener la estructura de la proteína en su conjunto. No es sorprendente que se encuentren residuos de 10-15 prolina en los GFP derivados de Aequorea y Anthoathecata; algunos de ellos están altamente conservados en otros tipos de proteínas fluorescentes β barril. Se espera que las prolinas influyan críticamente en las propiedades de plegamiento debido a sus características geométricas peculiares. Por ejemplo, en los GFP derivados de Aequorea, de los diez residuos de prolina (Figura 2A), nueve forman trans- y solo uno forma un enlace cis-peptídico (Pro89). Pro58 es esencial, es decir, no intercambiable con el resto de los 19 aminoácidos canónicos. Este residuo puede ser responsable del posicionamiento correcto del residuo Trp57, que se ha informado que es crucial para la maduración del cromóforo y el plegamiento general de GFP²⁴. El fragmento PVPWP con tres residuos de prolina (Pro54, Pro56, Pro58) y Trp57 es la parte esencial del "párpado inferior" en la estructura GFP de la Figura 1A. El motivo estructural PVPWP se encuentra en varias proteínas como los citocromos y los canales de potasio activados por voltaje eucariota²⁵. Las sustituciones de prolina a alanina en las posiciones 75 y 89 también son perjudiciales para la expresión y el plegamiento de proteínas y abolen la maduración del cromóforo. Pro75 y Pro89 son parte del "párpado superior" que entierra el cromóforo (Figura 1A) y se conservan a través de proteínas fluorescentes de 11 hebras β barril²³. Estas dos "tapas" mantienen el cromóforo excluido del disolvente acuoso, incluso cuando la estructura terciaria estable se ha roto parcialmente²⁶. Tal arquitectura molecular específica protege el fluoróforo del enfriamiento de fluorescencia colisional (dinámica), por ejemplo, por agua, oxígeno u otros ligandos difusibles.

Para realizar la ingeniería molecular de la estructura GFP, se deben introducir sustituciones de aminoácidos en la estructura primaria de la proteína. Se han realizado numerosas mutaciones en GFP, proporcionando variantes con estabilidad elevada, plegamiento rápido y confiable, y propiedades de fluorescencia variable¹⁷. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la mutación de los residuos de prolina se considera un enfoque arriesgado debido al hecho de que ninguno de los 19 aminoácidos canónicos restantes puede restaurar adecuadamente el perfil conformacional del residuo de prolina²⁷. Por lo tanto, se ha desarrollado un enfoque alternativo, en el que los residuos de prolina se reemplazan con otras estructuras basadas en prolina, denominadas análogos de prolina²⁸. Debido a su estructura química cíclica única, la prolina exhibe dos transiciones conformacionales características (Figura 1C): 1) el fruncido del anillo de prolina, un proceso rápido que implica la organización de la columna vertebral, que afecta principalmente el ángulo de torsión φ, y 2) la isomerización cis / trans del enlace peptídico, un proceso lento que afecta el plegamiento de la columna vertebral a través de los ángulos de torsión ω. Debido a su naturaleza lenta, esta última transición es comúnmente responsable de los pasos limitantes de velocidad en el proceso de plegamiento de toda la proteína. Se ha demostrado anteriormente que la isomerización cis/trans de enlace peptídico alrededor de algunos residuos de prolina presenta pasos lentos en el plegamiento de las variantes de GFP. Por ejemplo, la formación del enlace cis-peptídico en Pro89 presenta el paso lento en el proceso de plegamiento porque se basa en la transición del enlace de trans a cis²⁹. Se puede lograr un repliegue más rápido después de reemplazar Pro89 con un bucle de péptido totalmente trans, es decir, aboliendo un evento de isomerización cis-to-trans³⁰. Además de la isomerización cis/trans, las transiciones de fruncido también pueden generar cambios profundos en el plegamiento de la proteína debido a la organización de la columna vertebral y el empaquetamiento dentro del interior de la proteína^27,31.

Las modificaciones químicas resultan en la alteración de las transiciones conformacionales intrínsecas de los residuos de prolina, afectando así la capacidad de la proteína para plegarse. Ciertos análogos de prolina son candidatos particularmente atractivos para la sustitución de prolina en proteínas, ya que permiten la manipulación y el estudio de las propiedades de plegamiento. Por ejemplo, (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) y 3,4-dehidroprolina (Dhp) son cuatro análogos (Figura 1D) que difieren mínimamente de la prolina en términos de volumen molecular y polaridad³². Al mismo tiempo, cada análogo exhibe un fruncido de anillo distinto: S-Flp estabiliza el pucker C^4-endo, R-Flp estabiliza el pucker C 4-exo, Dfp no exhibe ninguna preferencia aparente de pucker, mientras que Dhp abole el fruncido (Figura 1D)³³. Mediante el uso de estos análogos en la estructura de la proteína, se puede manipular con la transición conformacional de los residuos de prolina, y con esto, afectar las propiedades de las variantes GFP resultantes.

En este trabajo, nos propusimos incorporar el conjunto designado de análogos de prolina (Figura 1D) en la estructura de las variantes de GFP utilizando el método de incorporación de presión selectiva (SPI, Figura 3)³⁴. La sustitución de residuos de aminoácidos por sus análogos isoestructurales más cercanos es un concepto biotecnológico aplicado en el diseño de proteínas^35,36. Por lo tanto, los efectos de los análogos de prolina en una proteína modelo ilustran su potencial para servir como herramientas en la ingeniería de proteínas³⁷. La producción de proteínas que contienen análogos deseados se realizó en cepas modificadas de E. coli que no son capaces de producir prolina (prolina-auxotrofia). Por lo tanto, podrían verse obligados a aceptar la sustitución de sustratos en el proceso de biosíntesis de proteínas³⁸. Esta sustitución global de la prolina es posible gracias a la flexibilidad natural del sustrato de las aminoacil-ARNt sintetasas^{endógenas 39}, las enzimas clave que catalizan la esterificación de los ARNt con aminoácidos apropiados⁴⁰. En general, como se describe en la Figura 3, el crecimiento celular se realiza en un medio definido hasta que se alcanza la fase de crecimiento logarítmico medio. En el siguiente paso, el aminoácido a reemplazar se agota intracelularmente del sistema de expresión durante la fermentación y posteriormente se intercambia por el análogo deseado o ncAA. La expresión de proteínas diana se induce entonces para la incorporación de aminoácidos no canónicos específicos de residuos. La sustitución del aminoácido cognado con su análogo ocurre de una manera que abarca todo el proteoma. Aunque este efecto secundario puede tener un impacto negativo en el crecimiento de la cepa huésped, la calidad de la producción de proteínas objetivo no se ve afectada en su mayoría, ya que, en la expresión recombinante, los recursos celulares se dirigen principalmente a la producción de la proteína objetivo^41,42. Por lo tanto, un sistema de expresión inducible y estrictamente regulado y promotores fuertes son cruciales para una alta eficiencia de incorporación⁴³. Nuestro enfoque se basa en la incorporación de múltiples ncAA específicos de residuos en respuesta a codones de sentido (reasignación de codones de sentido), por lo que dentro del gen objetivo, el número de posiciones para la inserción analógica de Pro se puede manipular a través de mutagénesis dirigida al sitio⁴⁴. Un enfoque similar se aplicó en nuestro informe anterior sobre la preparación de péptidos recombinantes con propiedades antimicrobianas⁴⁵. En este trabajo, hemos aplicado el método SPI, que permite que todos los residuos de prolina sean reemplazados por análogos relacionados, para generar proteínas que se espera que posean propiedades fisicoquímicas distintas no presentes en las proteínas sintetizadas con el repertorio canónico de aminoácidos. Al caracterizar el perfil de plegamiento y fluorescencia de las variantes resultantes, nuestro objetivo es mostrar los efectos de las sustituciones atómicas en las variantes de GFP.

