JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول هو وسيلة فعالة وسريعة لزراعة الخمائر والعفن Aspergillus fumigatus من مجموعات كبيرة من عينات التربة في أقل من 7 أيام. يمكن تعديل الطرق بسهولة لاستيعاب مجموعة من وسائط الحضانة ودرجات الحرارة حسب الحاجة للتجارب.

Abstract

تستضيف التربة كمية لا تصدق من الحياة الميكروبية ، حيث يحتوي كل غرام على ما يصل إلى مليارات الخلايا البكتيرية والقديمة والفطرية. تؤدي الفطريات متعددة الخلايا مثل القوالب والفطريات أحادية الخلية ، التي تعرف على نطاق واسع بأنها خمائر ، أدوارا أساسية في النظم الإيكولوجية للتربة كمحللة للمواد العضوية وكمصادر غذائية لسكان التربة الآخرين. يعتمد تنوع الأنواع الفطرية في التربة على العديد من العوامل المناخية مثل هطول الأمطار ودرجة الحرارة ، بالإضافة إلى خصائص التربة بما في ذلك المواد العضوية ودرجة الحموضة والرطوبة. إن الافتقار إلى العينات البيئية الكافية، وخاصة في مناطق آسيا وأفريقيا وأمريكا الجنوبية وأمريكا الوسطى، يعوق توصيف المجتمعات الفطرية في التربة واكتشاف أنواع جديدة.

قمنا بتمييز المجتمعات الفطرية في التربة في تسعة بلدان عبر القارات الست باستخدام حوالي 4000 عينة من التربة وبروتوكول تم تطويره في المختبر لعزل الخمائر والعفن. يبدأ هذا البروتوكول بالتخصيب الانتقائي المنفصل للخمائر والعفن ذي الصلة طبيا Aspergillus fumigatus ، في الوسائط السائلة مع تثبيط نمو البكتيريا. ثم يتم نقل المستعمرات الناتجة إلى وسائط صلبة ومعالجتها للحصول على ثقافات نقية ، تليها التوصيف الجيني في المصب. يتم تحديد هوية أنواع الخميرة من خلال تسلسل منطقة الفواصل المنسوخة الداخلية (ITS) لمجموعة جينات الحمض النووي الريبوسومي النووي الريبوسومي ، في حين يتم استكشاف البنية السكانية العالمية ل A. fumigatus من خلال تحليل علامات الأقمار الصناعية الدقيقة.

تم تطبيق البروتوكول بنجاح لعزل وتوصيف خميرة التربة ومجموعات A. fumigatus في الكاميرون وكندا والصين وكوستاريكا وأيسلندا وبيرو ونيوزيلندا والمملكة العربية السعودية. كشفت هذه النتائج عن رؤى تشتد الحاجة إليها حول الأنماط العالمية في تنوع خميرة التربة ، وكذلك البنية السكانية العالمية وملامح مقاومة مضادات الفطريات ل A. fumigatus. تقدم هذه الورقة طريقة عزل كل من الخمائر و A. fumigatus من عينات التربة الدولية.

Introduction

تلعب الفطريات في النظم الإيكولوجية للتربة أدوارا أساسية في تحلل المواد العضوية ، وتدوير المغذيات ، وتخصيب التربة1. يستخدم كل من النهج المستقلة عن الثقافة (أي التسلسل عالي الإنتاجية) والنهج المعتمدة على الثقافة على نطاق واسع في دراسة فطريات التربة 2,3. وفي حين أن الكم الكبير من البيانات الناتجة عن تسلسل الباركود الفوقي عالي الإنتاجية مفيد لتوضيح الأنماط الواسعة النطاق في بنية المجتمع المحلي وتنوعه، فإن النهج المعتمد على الثقافة يمكن أن يوفر معلومات تكميلية للغاية عن الهياكل التصنيفية والوظيفية للمجتمعات الفطرية، فضلا عن ملامح أكثر تحديدا للكائنات الحية الفردية من خلال التنوع النهائي والتحليلات الوظيفية بسبب توافر الثقافات الفطرية النقية.