Protocolo

1. Introducción de plásmidos de expresión en células pro-auxotróficas competentes de E. coli

1. Mezclar 1 ng de cada plásmido de muestra, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H_6-NowGFP y pQE-80L H_{6-KillerOrange}, con 50 μL de células químicamente competentes o electrocompetentes de la cepa pro-auxotrófica E. coli K12- derivada de JM83 (Addgene #50348, o ATCC #35607) para su transformación por el método de choque térmico o electroporación según los protocolos disponibles^{46, 47}.
   NOTA: El vector de expresión pQE-80L EGFP-H₆ codifica una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) marcada con C-terminalmente 6xHis, los vectores de expresión pQE-80L H 6-NowGFP y pQE-80L H_{6-KillerOrange} codifican una N-terminalmente 6xHis-etiquetada NowGFP 48 o una KillerOrange ⁴⁹ N-terminalmente 6xHis-etiquetada, respectivamente, cada una en una columna vertebral plásmido pQE-80L. Todos los genes diana están bajo el control de un promotor bacteriano T5 regulado por el operador lac. Se utilizó la resistencia a la ampicilina como marcador de selección y colE1 como origen de la replicación. Consulte la Tabla de materiales para obtener más información sobre el plásmido pQE-80L. La E. coli pro-auxotrófica alternativa que se origina en las cepas K-12 y B también se puede usar para la expresión y debe producir resultados similares. La masa molecular calculada de las proteínas de tipo salvaje protonadas individualmente marcadas con H₆ ([M+H]⁺) (después de la maduración del cromóforo) son 27,745.33 Da (EGFP- H₆), 27,931.50 Da (H 6-NowGFP) y 27,606.09 Da (H_{6-KillerOrange}). Las estructuras primarias de las proteínas diana se dan en la Tabla 1 (His-tag subrayado). La glutamina (Q) dentro de la secuencia His-tag de NowGFP se identificó mediante secuenciación de ADN después de la subclonación del ADNc NowGFP recibido de Pletnev et ^al.51 en el plásmido pQE-80L. No impide la purificación de proteínas ni las propiedades de la proteína fluorescente.
2. Recuperar las células en 950 μL de medio SOC a 37 °C durante 1 h.
3. Extienda 50 μL de las células recuperadas en placas medianas de Luria Agar (LA) (ver Material Suplementario) que contienen glucosa (10 g/L) y ampicilina (100 μg/mL).
4. Incubar las placas medianas de LA a 37 °C durante la noche o a 30 °C durante 24 h.

2. Producción de proteínas fluorescentes recombinantes de tipo silvestre (que albergan prolina canónica) y procedimiento para la incorporación selectiva de presión (SPI) para producir proteínas fluorescentes con análogos de prolina (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

1. Cultivo nocturno de la cepa pro-auxotrófica derivada de E. coli K12 JM83 que alberga pQE-80L EGFP- H₆, pQE-80L H 6-NowGFP y pQE-80L H _{6-KillerOrange}
   1. Use una punta de pipeta estéril o un lazo de inoculación para seleccionar una sola colonia de una placa mediana de LA y resuspenda las células en 5 ml de medio de caldo de lisogenia (LB) (ver Material suplementario; que contiene 10 g / L de glucosa, 100 μg / ml de ampicilina) en un tubo de cultivo estéril de poliestireno de 14 ml.
      NOTA: Las colonias recién transformadas se recomiendan para la inoculación. Las células de las placas medianas de LA (a partir de la etapa 2.2.) almacenadas a 4 °C deben utilizarse en unos pocos días.
   2. Cultivar el cultivo celular durante la noche a 37 °C en un agitador orbital a 200-250 rpm.
2. Producción de EGFP-H recombinante₆, H₆-NowGFP y H₆-KillerOrange con prolina nativa y las variantes proteicas correspondientes con análogos de prolina
   1. Inocular 200 mL de medio NMM fresco (7,5 mM (NH₄)₂SO₄, 50 mM K₂HPO₄ y 22 mM KH₂PO₄, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO₄, 20 mM D-glucosa, 1 μg/mL FeCl₂, 1 μg/mL CaCl₂, 10 μg/mL tiamina, 10 μg/mL biotina, 0,01 μg/mL oligoelementos (CuSO₄, ZnCl₂, MnCl₂, (NH₄)₂MoO₄), pH ~7.2) con todos los l-aminoácidos canónicos (50 mg/L); ver Material Complementario) suplementado con 100 μg/ml de ampicilina con 2 ml del cultivo nocturno en un matraz Erlenmeyer de 2-L.
      NOTA: Dependiendo del tipo de proteína, se pueden probar medios de cultivo alternativos como MOPS medio⁵², sales de glucosa-minerales medio⁵³, medio mínimo^{Davis 54}, medio mínimo M9⁵⁵ o GMML⁵⁶ para optimizar el rendimiento de proteínas.
   2. Incubar las células a 37 °C en un agitador orbital a 220 rpm durante ~3 h 30 min.
   3. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) en un espectrofotómetro cada 30 minutos hasta que se alcance un valor de OD₆₀₀ de ~ 0.7.
      NOTA: Para la determinación de OD₆₀₀ en un espectrofotómetro, la cubeta debe tener una longitud de trayectoria de 1 cm. El medio de cultivo correspondiente se utiliza para la medición de referencia ("cero"). El tiempo de incubación hasta que se alcanza un valor de OD₆₀₀ de ~ 0.7 puede depender del volumen de cultivo. 3 h 30 min es un valor aproximado. En una variación del protocolo subpasos 2.2.1-2.2.3., la cultura del subpaso 2.1.2. se utiliza para inocular medio NMMΔPro fresco (ver Material suplementario) suplementado con una concentración limitada de prolina (por ejemplo, 5 mg/L en lugar de 50 mg/L), y las células se cultivan durante la noche a 37 °C en un agitador orbitario a 220 rpm. Al día siguiente, la determinación de OD₆₀₀ se realiza cada 30 min hasta que las diferencias entre las mediciones son inferiores a 0,05. El valor máximo de OD₆₀₀ debe ser de alrededor de 1 (± 0,3). La concentración inicial limitada de prolina se puede ajustar dependiendo de la cepa de expresión y el medio de cultivo (ver Discusión).
   4. Girar hacia abajo la suspensión celular durante 10 min a 3.000 x g y 4 °C.
   5. Decanta suavemente el sobrenadante en residuos.
   6. Paso de lavado: Resuspender las células en 50 ml de medio helado NMMΔAA (sin ningún aminoácido, ver Material suplementario) o NMMΔPro (sin prolina, ver Material suplementario) mediante un pipeteo cuidadoso.
      NOTA: Para este paso de lavado, se puede usar cualquiera de los dos tampones indicados, ya que solo es importante deshacerse de la prolina residual en el medio de incubación.
   7. Separar las células del medio por sedimentación a 4 °C en una centrífuga a 3.000 x g durante 10 min.
   8. Decanta suavemente el sobrenadante en residuos.
   9. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspendir el pellet celular en 200 ml de medio NMMΔPro suplementado con 100 μg / ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 2-L.
      NOTA: La suspensión celular resultante se puede separar en varias muestras de igual volumen para obtener cultivos de inicio idénticos para comparar la expresión de proteínas en presencia de análogos Pro o prolina (por ejemplo, separación en 4 x 50 ml en matraces Erlenmeyer de 100 ml).
   10. Incubar durante 30 min a 37 °C en un agitador orbital a 220 rpm para el agotamiento completo de Pro.
       NOTA: Este paso es fundamental para agotar completamente Pro de las celdas.
   11. Agregue un volumen apropiado de L-prolina o R-Flp, S-Flp, Dfp y Dhp a partir de una solución madre de 50 mM para ajustar la concentración final de 1 mM en la suspensión celular.
       NOTA: Como regla general, las soluciones de stock frescas de 50 mM de derivados Pro o prolina siempre deben prepararse antes de su uso. Solo si la hidrólisis del aminoácido canónico o no canónico particular en una solución acuosa no es una preocupación, también se pueden usar existencias congeladas.
   12. Agregue 0.5 mM IPTG de una solución madre de 1 M para inducir la expresión de proteínas objetivo.
   13. Exprese la proteína objetivo durante la noche (12 h) a 37 °C en un agitador orbital a 220 rpm.
   14. Mida OD₆₀₀ al día siguiente.
       NOTA: La determinación de OD₆₀₀ se realiza para cuantificar la cantidad de células después de la expresión de proteínas. Un valor más bajo de OD₆₀₀ en comparación con el valor medido antes de la etapa de lavado 2.2.3 indica citotoxicidad del aminoácido suministrado. En este caso, el procedimiento debe repetirse con la concentración del aminoácido suministrado minimizada (hasta 0,1 mM).
   15. Centrifugar y recoger las células bacterianas a 5.000 x g y 4 °C durante 10 min y decantar el sobrenadante en residuos.
   16. Paso de lavado: Resuspendir las células mediante un pipeteo cuidadoso en 50 mL de tampón de unión (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM TDT) que contenga 10% de glicerol y transferir la suspensión celular a un tubo de poliestireno cónico de 50 mL.
   17. Centrifugar y recoger las células bacterianas a 5.000 x g y 4 °C durante 10 min y decantar el sobrenadante en residuos.
   18. Guarde el pellet celular en un tubo de poliestireno cónico de 50 ml a -20 °C o -80 °C hasta su uso posterior (purificación de proteínas, véase más adelante).

3. Procedimiento de purificación de muestras de proteínas por cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC)

1. Lisis celular bacteriana
   NOTA: Realice todos los pasos de la lisis celular en hielo o a 4 °C para evitar la degradación de la proteína objetivo.
   1. Descongele el pellet de células bacterianas en hielo o a 4 °C en un tubo de poliestireno cónico de 50 ml durante 10-20 min.
   2. Agregue 10 ml de tampón de unión en frío helado (consulte Material suplementario) y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender el pellet celular.
   3. Añadir 100 μL de 50 mg/ml de lisozima, 100 μL de 1 mg/ml de DNasa I, 100 μL de 1 mg/ml de RNasa A, 30 μL de 1 M MgCl₂. Invierta cuidadosamente la suspensión celular cinco veces y mantenga el tubo cerrado en hielo o a 4 ° C durante 60 min.
      NOTA: La lisozima induce la lisis celular química al interrumpir la pared celular bacteriana.
   4. Sonicar la muestra para la interrupción celular utilizando un homogeneizador de ultrasonido (por ejemplo, 3 veces durante 3 min en un tubo de poliestireno de 50 ml en una mezcla de agua helada, pulso 2 s / pausa 4 s, amplitud del 45%).
      NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar otros métodos de interrupción celular, por ejemplo, homogeneización a alta presión en 20 ciclos a 14,000 psi. Si es necesario, diluya con un tampón de unión (consulte Material suplementario) para alcanzar el volumen mínimo del instrumento. Además, los reactivos de extracción de proteínas se pueden utilizar para la interrupción celular. Consulte la Tabla de materiales para ver ejemplos.
   5. Centrifugadora durante 60 min a 18.000 x g, 4 °C.
   6. Anote el volumen de líquido para el subpaso 3.1.9. y vierta el sobrenadante en un tubo de poliestireno fresco de 50 ml.
   7. Limpie el sobrenadante con un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,45 μm.
   8. Tome una muestra de "lisado" para SDS-PAGE (ver sección 4. a continuación); esto corresponde a la "fracción de proteína soluble", el sobrenadante del subpaso 3.1.6.
   9. Agregue un volumen igual de ddH₂O como se determina en el subpaso 3.1.6. resuspendir los restos celulares con el fin de mantener la misma dilución de las muestras para su posterior análisis SDS-PAGE.
   10. Tomar una muestra de "pellet" para SDS-PAGE (ver sección 4. a continuación); esto corresponde a la "fracción de proteína insoluble", la suspensión de desechos celulares del subpaso 3.1.9.
2. Purificación por cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC)
   NOTA: La purificación de la proteína fluorescente objetivo se puede realizar a 4 °C o a temperatura ambiente (RT). Para esta última opción, espere a que el lisado, la columna y todos los tampones se equilibren en RT para evitar la formación de burbujas de aire debido a la vaporización del aire atrapado en la solución fría al colocarlo en una columna caliente.
   1. Purifique la muestra utilizando una columna IMAC FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas [o rendimiento] preenvasada o autoenvasada de 1 ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante; establecer la presión máxima de la columna en 0,3 MPa y el caudal en 1 ml/min; utilizar tampón de unión (consulte Material suplementario) para el equilibrio de la columna, tampón de lavado (consulte Material complementario) para la etapa de lavado y tampón de elución (consulte Material suplementario) para la elución de proteínas objetivo.
      NOTA: Alternativamente, se puede aplicar un sistema FPLC automatizado para eludir la proteína objetivo con un tampón de elución que ejecuta un gradiente de concentración lineal de imidazol (20-200 mM).
   2. Recolecte y agrupe las fracciones eluidas con proteínas fluorescentes (elija por color verde o naranja visible).
   3. Transfiera las fracciones agrupadas a una membrana de diálisis (corte de peso molecular (MWCO) de 5,000-10,000) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y dialice al menos tres veces contra el tampón de diálisis o el tampón MS (consulte Material suplementario). Por ejemplo, realice diálisis de una muestra de 1 ml tres veces contra 100 ml de tampón durante al menos 2 h cada ronda. Para un protocolo detallado, consulte Budisa et ^al.34.
   4. Prepare una dilución de 1:100 veces de la fracción de elución dializada en tampón PBS (ver Material suplementario).
   5. Registre el espectro de absorbancia de las muestras diluidas en un espectrofotómetro UV-Vis.
   6. Calcular la concentración de proteínas basándose en la ley de Lambert-Beer de la siguiente manera, utilizando los valores bibliográficos de los coeficientes de extinción molar ε en longitud de onda específica (para EGFP a 488 nm ε₄₈₈ = 55.000 ^cm-1· ^M-1, NowGFP a 493 nm ε₄₉₃ = 53.600 ^cm-1· ^M-1, KillerOrange a 514 nm ε₅₁₄ = 22.600 ^cm-1· ^M-1):
      (Ley Lambert-Beer)
      _{proteína c} = concentración de proteína [mg/mL]
      A = absorbancia en longitud de onda específica
      ε = coeficiente de extinción molar en longitud de onda específica [^M-1·^cm-1]
      d = longitud de la trayectoria de la cubeta, aquí 1 cm
      MW = peso molecular de la proteína [g/mol]
      Utilice el tampón de diálisis (consulte Material complementario) para la medición de referencia ("cero").
   7. Tome una muestra de "eluido" para SDS-PAGE (ver sección 4 a continuación), cargue 1-10 μg de proteína (calculado de acuerdo con el paso anterior) por pozo de muestra para geles teñidos de Coomassie Brilliant Blue.
      NOTA: Ajuste las cantidades de muestra de SDS según el método de tinción aplicado y la sensibilidad del tinte si se utilizan compuestos diferentes de Coomassie Brilliant Blue para la tinción de bandas de proteínas.
   8. Congele y almacene la muestra de proteína en tampón de diálisis (ver Material Suplementario) a -80 °C.
      NOTA: Bajo esta condición de almacenamiento, las muestras de proteínas deben ser estables durante al menos 6 meses. Se pueden utilizar espectrofotómetros uv-vis y de fluorescencia de laboratorio alternativos para el registro de espectros de absorción y emisión de fluorescencia de proteínas objetivo. Se pueden aplicar las siguientes longitudes de onda de excitación para las mediciones de emisión de fluorescencia: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) y 510 nm (KillerOrange).