على الرغم من أنه نادرا ما يتجاوز آلاف الخلايا لكل غرام من التربة ، فإن الخمائر ، التي تعرف على نطاق واسع بأنها فطريات أحادية الخلية ، هي متحللات أساسية ومصادر غذائية لسكان التربة الآخرين 4,5. في الواقع ، قد تكون الخمائر هي فطريات التربة السائدة في المحيط الحيوي البارد مثل القارة القطبية الجنوبية 6,7. التربة هي أيضا خزان رئيسي للخمائر ذات الصلة طبيا التي تسبب التهابات انتهازية خطيرة في البشر والثدييات الأخرى8. على الرغم من أوجه التشابه المورفولوجية ، فإن أنواع الخميرة متنوعة من الناحية الفيلوجية وتحدث بين الفطريات الخيطية في اثنين من الفيلات الرئيسية ، Ascomycota و Basidiomycota ، داخل المملكة الفطرية9. تفتقر الخمائر إلى توقيع الحمض النووي المحدد في جين الترميز الشريطي الفطري ، وهو منطقة الفاصل الداخلي المنسوخة (ITS) في المجموعة الجينية النووية الريبوسومية RNA10 ، مما يجعلها لا يمكن تمييزها عن الفطريات الأخرى في تحقيقات metagenomics وبالتالي تتطلب استخدام طرق تعتمد على الثقافة لعزل أنواع الخميرة.

تم تنفيذ البروتوكول أدناه لتوصيف مجتمعات خميرة التربة في تسعة بلدان وتحديد الاتجاهات والأنماط العالمية في تنوع خميرة التربة9،11،12. مناهج الميتاجينوميكس محدودة الاستخدام عند دراسة المجموعات المستهدفة من الكائنات الحية مثل الخمائر 2,3. نظرا لتنوعها الجيني ، لا يمكن تمييز الخمائر عن الفطريات الأخرى بناء على تسلسل الحمض النووي وحده. وبالتالي ، فإن دراسة مجموعات الخميرة تتطلب الاستخدام المستمر للعزلة المعتمدة على الثقافة. ومع ذلك ، فإن الزراعة غالبا ما تكون أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب المزيد من الموظفين لإجراء التجارب. لذلك ، تم تحسين البروتوكول وتبسيطه لمعالجة أسرع مع عدد محدود من الموظفين. الميزة الرئيسية للزراعة هي أن أنواع الخميرة المحددة هي خمائر حية وليست ميتة ، وبالتالي من المرجح أن تكون من سكان التربة الحقيقيين بدلا من الخلايا العابرة الموجودة في التربة. تشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 40٪ من الحمض النووي الفطري في التربة إما ملوثات من بيئات أخرى ، أو خارج الخلية ، أو تأتي من خلايا لم تعد سليمة ، مما تسبب في نهج تسلسل عالية الإنتاجية للمبالغة في تقدير الثراء الفطري بنسبة تصل إلى 55٪ 13. يمكن للعزلة المعتمدة على الاستزراع أن تؤكد بسهولة هوية أنواع الخميرة مع فائدة إضافية تتمثل في تأمين الاستزراع النقي لاستخدامها في تحليلات المصب. في الواقع ، تم تحديد الثقافات النقية ل 44 نوعا جديدا من أنواع الخميرة المفترضة باستخدام بروتوكول عزل التربة هذا الذي سمح باستخدام مجموعة من الطرق لدراسة خصائصها التصنيفية والوظيفية بالتفصيل14.

يمكن أيضا استخدام البروتوكول أدناه لعزل القوالب الموجودة داخل التربة ، مثل A. fumigatus. Aspergillus fumigatus هو قالب محب للحرارة و saprophytic مع توزيع عالمي واسع في التربة15. وقد تم عزله من العديد من البيئات السريرية وغير السريرية. تشمل العينات غير السريرية عادة الهواء والحطام العضوي (السماد العضوي وغبار المنشار ونفايات لمبة الزنبق) والتربة (التربة الزراعية والحدائق والطبيعية)16،17،18،19. Aspergillus fumigatus هو عامل ممرض انتهازي بشري يسبب مجموعة من العدوى تسمى مجتمعة داء الرشاشيات ، وتؤثر على أكثر من 8 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم16,20. يعاني ما يقرب من 300000 شخص حول العالم من داء الرشاشيات الغازي ، وهو أشد أشكال داء الرشاشيات16. اعتمادا على عوامل مثل عدد المرضى ، وموقع العدوى ، وفعالية العلاج المضاد للفطريات ، يمكن أن يصل معدل الوفيات إلى 90٪. على مدى العقود العديدة الماضية، زادت مقاومة العلاجات المضادة للفطريات، مما يتطلب جهود مراقبة عالمية في كل من السكان السريريين والبيئيين لتتبع هذه الأنماط الجينية المقاومة21،22،23. نظرا لقدرتها على النمو في درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية ، يمكن استغلال درجة الحرارة هذه لاختيار A. fumigatus المعزولة عن التربة باستخدام طرق تعتمد على الثقافة. عادة ما يتم وضع النمط الوراثي لعزلات الرشاشيات المدخنة في تسعة مواقع متكررة قصيرة (STR) متعددة الأشكال للغاية ، والتي تبين أنها تتمتع بقوة تمييزية عالية بين السلالات24. يمكن مقارنة هذه الأنماط الجينية STR بالمجموعات السكانية الأخرى التي تم مسحها سابقا لتتبع انتشار الأنماط الجينية A. fumigatus ، بما في ذلك الجينات المقاومة للأدوية ، في جميع أنحاء العالم.

فيما يلي وصف لبروتوكول للعزل السريع للخمائر و A. fumigatus من عينات التربة بطريقة تعتمد على الثقافة. اعتمادا على كمية التربة التي تم الحصول عليها لكل عينة ، يمكن مشاركة عينات التربة بين البروتوكولين. بالمقارنة مع الطرق المماثلة التي تعزل الخميرة و A. fumigatus من التربة ، يستخدم هذا البروتوكول تربة أقل بمقدار 10 أضعاف لكل عزلة تم الحصول عليها. تتطلب الدراسات التي تحاول عزل A. fumigatus من التربة ما بين 1 و 2 غرام من التربة لكل عزلة ، في حين أن هذا البروتوكول يتطلب فقط 0.1-0.2 غرام من التربة18،19،25. يستخدم هذا البروتوكول مواد بلاستيكية وحاويات أصغر تسهل تصميمه عالي الإنتاجية. لذلك ، يمكن معالجة عدد أكبر من العينات باستخدام مساحة أقل لمعدات مثل الحاضنات وبراميل الأسطوانة. يمكن معالجة عينات التربة بالكامل للحصول على عزلات في أقل من 7 أيام. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح بمعالجة ما يصل إلى 150-200 عينة يوميا للشخص الواحد.

Protocol

ملاحظة: تتطلب أي خطوات تستخدم عينات التربة الدولية و/أو جراثيم A. fumigatus والفطريات العمل داخل خزانة السلامة الأحيائية للكائنات الحية من المستوى 2 (BSCII).