4. Preparación de muestras SDS-PAGE

1. Determinar la absorbancia A a 280 nm (A_{280 nm}) para las muestras "eluido", "lisado" y "pellet" de la sección 3. Ajuste el volumen de la sonda para lograr A_280nm = 2 agregando una cantidad adecuada de tampón de elución (el volumen final de la sonda debe ser de al menos 80 μL).
2. Mezclar la muestra en una proporción de 4:1 (v/v) con 5x tampón de tinte de carga SDS (ver Material suplementario) mediante pipeteo, por ejemplo, 80 μL de la muestra con 20 μL de búfer de carga SDS 5x.
3. Hervir las muestras de SDS a 95 °C durante 5 min en un baño de agua o bloque de calor para desnaturalizar las proteínas.
4. Deje que las muestras se enfríen a RT y gire las sondas a 13,000 x g durante 1 minuto en una microcentrífuga antes de cargarlas en el gel.
5. Utilice 5-10 μL para Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Para más detalles sobre el procedimiento SDS-PAGE, consulte⁵⁷.
   NOTA: Ajuste las cantidades de muestra de SDS según el método de tinción aplicado y la sensibilidad del tinte. El resultado del SDS-PAGE debe verificarse cuidadosamente para garantizar que las muestras contengan más del 95% de la proteína total en una banda correspondiente al peso molecular esperado de la proteína deseada. Para esto, tome una fotografía del gel teñido con Coomassie y compare la intensidad de la banda de proteínas del peso molecular deseado con la intensidad de todas las demás bandas en el carril (si las hay) por densitometría. Para la evaluación densitométrica de las intensidades de banda, se puede utilizar el software ImageJ⁵⁸. Para probar experimentalmente la incorporación de los ncAA deseados en la proteína de interés, se debe realizar un análisis de masa de proteína intacta mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por electropulverización (LC-ESI-TOF-MS) como se describe 59 (consulte la sección^{5 del} protocolo y la Tabla de materiales en ella para equipos ejemplares).

5. Emisión de fluorescencia de variantes proteicas

1. Antes del procedimiento, compruebe el resultado del experimento SDS-PAGE para asegurarse de que la pureza de la muestra es >95% (consulte la NOTA después del paso 4.5).
2. Ajustar las muestras de cada variante de proteína purificada a una concentración de 0,3 μM, tomando como referencia el valor de absorbancia calculado en la longitud de onda apropiada (subpaso 3.2.5.). Asegúrese de que el volumen final aproximado de la muestra sea de 200 μL.
3. Deje que las muestras diluidas se equilibren durante 1 h en RT.
4. Transfiera las muestras a una cubeta de cuarzo de 1 cm y mida un espectro de emisión de fluorescencia de las muestras utilizando un espectrómetro de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) aplicando las siguientes longitudes de onda de excitación: 488 nm (para EGFP), 493 nm (para NowGFP), 510 nm (para KillerOrange).

6. Desnaturalización y repliegue de variantes de EGFP

1. Antes del procedimiento, compruebe el resultado del experimento SDS-PAGE para asegurarse de que la pureza de la muestra es >95% (consulte la NOTA después del paso 4.5).
2. Preparar para cada variante de proteína purificada dos muestras de 2 μL de volumen final a una concentración de 300 μM (véase la determinación de la concentración de proteína en los subpasos 3.2.4-3.2.6).
3. Añadir 18 μL de tampón de PBS 1,11x (ver Material Complementario) que contenga 8,89 M de urea y 5,56 mM de TDT a 2 μL de cada variante de proteína purificada (para obtener 1x PBS que contenga 8 M de urea y 5 mM de TDT) para inducir la desnaturalización.
   NOTA: Para los pasos 6.4-6.6, procese cada muestra por separado.
4. Incubar las muestras durante 5 min a 95 °C.
5. Diluir las muestras de 20 μL 100 veces agregando 1980 μL de 1x PBS (ver Material Suplementario) que contiene 5 mM de TDT para inducir la renaturalización, produciendo una concentración de proteína final de 0,3 μM y transferir inmediatamente 200 μL de las muestras a una cubeta de cuarzo de 1 cm.
   NOTA: Es muy importante trabajar rápido aquí ya que la renaturalización comienza inmediatamente.
6. Inserte la cubeta de cuarzo en un espectrómetro de fluorescencia apropiado (consulte la Tabla de materiales) y supervise el repliegue de proteínas en las muestras adquiriendo un espectro de fluorescencia cada 3 s durante 30 min. Para cada variante de proteína, utilice la excitación por fluorescencia de 295 nm para la primera muestra y la excitación por fluorescencia de 488 nm para la segunda.
7. Transfiera las muestras de repliegue en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, cierre la tapa y almacene las muestras en RT en la oscuridad durante 24 horas para permitir el repliegue completo de las variantes de EGFP.
8. Mida la emisión de fluorescencia de muestras de proteínas replegadas de acuerdo con el paso 6.6 utilizando la misma longitud de onda de excitación que antes para capturar el punto final temporal de la recuperación de fluorescencia.

Resultados

Al comienzo del estudio, seleccionamos tres variantes diferentes de proteínas fluorescentes que comparten la arquitectura GFP principal. La primera proteína seleccionada fue EGFP, que es una variante modificada derivada de la GFP original de la medusa Aequorea victoria que contiene mutaciones Phe64Leu/Ser65Thr. La segunda proteína seleccionada fue NowGFP ^51,60. También es una variante de A. victoria GFP derivada por mutagénesis en varios pasos a través de proteínas fluorescentes precedentes. NowGFP contiene 18 mutaciones en comparación con su predecesor inmediato de la proteína fluorescente "Cerulean"⁶¹. A su vez, la proteína "Cerulean" es un derivado de la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP)^62,63, una proteína previamente seleccionada por evolución dirigida de laboratorio y que contiene un cromóforo a base de triptófano. Tanto EGFP como NowGFP son ampliamente utilizados en biología celular y estudios biofísicos, y contienen diez residuos de prolina conservados en sus estructuras. Además, NowGFP tiene un undécimo residuo de prolina en la posición 230, que apareció debido a la extensa historia de mutación de esta variante proteica. La tercera proteína seleccionada fue la proteína fluorescente KillerOrange^64,65. Es un derivado de la cromoproteína anm2CP del género de hidrozoos Anthoathecata. La secuencia de proteínas contiene 15 residuos de prolina, y el cromóforo se basa en un triptófano en lugar de un residuo de tirosina. Se han reportado estructuras de rayos X de alta resolución para las tres proteínas seleccionadas (Figura 2)51,65,66.

En el primer paso, los análogos de prolina (Figura 1D) se incorporaron en todas las posiciones de prolina de tres proteínas modelo (EGFP, NowGFP y KillerOrange) mediante la incorporación selectiva de presión (SPI, un esquema del procedimiento se da en la Figura 3). Instrumentalmente, se utilizó la cepa prolina-auxotrófica de E. coli K12 JM83⁶⁷ para la expresión de las proteínas en presencia de prolina y análogos (Figura 1D), produciendo proteínas de tipo salvaje y modificadas, respectivamente. Los gránulos de las células que expresan la proteína nativa y las variantes que llevan S-Flp y Dhp tenían el color brillante típico debido al cromóforo intacto, mientras que las variantes que contenían R-Flp y Dfp permanecieron incoloras, lo que indica un plegamiento incorrecto y la deposición de proteína desplegada en los cuerpos de inclusión (Figura 4A). El análisis SDS-PAGE de las muestras expresadas verificó la presencia de proteínas insolubles que contienen R-Flp (Figura 4B-D), lo que impidió nuevas investigaciones. Aunque esto está más allá del alcance del presente estudio, cabe señalar que la solubilidad de las proteínas y los problemas de plegamiento incorrecto pueden aliviarse en cierta medida mediante procedimientos de repliegue in vitro ⁶⁸. En contraste, las proteínas nativas, así como las variantes portadoras de S-Flp y Dhp se encontraron principalmente en las fracciones solubles (Figura 4B-D). El tipo salvaje, así como las variantes que contienen S-Flp y Dhp, podrían aislarse y caracterizarse aún más en estudios de fluorescencia. Las proteínas solubles se purificaron mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), produciendo 20-30 mg/L de volumen de cultivo para EGFP, 60-80 mg para NowGFP y KillerOrange, cuyos rendimientos para proteínas de tipo salvaje y modificadas fueron muy similares. El análisis acoplado a cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) confirmó la identidad y pureza esperadas de los aislados obtenidos de esta manera (Figura 5). En los espectros de masas, cada reemplazo de prolina con S-Flp produjo un desplazamiento de +18 Da por cada residuo de prolina en la secuencia, mientras que para el reemplazo de prolina a Dhp, el cambio fue de -2 Da por residuo.