1. عزل الخميرة عن التربة

  1. إعداد حلول مضادة للبكتيريا والفطريات
    1. مسحوق الكلورامفينيكول في 70٪ من الإيثانول لإعداد محلول مخزون 50 جم / لتر. تعقيم عن طريق ترشيح حقنة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذا المضاد الحيوي سيمنع نمو معظم البكتيريا أثناء عزل خميرة التربة. نظرا لأن البكتيريا المقاومة للكلورامفينيكول قد تستمر في النمو ، يجب أن تؤخذ مورفولوجيا المستعمرة في الاعتبار بعناية عند التمييز بين الخمائر والبكتيريا. يمكن إضافة مضادات حيوية إضافية إلى الوسائط عند العمل مع التربة المشتبه في احتوائها على سلالات بكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية. ولم يكن التلوث البكتيري في الأوساط المكملة بالكلورامفينيكول مشكلة تصادف عند عزل الخمائر عن التربة البيئية.
    2. مسحوق البنوميل في DMSO لإعداد محلول مخزون 5 جم / لتر. تعقيم عن طريق ترشيح حقنة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمنع هذا الدواء الانتقائي المضاد للفطريات نمو معظم الفطريات الخيطية دون التأثير على نمو الخميرة أثناء عزل خميرة التربة26,27.
  2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والمعدات المعقمة
    1. لتحضير مرق YEPD (مستخلص الخميرة - الببتون - سكر العنب) ، أضف 10 غرام من مستخلص الخميرة ، و 20 غراما من الببتون ، و 20 غراما من سكر العنب إلى 1 لتر من الماء المقطر المزدوج. يحرك المزيج حتى يمتزج جيدا ويستمر الأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة عند 121 درجة مئوية. يحفظ في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
    2. YEPD أجار الصلبة المتوسطة
      1. مزيج 10 غرام من مستخلص الخميرة ، 20 غرام من الببتون ، 20 غرام من سكر العنب ، و 20 غرام من الأجار في 1 لتر من الماء. يحرك المزيج جيدا للخلط والأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
      2. بمجرد تبريده بشكل كاف ، أضف 1 مل من الكلورامفينيكول والبينوميل من محاليل المخزون لرفع التركيزات النهائية لاثنين من مضادات الميكروبات إلى 50 ملغ / لتر و 5 ملغ / لتر ، على التوالي.
      3. تخلط جيدا عن طريق التحريك وتصب في أطباق بتري قطرها 10 سم. اتركيه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لضبطه وتخزينه على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
        ملاحظة: من 1 لتر من YEPD ، يمكن سكب ما يقرب من 40 لوحة.
    3. قم بتعقيم عصي قضيب خشبية ذات رأس عادي وموزعات خلايا قابلة لإعادة الاستخدام عن طريق التعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. حضانة التربة في المرق السائل
    1. قم بإعداد مجموعة من أنابيب الاستزراع المعقمة سعة 13 مل عن طريق وضع علامة عليها باستخدام معرف عينة التربة.
    2. باستخدام ماصة مصلية ، أضف 5 مل من مرق YEPD المكمل بالكلورامفينيكول والبينوميل في كل أنبوب.
    3. من خلال العمل في BSCII ، قم بنقل ~ 0.1 جم من التربة إلى أنبوب الاستزراع المناسب باستخدام قضيب خشبي معقم ذو رأس عادي.
      ملاحظة: استخدم قضيب جديد لكل عينة من عينات التربة وتخلص منه فور استخدامه لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    4. قم بتغطية الأنبوب بإحكام إلى المحطة الأولى لمنع الانسكاب ولكن مع السماح بتبادل الهواء أثناء الحضانة. احتضن أنابيب الاستزراع في أسطوانة بكرة لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة تعتبر مثالية لزيادة نمو الخميرة إلى أقصى حد.
      ملاحظة: ينبغي تحديد درجة حرارة الحضانة بناء على متوسط درجة الحرارة السنوية لبلد منشأ عينات التربة. على سبيل المثال ، عند عزل خمائر التربة عن أيسلندا ، تم احتضان أنابيب الاستزراع عند 14 درجة مئوية ، في حين تم احتضان التربة من المملكة العربية السعودية عند 30 درجة مئوية. بسبب تباطؤ نمو الخميرة في درجات حرارة منخفضة ، قد يتعين تمديد وقت الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  4. نقل supernatant إلى الوسط الصلب.
    1. باستخدام مجموعة من ألواح YEPD + chloramphenicol + benomyl agar المعدة في الخطوة 1.2 ، قم بتسميتها بمعرف عينة التربة.
    2. قم بإزالة أنابيب الاستزراع المعدة في الخطوة 1.3 من أسطوانة الأسطوانة. من خلال العمل في BSCII ، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لسحب جزيئات التربة والخلايا التي ربما استقرت في القاع مرة أخرى إلى التعليق.