En el siguiente paso, se registraron espectros de absorción y emisión de luz para analizar los efectos potenciales de la incorporación de análogos de prolina no canónicos en las propiedades espectroscópicas de las proteínas fluorescentes parentales (Figura 6). Los espectros de absorción UV-Vis mostraron una banda típica de alrededor de 280 nm característica para residuos aromáticos, tirosina y triptófano, mientras que la absorbancia del cromóforo se encontró en 488 nm para EGFP y 493 nm para NowGFP (Figura 6A, B). En KillerOrange, la región de absorbancia del cromóforo comprendía dos bandas (Figura 6C), que corresponden a dos posibles estados de configuración y carga del cromóforo complejo. La banda alrededor de 510 nm se conoce como el estado a partir del cual se produce la fluorescencia con un alto rendimiento cuántico^{de 49,65}. En las variantes de reemplazo de prolina, se observó lo siguiente: La incorporación de Dhp no cambió los espectros de absorbancia de EGFP y NowGFP, mientras que S-Flp produjo una absorción UV mejorada. Esto último puede explicarse por las diferencias inducidas en los microambientes de residuos de triptófano, particularmente Trp57 intercalado entre tres S-Flp en el motivo PVPWP (Figura 6A, B)⁶⁹. Una explicación más trivial para una mayor absorción de UV, sin embargo, puede provenir de una mayor fracción de proteína plegada incorrectamente. Dado que la concentración de la proteína se evaluó mediante la cuantificación de las características de absorbancia, la presencia de una proteína con un cromóforo inadecuadamente maduro puede aumentar la absorbancia, mientras que esta fracción no se cuenta en la concentración total (Figura 6A, B). Apoyando esta hipótesis, observamos que el EGFP que contenía S-Flp exhibió una proporción marcadamente reducida de cromóforo versus absorbancia combinada de triptófano y tirosina (ε_(CRO)/ε_(Tyr+Trp) = 0,96) en comparación con un valor más alto (1,57) en la proteína madre (Tabla 2)⁷⁰. La presencia de una fracción no fluorescente en el EGFP que contiene S-Flp será un factor importante que contribuirá a un análisis posterior de las propiedades de la proteína. En la variante KillerOrange que contiene S-Flp, se observó una absorbancia mejorada junto con un desplazamiento al rojo en la banda del cromóforo. Este hecho indicó que la formación de cromóforos favoreció una configuración con un gran rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 6C).

Posteriormente, analizamos los espectros de fluorescencia de las proteínas registradas tras la excitación en las correspondientes longitudes de onda de absorbancia máxima. Los resultados muestran que los espectros permanecieron esencialmente idénticos para las variantes de proteínas fluorescentes examinadas que llevan prolina y reemplazos, S-Flp y Dhp. Este resultado implica que los análogos no alteraron el ambiente químico del cromóforo en ningún caso (Figura 6G-I). A pesar de este hecho, se observaron marcadas diferencias en los espectros de fluorescencia de KillerOrange registrados tras la excitación a 295 nm, por lo tanto, sobre la excitación con triptófano. Este experimento rastrea la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) o el acoplamiento excitónico directo que ocurre entre las cadenas laterales de triptófano y el cromóforo maduro, ya que ambos se encuentran a una corta distancia de no más de 25 Å. Para las variantes EGFP y NowGFP, cuando los espectros de emisión se midieron utilizando excitación de 295 nm, se observó una fuerte emisión de cromóforos junto con casi ninguna emisión de triptófano (Figura 6D, E). Sin embargo, las variantes que contenían S-Flp exhibieron una emisión específica de triptófano ligeramente mayor. Esta observación puede estar relacionada con una contribución incontable de la apoproteína desplegada que contiene triptófanos pero no el cromóforo maduro. Se observó un aumento sustancial de la emisión específica de triptófano en KillerOrange, lo que indica una falta de enfriamiento de fluorescencia a través del mecanismo esperado de transferencia de energía de excitación o acoplamiento excitónico. Las variantes de proteínas que contienen prolina y S-Flp exhibieron una emisión de triptófano comparable junto con la característica de fluorescencia desplazada al rojo favorecida de un alto rendimiento cuántico. En contraste, la variante que contenía Dhp mostró una disminución drástica en la intensidad de fluorescencia del cromóforo, presumiblemente debido a efectos estructurales menores (Figura 6F).

A continuación, comparamos las propiedades de plegamiento de las proteínas mediante la realización de un experimento de despliegue / renaturalización. Los espectros de emisión de fluorescencia se registraron en estado plegado (protocolo sección 5), después de la desnaturalización química y, posteriormente, en el proceso de repliegue monitoreado durante un período de 24 h (protocolo sección 6). Los espectros se registraron tras la excitación en ambas longitudes de onda relevantes, 295 nm, y en los máximos de los espectros de absorbancia de los cromóforos, mientras que la fluorescencia resultante se presenta como normalizada al valor máximo para cada proteína (Figura 7). Al final del protocolo, observamos que las variantes de EGFP podían replegarse, mientras que las variantes NowGFP y KillerOrange, una vez desnaturalizadas, permanecían desplegadas (datos no mostrados). Por lo tanto, las capacidades de repliegue de las proteínas de fluorescencia originales variaron sustancialmente. Cabe destacar que KillerOrange se ha desarrollado como un fotosensibilizador a partir de la variante de cromoproteína hidrozoaria KillerRed ^65,71, y su repliegue generalmente se queda atrás a pesar de la robusta estructura de β barril. En nuestros experimentos, encontramos que la fluorescencia del cromóforo EGFP de tipo salvaje se recuperó solo parcialmente, aunque la fluorescencia específica del triptófano fue mayor después de la renaturalización (Figura 7A, D). Se observó un comportamiento esencialmente similar en la variante que contiene Dhp (Figura 7C, F). En el EGFP que contiene S-Flp, se observó un resultado similar cuando la excitación se realizó en la longitud de onda específica del triptófano de 295 nm (Figura 7B). Sorprendentemente, la fluorescencia se recuperó en una extensión mucho mayor cuando el cromóforo se excitó a 488 nm (Figura 7E). Parece que S-Flp induce un rendimiento mucho mejor de repliegue en comparación con las otras dos variantes. Sin embargo, este efecto beneficioso no se observó cuando se utilizó la excitación de 295 nm debido a interacciones moleculares desconocidas.

Posteriormente, se monitoreó la velocidad de repliegue registrando la fluorescencia tanto del triptófano como del cromóforo, por separado, mientras que el punto final del proceso se determinó a las 24 h después del inicio de la renaturalización. Solo las variantes de EGFP mostraron una cinética de repliegue relativamente rápida que pudo evaluarse de manera confiable, mientras que ninguna de las variantes desnaturalizadas de NowGFP y KillerOrange pudo recuperarse a un valor que permitió mediciones cuantitativas adicionales. En EGFP, la recuperación de la emisión de triptófano fue dos veces más rápida (completada en 750 s) en comparación con la recuperación de la emisión de cromóforos (completada en 1.500 s), lo que indica la complejidad de los procesos subyacentes (Figura 8). En ambas longitudes de onda de excitación, la tasa de repliegue fue elevada por la presencia de S-Flp, de acuerdo con los datos de la literatura²⁵. Al mismo tiempo, la variante que contiene Dhp mostró un perfil de repliegue similar al tipo salvaje.