    3. باستخدام ماصة صغيرة ، انقل 100 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة. استخدم موزع خلايا معقم وقابل لإعادة الاستخدام لنشر السائل جيدا وبالتساوي على سطح الأجار.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي العمل في مجموعات من 10 عينات إلى تسريع هذه العملية بشكل كبير. ماصة supernatant على 10 لوحات أولا ثم أداء انتشار. استخدم موزعا جديدا لكل عينة لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    4. تكدس الألواح في أكياس بلاستيكية ، وتغلقها ، وتحضنها رأسا على عقب لمدة 2-3 أيام في نفس درجة الحرارة المستخدمة سابقا لحضانة المرق السائل حتى يصبح النمو الميكروبي مرئيا.
  5. الكشف عن الخمائر والخطوط للمستعمرات الفردية
    1. بعد السماح بوقت حضانة كاف (عادة 2-3 أيام ، ولكن قد يستغرق وقتا أطول في درجات حرارة منخفضة) ، افحص الألواح في BSCII بحثا عن أي نمو للخميرة. ابحث عن الخمائر الكريمية والمستديرة وغير اللامعة التي يمكن تمييزها بسهولة عن المستعمرات البكتيرية والعفن.
      ملاحظة: تنتج بعض الخمائر أصباغا ملونة وقد تظهر باللون الأسود / البني أو الأصفر أو الأحمر ، ولكن قوامها وشكلها العام للمستعمرة سيكون مشابها للخمائر غير المصطبغة.
    2. اختر مستعمرة واحدة تشبه الخميرة من كل صفيحة لمزيد من المعالجة.
      ملاحظة: إذا لوحظ أكثر من نوع واحد من المورفولوجيا على صفيحة واحدة، فحدد مستعمرة تمثيلية واحدة لكل نوع مورفولوجي.
    3. باستخدام عصي قضيب خشبية معقمة ذات رأس عادي ، انقل كل مستعمرة مختارة إلى YEPD طازج + كلورامفينيكول + صفيحة بينوميل وخط للمستعمرات الفردية. تنفيذ ثلاثة خطوط منفصلة.
      1. اربط الطبق ذهابا وإيابا على ثلث الطبق باستخدام عصا قضيب. ابدأ الخطين الثاني والثالث عن طريق ربط قضيب عبر الخط السابق مرة واحدة. استخدم عصا قضيب جديدة لكل خط.
        ملاحظة: استخدم صفيحة واحدة لكل عزلة. تخلص من أدوات التطبيق فور استخدامها لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    4. تكدس الألواح في أكياس بلاستيكية ، وتغلقها ، وتحضنها رأسا على عقب لمدة 2-3 أيام في نفس درجة الحرارة المستخدمة سابقا حتى تصبح المستعمرات المفردة مرئية.
  6. تحديد أنواع الخميرة عن طريق تسلسل ITS
    1. اختر مستعمرة واحدة منفصلة جيدا لكل عزل التربة والاستزراع الفرعي على صفيحة YEPD + chloramphenicol + benomyl الطازجة للحصول على المزيد من الخلايا. حضانة لمدة 2-3 أيام في نفس درجة الحرارة المستخدمة سابقا.
    2. حصاد الخلايا المزروعة حديثا وتعليقها في أنابيب التجميد -80 درجة مئوية التي تحتوي على 1 مل من الجلسرين المعقم 30٪ في الماء المقطر المزدوج لإنشاء معلقات الخلايا. حافظ على هذه المعلقات عند -80 درجة مئوية كحلول للمخزون.
    3. استخدم الخلايا الطازجة لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل) مع الاشعال ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') و ITS4 (5' TCCTCCGTTTTATTGATATGC 3') لتضخيم جين الترميز الشريطي الفطري ، ITS9. استخدم شروط التدوير الحراري التالية: خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 35 دورة من (i) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (ii) 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و (iii) 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: تتمتع Colony PCR بمعدل نجاح مرتفع ووقت تحول أسرع من استخراج الحمض النووي متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل.
    4. إذا فشلت مستعمرة PCR بشكل متكرر في حدوث سلالة ، فقم باستخراج الحمض النووي باستخدام البروتوكول المفضل وقم بإجراء ITS PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج كقالب (استخدم نفس شروط التدوير الحراري كما هو موضح أعلاه).
      ملاحظة: يوصى باستخراج الحمض النووي القائم على الكلوروفورم غير المكلف نسبيا28.
    5. قم بإجراء تسلسل Sanger لتحديد تسلسل الحمض النووي لمنطقة ITS المضخمة لكل سلالة.
    6. قارن تسلسل ITS الذي تم الحصول عليه من سلالات الخميرة بالتسلسلات المودعة في قواعد البيانات العامة مثل NCBI GenBank و UNITE لتحديد هوية الأنواع.

2. عزل الرشاشيات الدخان من التربة

  1. تحضير 1 مل من مرق سكر العنب سابورو المعقم (SDB) المكمل بالمضاد الحيوي الكلورامفينيكول لكل عينة من التربة.
    1. أضف 10 غرام من الببتون و 20 غرام من سكر العنب إلى 1 لتر من الماء المقطر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    2. اسمح ل SDB أن يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية ، أضف 1 مل من 50 جم / لتر من الكلورامفينيكول ليصل التركيز إلى 50 مجم / لتر.
      ملاحظة: يتم تحضير الكلورامفينيكول كما هو موضح أعلاه لعزل الخميرة. بصرف النظر عن تثبيط نمو البكتيريا ، يمنع الكلورامفينيكول أيضا إنتاج الغاز من البكتيريا التي ستتسبب في فتح الأنابيب أثناء خطوة الحضانة المفصلة في الخطوة 2.2.
    3. معقم 1 مل من SDB في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل لكل عينة تربة باستخدام ماصة ميكانيكية.
  2. أضف التربة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
    1. ضع معطفا على مقاعد البدلاء أو حشوة ماصة داخل BSCII للمساعدة في التخلص من التربة المسكوبة.
    2. باستخدام عصي قضيب معقمة ، انقل حوالي 0.1 جم من التربة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من SBD. أغلق الأنبوب والدوامة. احتضان التربة العالقة عند 50 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: الاهتزاز أثناء الحضانة غير مطلوب.
  3. حصاد Mycelial من مرق التربة الملقح
    1. تحضير أطباق أجار مستخلص الشعير (MEA).
      1. لكل لتر من MEA: أضف 20 جم من مستخلص الشعير ، و 20 جم من سكر العنب ، و 6 جم من الببتون ، و 15 جم من الأجار إلى 1 لتر من الماء المقطر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
      2. اسمح ل MEA أن يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية ، ثم أضف 1 مل من 50 جم / لتر من الكلورامفينيكول للوصول إلى تركيز نهائي قدره 50 مجم / لتر.
    2. انقل الفطريات من المرق الملقح بالتربة إلى ألواح MEA.
      1. تحديد تطعيمات التربة التي لها نمو فطري مرئي عند SDB إلى الحدود الجوية.
      2. استخدم عصي قضيب خشبية معقمة ذات رأس عادي لنقل الفطريات إلى وسط صفيحة MEA. احتضان لوحات MEA عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  4. اختيار الميسيليا مع A. fumigatus الخصائص المورفولوجية.
    1. تحديد مستعمرات العفن التي لها خصائص A. fumigatus المورفولوجية المميزة (الشمواه الخضراء مثل النمو).
    2. أثناء العمل في BSCII ، استخدم عصي قضيب خشبية معقمة ذات رؤوس عادية أو حلقة تلقيح لحصاد الكونيديا / الفطريات عن طريق كشط السطح مرة واحدة. انقل الجراثيم/الفطريات إلى وسط صفيحة MEA عن طريق التدرج على الأجار لمستعمرات مفردة. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
      ملاحظة: نظرا لأن سلالات A. fumigatus المتعددة و / أو الفطريات الأخرى قد تكون موجودة على اللوحة ، فمن المهم أن تخطو لمستعمرات واحدة. يمكن استخدام بروتوكول التدرج أحادي المستعمرة في الخطوة 1.5.3 في بروتوكول عزل الخميرة.