Figura 1: Andamio estructural de proteína fluorescente verde (GFP), construcción de cromóforos, transiciones conformacionales de prolina y análogos sintéticos utilizados en este estudio. (A) La estructura de GFP consiste en las hebras β que forman un barril casi perfecto (es decir, una "lata" con dimensiones de 4,2 nm x 2,4 nm) que está tapada en ambos extremos por tapas α helicoidales. La proteína GFP de 27 kDa muestra una estructura terciaria que consiste en once hebras β, dos hélices cortas de α y el cromóforo en el medio. Los estados conformacionales de las prolinas adyacentes están vinculados a la formación de cromóforos. (B) La maduración autocatalítica (condensación) del cromóforo ocurre en los residuos Ser65, Tyr66 y Gly67, y procede en varios pasos: Primero, ajustes de torsión en la columna vertebral polipeptídica para acercar el carbono carboxilo de Thr65 al nitrógeno amida de Gly67. Luego, la formación de un sistema de anillo heterocíclico de imidazolina-5-uno ocurre al ataque nucleófilo a este átomo de carbono por el nitrógeno amida de la glicina y la deshidratación posterior. Finalmente, el sistema gana fluorescencia visible cuando la oxidación del enlace de carbono tirosina alfa-beta por oxígeno molecular conduce a la extensión del sistema conjugado del sistema de anillos de imidazolina, al final incluyendo el anillo de fenilo de tirosina y su sustituyente de para-oxígeno. El cromóforo de para-hidroxibencilideno imidazolinona resultante en el centro del barril de β está completamente separado del disolvente a granel. (C) Las fórmulas y geometrías de la estructura esquelética de 1) el anillo de prolina (fruncidos) y 2) el enlace amida anterior representa las principales transiciones conformacionales del residuo de prolina. (D) Los análogos de prolina utilizados en este trabajo con los fruncidos de anillo de prolina designados. La figura se generó utilizando ChemDraw y Discovery Studio Visualizer. La estructura GFP es de la entrada de estructura PDB 2Q6P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Proteínas fluorescentes utilizadas en este estudio. Los paneles muestran la representación de la cinta de las estructuras típicas de β-barril de tres variantes diferentes de proteínas fluorescentes: EGFP, NowGFP y KillerOrange, con el color de la cinta que representa el color de la emisión de fluorescencia de cada variante. Los residuos de prolina (código de una letra) se resaltan como palos y se anotan las posiciones apropiadas. Los cromóforos se muestran con la composición inicial de aminoácidos en negrita. Todas las representaciones de estructura se produjeron con PyMol basándose en las siguientes entradas de estructura PDB: 2Q6P para EGFP, 4RYS para NowGFP, 4ZFS para KillerOrange. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Presentación en diagrama de flujo del método SPI para la incorporación específica de residuos de análogos de prolina no canónicos. Una cepa huésped de Escherichia coli (E. coli) prolina-auxotrófica que lleva el gen de interés en un plásmido de expresión se cultiva en un medio mínimo definido con los 20 aminoácidos canónicos hasta que se alcanza un OD₆₀₀ de ~ 0.7 en el que el cultivo celular se encuentra en la fase de crecimiento logarítmico medio. Las células se cosechan y se transfieren a un medio mínimo fresco que contiene 19 aminoácidos canónicos y un análogo de la prolina. Después de la adición de un inductor, la expresión de proteínas se realiza durante la noche. Finalmente, la proteína diana se aísla mediante lisis celular y se purifica antes de un análisis posterior. En una variación del protocolo, las células se cultivan en un medio mínimo definido con 19 aminoácidos canónicos, y la prolina se agrega en una cantidad limitada (por ejemplo, una quinta parte de la concentración de los otros aminoácidos). Por esta medida, las células agotan la prolina en el medio antes de que puedan salir de la fase de crecimiento logarítmico, y luego, posteriormente, se agrega el análogo y se induce la producción de proteínas de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de expresión de las variantes EGFP, NowGFP y KillerOrange. (A) Pellets celulares de 1 mL de cultivo de expresión, normalizados a OD₆₀₀ = 2. Análisis SDS-PAGE de (B) variantes EGFP, (C) NowGFP y (D) KillerOrange. Las fracciones solubles (S) e insolubles (I) de cada derivado de proteína fluorescente se cargaron en gel de acrilamida al 15%, así como fracciones eluidas (E) de IMAC de proteínas solubles. PageRuler Unstained Protein Ladder se utilizó como marcador (M) en los carriles denotados por (M). Se enmarcan las regiones esperadas de la proteína en particular. Los aminoácidos incorporados en las posiciones de prolina son Pro, R-Flp, S-Flp y Dhp (en (A) se muestran gránulos celulares de variantes de proteínas fluorescentes que incorporan Dfp en lugar de Dhp). Los geles fueron teñidos por 1% (p/v) Coomassie Brillant Blue. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis espectrométrico de masas de variantes de proteínas fluorescentes. (A) Espectros ESI-MS desenrevesados representativos de EGFP (negro), S-Flp-EGFP (naranja) y Dhp-EGFP (cian) etiquetados con la ubicación de los picos de masa principales proporcionados como números (en Da). Las masas moleculares calculadas [M+H]⁺ de las proteínas marcadas con H₆ son: Para EGFP 27,745.33 Da (observadas 27,746,15 Da); para S-Flp-EGFP 27.925,33 Da (observado 27.925,73 Da); para Dhp-EGFP 27,725.33 Da (observado 27,726.01 Da). (B) Espectros ESI-MS descontorneados representativos_{de NowGFP} (negro), S-Flp-NowGFP (naranja) y Dhp-NowGFP (cian) etiquetados con la ubicación de los principales picos de masa proporcionados como números (en Da). Las masas calculadas de las proteínas marcadas con H₆ son: Para NowGFP 27,931.50 Da (observada 27,946.46 Da; la diferencia de ~16 Da es probablemente debido a la oxidación de una metionina en la proteína); para S-Flp-NowGFP 28,129.50 Da (observado 28,130.08 Da); para Dhp-NowGFP 27,909.50 Da (observado 27,910.22 Da). (C) Espectros ESI-MS descontorneados representativos de KillerOrange (negro), S-Flp-KillerOrange (naranja) y Dhp-KillerOrange (cian) etiquetados con la ubicación de los principales picos de masa proporcionados como números (en Da). Las masas calculadas de las proteínas marcadas con H₆ son: Para KillerOrange 27,606.09 Da (observado 27,605.91 Da); para S-Flp-KillerOrange 27,876.09 Da (observado 27,876.08 Da); para Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da (observado 27,575.93 Da). Las desviaciones entre las masas moleculares observadas y calculadas de aproximadamente 1 Da están dentro del rango de error del equipo ESI-MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Espectros de absorción de luz y emisión de fluorescencia de variantes de proteínas fluorescentes. Se muestran espectros de absorción UV-Vis normalizados para las variantes (A) de EGFP, (B) de NowGFP y (C) de KillerOrange. Los espectros se normalizaron hasta el máximo de absorbancia del cromóforo (alrededor de 500 nm). Se muestran espectros de emisión de fluorescencia normalizados de las variantes (D,G) de EGFP, (E,H) de NowGFP y (F,I) de KillerOrange. Los espectros en (D, E, F) se midieron sobre la excitación con luz ultravioleta (295 nm), para los espectros en (G, H, I) 488 nm, 493 nm y 510 nm de luz se utilizaron para la excitación, respectivamente, y los espectros se normalizaron a los máximos respectivos de emisión de cromóforos (alrededor de 500 nm). En cada panel, las curvas negras corresponden a los espectros de la variante de proteína fluorescente con prolina nativa, las curvas naranjas indican los espectros de las proteínas sustituidas por S-Flp y las curvas azules corresponden a las proteínas sustituidas por Dhp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Espectros de emisión de fluorescencia de variantes de EGFP en experimentos de repliegue. Espectros de emisión de fluorescencia normalizados de soluciones de 0,3 μM de variantes de proteínas fluorescentes en estado nativo y después de la desnaturalización y el repliegue: Los espectros en (A, B, C) se midieron en la excitación con luz ultravioleta (295 nm ) (A) para EGFP, (B) para S-Flp-EGFP y (C) para Dhp-EGFP. Los espectros en (D, E, F) se midieron tras la excitación con luz verde (488 nm) (D) para EFGP, (E) para S-Flp-EGFP y (F) para Dhp-EGFP. Los espectros de emisión de las muestras nativas (curvas negras) y replegadas (verde corresponde a EGFP, naranja a S-Flp-EGFP y azul a Dhp-EGFP, respectivamente) de cada variante proteica se normalizan a la fluorescencia máxima del estado nativo apropiado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Monitoreo del plegamiento de proteínas y maduración del cromóforo de variantes de EGFP con fluorescencia. (A) Emisión de fluorescencia en la región de fluorescencia de Trp (la emisión se estableció en 330 nm) registrada tras la excitación con luz ultravioleta (295 nm). (B) Desarrollo de la amplitud de fluorescencia en la región de emisión de cromóforos tras la excitación con luz verde (488 nm). Las trazas de fluorescencia dependientes del tiempo se normalizaron a unidad (100%) de acuerdo con la amplitud de fluorescencia alcanzada al final del intervalo de monitoreo. En cada panel, las curvas negras corresponden a los espectros de la variante de proteína fluorescente con prolina nativa, las curvas naranjas indican los espectros de las proteínas sustituidas por S-Flp y las curvas azules corresponden a las proteínas sustituidas por Dhp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Construir	Secuencias de aminoácidos (etiqueta 6xHis subrayada):
EGFP-H6	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFP	MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGDATYGK MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrange	MRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