    3. باستخدام عصا قضيب معقمة أو حلقة تلقيح، قم بزراعة مستعمرة واحدة تم إنشاؤها في الخطوة 2.4.1.2 على MEA عن طريق ربط المستعمرة مرة واحدة. انشر الجراثيم المحصودة في وسط اللوحة. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
  5. حصاد جراثيم A. fumigatus / mycelia لتخزين المستنبتات
    1. قم بإعداد محلول جليسرين معقم بنسبة 30٪ (لمحلول 100 مل ، أضف 30 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ ممزوجا ب 70 مل من الماء المقطر المزدوج ، معقما عند 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة).
    2. العمل في BSCII ، استخدم ماصة p1000 لشفط 1 مل من محلول الجلسرين 30٪. قم بتوزيع 1 مل من محلول الجلسرين على مستعمرة A. fumigatus لحصاد الجراثيم / الميسيليا.
      1. بسبب كره الماء من A. fumigatus الجراثيم / mycelia ، استخدم طرف الماصة لخدش منطقة بوغية كثيفة من اللوحة.
        ملاحظة: عندما يتم الاستغناء عن الجلسرين في الخدش ، فإن الجلسرين سوف يلتصق بمنطقة الخدش بدلا من التدحرج فوق الأجار.
      2. قم بتوزيع الجلسرين ببطء على منطقة الخدش لإزاحة الجراثيم وتعليقها في محلول الجلسرين.
      3. بمجرد الاستغناء عنها بالكامل ، قم بقلب اللوحة برفق واستنشاق تعليق بوغ الجلسرين / الفطريات.
        ملاحظة: سيتم شفط ما يقرب من 750 إلى 800 ميكرولتر.
      4. انقل الشفطة إلى أنبوب تجميد معقم وخزنها على درجة حرارة -80 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، قم بإنشاء مخزون عامل عن طريق تكرار الخطوات من 2.5.2.1 إلى 2.5.2.4.
  6. تحديد النمط الظاهري لسلالات A. fumigatus
    1. باستخدام مخزون البوغ الذي تم إنشاؤه من الخطوة 2.5.2 ، قم بإنشاء تخفيف 100x في الماء.
      1. استنشاق 10 ميكرولتر من مخزون الميسيليال والبوغ والاستغناء عن 990 ميكرولتر من الماء. دوامة التعليق.
    2. قم بتوزيع 10 ميكرولتر من تعليق البوغ المخفف على شريحة مجهر قياسية.
    3. اختياري: لطخة تعليق mycelial وبوغ مع الميثيلين الأزرق.
      1. لتلطيخ مع الميثيلين الأزرق ، قم بإصلاح conidia و conidiophores على الشريحة عن طريق تمرير الشريحة فوق موقد بنسن حتى يجف.
      2. ضع الميثيلين الأزرق لمدة 1-2 دقيقة واغسله بالماء.
      3. جفف الشريحة بورق النشاف.
    4. باستخدام المجهر المركب عند تكبير 400x ، قم بعرض التعليق وتحديد موقع conidiophores. قارن مورفولوجيا conidiophore الملاحظة مع مورفولوجيا A. fumigatus conidiophore.
  7. التحديد الجزيئي لسلالات A. fumigatus
    1. استخراج الحمض النووي من كل عزل باتباع بروتوكولات استخراج الحمض النووي الفطرية الشائعة.
    2. باستخدام الاشعال الخاصة بجينات الرشاشيات β-توبولين (β-tub1 و β-tub4) ، قم بتشغيل PCR والحصول على تسلسل المنتجات المضخمة ، باتباع البروتوكولات التي وصفها Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. قارن التسلسلات التي تم الحصول عليها بالتسلسلات المودعة في قواعد البيانات العامة مثل NCBI GenBank باستخدام BLAST.