Tabla 1: Estructuras primarias de las proteínas diana. Sus etiquetas están subrayadas en cada secuencia.

λ [nm]	ε [M-1·cm-1] (EGFP)	ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)	ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)	31.657 (± 1.341)	22.950 (± 290)	27.800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)	20.116 (± 172)	23.800 (± 715)	17.300 (± 554)
Los valores del coeficiente de extinción ε (en M-1·cm-1) se calculan a partir de los espectros de absorción UV-Vis registrados de variantes apropiadas de EGFP utilizando concentraciones de proteínas conocidas. La longitud de onda seleccionada a 280 nm corresponde a la absorbancia máxima de residuos aromáticos, tirosina y triptófano, y 488 nm representa la longitud de onda de absorbancia del cromóforo.

Tabla 2: Coeficientes de extinción (ε) de variantes de EGFP en longitudes de onda seleccionadas. Los valores para el coeficiente de extinción ε (en ^M-1·^cm-1) se calculan a partir de los espectros de absorción UV-Vis registrados de variantes apropiadas de EGFP utilizando concentraciones de proteínas conocidas. La longitud de onda seleccionada de 280 nm corresponde a la absorbancia máxima de residuos aromáticos, tirosina y triptófano, mientras que 488 nm representa la longitud de onda máxima de absorbancia cromóforo.

Material complementario: Preparación de soluciones de stock y buffers Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En la naturaleza, las manipulaciones con estructuras y funciones de proteínas generalmente ocurren debido a mutaciones, el fenómeno que conduce a un intercambio de una identidad de aminoácido en ciertas posiciones en la secuencia de proteínas. Este mecanismo natural se aplica ampliamente como método biotecnológico para la ingeniería de proteínas en forma de mutagénesis, y se basa en el repertorio de los 20 aminoácidos canónicos involucrados en el proceso. Sin embargo, el intercambio de residuos de prolina es problemático. Debido a su arquitectura especial de grupo troncal, apenas es intercambiable con los 19 residuos restantes para el reemplazo⁷². Por ejemplo, la prolina se conoce típicamente como un rompedor de estructura secundaria en secuencias de polipéptidos debido a su escasa compatibilidad con las estructuras secundarias más comunes, es decir, α-hélice y β-strand. Esta característica de prolina se pierde fácilmente cuando el residuo muta a otro aminoácido del repertorio común. El reemplazo de la prolina con sus análogos químicos ofrece un enfoque alternativo, que permite mantener las características básicas de la columna vertebral del residuo de prolina parental al tiempo que impone sesgos en sus transiciones conformacionales específicas o produce modulaciones del volumen molecular y la polaridad. Por ejemplo, es posible suministrar cultivos bacterianos con estructuras análogas como hidroxi-, fluoro-, alquilo-, dehidroprolinas, estructuras que tienen tamaños de anillo variables y más, facilitando así la producción de una proteína que contiene alteraciones específicas de residuos de prolina.

El método de incorporación selectiva de presión (SPI) descrito en este estudio permite un reemplazo global, es decir, específico de residuos de todas las prolinas en la proteína objetivo con análogos químicos relacionados. La importancia del método se refleja en el hecho de que SPI permite crear cambios de secuencia inaccesibles a las técnicas comunes de mutagénesis. Por ejemplo, permite la producción de una proteína diana que contiene cambios estructurales bastante pequeños que normalmente no pueden exceder uno o dos reemplazos / deleciones / adiciones de átomos, como se demostró en este estudio. Tales modificaciones de proteínas se denominan "mutaciones atómicas"^73,74. En una proteína fluorescente como GFP, el resultado de esta intrusión molecular se puede ver en la velocidad de plegamiento, las polaridades locales, el empaquetamiento de proteínas, la estabilidad de las características estructurales involucradas. Los cambios en las propiedades de absorbancia y fluorescencia se producen indirectamente debido al impacto en el plegamiento de proteínas y los microambientes de residuos. La precisión de los cambios moleculares realizados por SPI es típicamente mucho mayor, en comparación con las mutaciones de prolinas a otros residuos canónicos, siendo estos últimos típicamente perjudiciales para el plegamiento, la producción y el aislamiento de proteínas.

Como método de producción, el enfoque SPI utiliza la tolerancia al sustrato de la bolsa de aminoacil-ARNt sintetasa hacia análogos químicos del aminoácido nativo. La sintetasa es responsable de la correcta identificación de la estructura del aminoácido, mientras que la incorporación a las proteínas se produce aguas abajo en el proceso de traducción. Instrumentalmente, la producción, aislamiento y purificación de proteínas en SPI se realizan de una manera típica para cualquier otra técnica de expresión de proteínas recombinantes; sin embargo, con algunas adiciones al protocolo de la siguiente manera: Prolina, que está destinada al reemplazo, se proporciona al comienzo del proceso de fermentación, de modo que las células pueden crecer y desarrollar su maquinaria celular intacta. Sin embargo, no se permite que el cultivo celular alcance la densidad óptica máxima, para mantener las células en la fase logarítmica óptima para la expresión de proteínas. Hay dos variaciones principales del método SPI en este punto. En el primero, la concentración de prolina se ajusta en el medio de crecimiento inicial (un medio definido químicamente) de modo que el agotamiento de la prolina ocurre sin ninguna intrusión externa. Las células agotan la prolina en el medio antes de que puedan salir de la fase de crecimiento logarítmico, y luego, posteriormente, se agrega el análogo y se induce la producción de proteínas de interés. En la segunda versión del método, las células se cultivan en el medio que contiene prolina hasta la mitad de su fase logarítmica. En este punto, las células deben ser extraídas y transferidas físicamente a otro medio, que ya no contiene prolina, solo el análogo, con la posterior inducción de la proteína de interés. En ambas versiones, el análogo y el reactivo de inducción de proteínas se proporcionan a las células precultivadas. El aislamiento y la purificación de la proteína de tipo salvaje se realizan de la misma manera que para las variantes. En principio, cada cepa pro-auxotrófica disponible se puede utilizar como huésped de expresión. Sin embargo, las pruebas de expresión para identificar el huésped más adecuado son recomendables. Además, se pueden utilizar pruebas de diferentes medios definidos químicamente para optimizar el rendimiento de proteínas.

Hay ciertos requisitos con respecto a los análogos químicos que deben considerarse para SPI, como la solubilidad y la concentración. La disponibilidad metabólica y la absorción de aminoácidos dependen del número de moléculas disueltas en el medio. Para aumentar la solubilidad de un compuesto en particular, se pueden elegir condiciones ligeramente ácidas o alcalinas. Dado que las moléculas artificiales pueden causar efectos inhibidores del crecimiento debido a su toxicidad celular, la concentración debe reducirse al mínimo para evitar el estrés celular⁷⁵.

Una debilidad menor de SPI es la disminución de la eficiencia de incorporación con un mayor número de posiciones que deben intercambiarse. En principio, una reducción de la frecuencia de aminoácidos dentro de la biomolécula objetivo por mutagénesis dirigida al sitio puede resolver este problema. Sin embargo, las propiedades estructurales y funcionales de una proteína deseada podrían verse afectadas por el cambio de la estructura primaria.

Como se mencionó anteriormente, SPI permite el reemplazo específico del residuo del aminoácido canónico. Esto implica que los aminoácidos no canónicos se insertan en cada posición del aminoácido canónico dentro de la proteína objetivo, incluidos los residuos conservados que son indispensables para la función o el plegamiento de la proteína. Los métodos alternativos para la incorporación específica del sitio son la única posibilidad de superar este problema³. En las últimas décadas, se ha desarrollado el método del par ortogonal que puede producir proteínas que contienen residuos modificados en sitios predefinidos. La modificación más común de este método se conoce como supresión de codones de parada. Este método se basa en un sistema de traducción ortogonal diseñado dedicado a la incorporación específica del sitio de aminoácidos sintéticos⁷⁶. Más de 200 aminoácidos con diferentes modificaciones de la cadena lateral se han incorporado a las proteínas hasta la fecha utilizando este enfoque⁷⁷. Sin embargo, estos sistemas de traducción todavía no son adecuados para la inserción de análogos de prolina en proteínas diana. Además, el rendimiento del método se considera bajo en el caso de modificaciones menores de aminoácidos porque cierta promiscuidad de fondo de la aminoacil-ARNt sintetasa generalmente permanece en los sistemas de traducción diseñados.

Usando SPI, producimos una serie de variantes de proteína fluorescente de barril β y estudiamos los resultados del intercambio de prolina con sus análogos no naturales. En el caso del reemplazo de prolina con R-Flp y Dfp, el huésped de expresión produjo una proteína disfuncional. Es probable que el efecto se produzca por el mal plegamiento de proteínas. Este último puede originarse a partir de la conformación C 4-exo promovida por R-Flp, que no es favorecida por las estructuras de proteínas madre²⁷. Con Dfp, es probable que el plegamiento erróneo se produzca por la velocidad disminuida de la isomerización del enlace peptídico trans-a-cis en el residuo de prolina²⁷. Se sabe que este último se encuentra entre los pasos limitantes en el perfil cinético del plegamiento de proteínas que afecta la formación de β barril y la posterior maduración del cromóforo. De hecho, tanto para los aminoácidos, R-Flp y Dfp, la producción de proteínas resultó en una proteína agregada e insoluble. En consecuencia, la formación de cromóforos no pudo ocurrir, y la fluorescencia se perdió por completo. Sin embargo, con S-Flp y Dhp, se observó una maduración adecuada de la proteína, lo que resultó en muestras de proteínas fluorescentes para cada combinación de análogo / proteína. A pesar de algunas modulaciones en las características de absorbancia y fluorescencia de la proteína, estas se mantuvieron en gran medida similares a las de las proteínas de tipo salvaje. El efecto de la sustitución de aminoácidos se reveló en los estudios de cinética de repliegue. Este último mostró un repliegue más rápido en el caso de reemplazo con S-Flp. Los estudios del modelo han demostrado que este residuo puede generar cierta mejora en la velocidad de rotación de la amida trans-a-cis y conducir a la formación de la conformación C ^4-endo. Es probable que ambos factores contribuyan a los efectos cinéticos beneficiosos de este residuo en EGFP. En contraste, Dhp produjo perfiles cinéticos de plegamiento máximamente similares a la proteína madre. La diversidad de los resultados producidos por meras mutaciones atómicas en las proteínas fluorescentes examinadas ilustra el potencial del método de producción spi para alterar las propiedades de las proteínas diana. Las alteraciones proteicas inducidas por el reemplazo de prolina con los análogos tienen implicaciones adicionales en la ingeniería de las enzimas ^78,79,80 y los canales iónicos ^81,82, así como en la ingeniería general de la estabilidad de las proteínas.

La limitación básica del método SPI es su modo "todo o ninguno" en el intercambio de prolina reside con análogos relacionados. Sería muy ventajoso poder seleccionar con precisión, qué residuos de prolina deben reemplazarse por los análogos y cuáles deben permanecer sin modificar. Sin embargo, en la actualidad, no existe ninguna técnica que pueda realizar una producción tan sofisticada utilizando un huésped de producción microbiana. La síntesis química de proteínas^83,84, así como la producción libre de células^85,86, son los dos métodos alternativos que pueden producir modificaciones de prolina específicas de la posición. Sin embargo, su complejidad operativa y sus bajos rendimientos de producción los hacen inferiores en comparación con la producción en células vivas. A partir de ahora, SPI sigue siendo el enfoque más simple y robusto desde el punto de vista operativo para la producción de proteínas complejas portadoras de mutaciones atómicas. Al introducir sustitutos de aminoácidos no naturales, el método permite modificar las características de las proteínas de una manera específica, como lo ejemplifican aquí las alteraciones en el plegamiento y la absorción / emisión de luz de las proteínas fluorescentes generadas por los reemplazos de prolina.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	VWR	HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642	LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)	Carl Roth	3029.1
Agar-agar	Carl Roth	5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)	Sigma-Aldrich	277908
Ammonium peroxydisulphate (APS)	Carl Roth	9592.2	≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	A4418
Ampicillin sodium salt	Carl Roth	K029
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
Coomassie Brillant Blue R 250	Carl Roth	3862
Copper sulfate (CuSO4)	Carl Roth	CP86.1
D-glucose	Carl Roth	6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Carl Roth	2367.3	≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT)	Carl Roth	6908
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	Carl Roth	P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Carl Roth	X987
DNase I	Sigma-Aldrich	D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form)	Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.)	10731181	cation exchange resin
Ethanol	Carl Roth	9065.1
Formic acid	VWR	HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865	LC-MS grade required
Glacial acetic acid	Carl Roth	3738.5	100 %, p. a.
Glycerol	Carl Roth	3783
Imidazole	Carl Roth	X998
Hydrogen chlroide (HCl)	Merck	295426
Iron(II) chloride (FeCl2)	Sigma-Aldrich	380024
Isopropanol	Carl Roth	AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Magnesium chloride (MgCl2)	Carl Roth	KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth	8283.2
Manganese chloride (MnCl2)	Sigma-Aldrich	63535
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth	6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
RNase A	Carl Roth	7156
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth	T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)	Carl Roth	0183
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)	Carl Roth	5429
Tryptone	Carl Roth	8952
Yeast extract	Carl Roth	2363
Zinc chloride (ZnCl2)	Sigma-Aldrich	229997
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A8381
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	A0884
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
L-glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2128
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126
L-glycine	Sigma-Aldrich	G7126
L-histidine	Sigma-Aldrich	H8000
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500
(4S)-fluoroproline	Bachem	4033274	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline	Bachem	4033275	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline	Bachem	4003545	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline	Enamine	EN400-17448	Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000	Spectrum Medical Industries	Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA	GE Healthcare	HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL	Carl Roth	EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL	Carl Roth	T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL	Carl Roth	T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile)	Carl Roth	TA19
pQE-80L plasmid vector	Qiagen	no longer available	replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83	Addgene	50348	https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83	ATCC	35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL	Fisher Scientific	Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Carl Roth	CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS	Sigma-Aldrich	Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm	with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL	Sigma-Aldrich	Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software	Agilent	MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes	Eppendorf	5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system	GE Healthcare	ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer	Perkin Elmer	LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption	Microfluidics	LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation	Infors HT	Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC)	GE Healthcare	P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption	Omnilab	Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182	with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer	Biochrom	ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer	Perkin Elmer	LAMBDA 950 UV/Vis/NIR