      2. تأكد من أن تسلسلات الإجهاد هي أعلى مطابقة لتسلسلات A. fumigatus في قاعدة البيانات.
    3. بديل للخطوة 2.7.2 ، قم بتشغيل تفاعل PCR متعدد الإرسال يستهدف أنواع التزاوج A. fumigatus MAT1-1 و MAT1-229.
      1. استخدم التسلسلات التمهيدية الثلاثة التالية في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال: AFM1: 5'-CCTTGACGCGGATGGGGGGGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. استخدم معلمات الدورة الحرارية التالية: 5 دقائق عند 95 درجة مئوية، و35 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، و30 ثانية عند 60 درجة مئوية، و1 دقيقة عند 72 درجة مئوية قبل 5 دقائق نهائية عند 72 درجة مئوية.
      3. تشغيل الكهربائي هلام لتحديد المنتجات. ابحث عن 834 نقطة أساس MAT-1 أو 438 نقطة أساس MAT1-2. استخدم سلالات A. fumigatus التي أكدت تضخيم نوع التزاوج كضوابط إيجابية وسلبية.
  8. التنميط الجيني للسواتل الدقيقة لسلالات A. fumigatus من خلال تحليل الشظايا
    ملاحظة: على الرغم من أن الخطوات المدرجة أدناه تغطي على نطاق واسع التنميط الجيني A. fumigatus في تسعة مواقع للسواتل الصغيرة (STR)، لم يسلط الضوء إلا على عدد قليل من الاعتبارات الهامة. للحصول على تفاصيل حول التنميط الجيني A. fumigatus STR ، راجع De Valk et al.24,30.
    1. قم بإعداد ثلاثة خلطات رئيسية متعددة الإرسال PCR باستخدام الاشعال STRAf التي وصفها سابقا De Valk et al.24.
      1. الفلورسنت تسمية الاشعال الأمامية لتحديد حجم الشظايا من خلال الكهربائي الشعري. تأكد من أن تركيز الاشعال الأمامي هو نصف (0.5 ميكرومتر) تركيز الاشعال العكسي (1 ميكرومتر) داخل المزيج الرئيسي.
        ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، استخدم ملصقات الفلورسنت التي تحتوي على أطوال موجية للامتصاص تتطابق مع تلك الموجودة في معيار الصبغة المختار المستخدم أثناء الرحلان الكهربائي الشعري
      2. استخدم بوليميراز البداية الساخنة للحصول على أفضل النتائج.
      3. استخدم تركيز الحمض النووي 0.1 نانوغرام لكل تفاعل.
    2. قم بتشغيل PCR متعدد الإرسال لكل سلالة باستخدام برنامج PCR التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتعليق عند 4 درجات مئوية.
    3. تحقق من المنتجات المضخمة من خلال الرحلان الكهربائي الهلامي.
    4. قم بتخفيف المنتجات إلى المستوى المطلوب (عادة ~ 50x) على النحو الموصى به من قبل المتخصصين في تحليل الشظايا وتشغيل الرحلان الكهربائي الشعري. قم بإجراء ثلاثة أشواط لكل سلالة ، حيث يغطي كل تشغيل ثلاثة تفاعلات متعددة الإرسال مع ثلاثة مجسات فلورسنت مختلفة.
    5. لتحديد حجم الجزء الصحيح لكل موقع من مواقع STR التسعة، استخدم برنامجا قادرا على تحليل الأجزاء.
      1. استرجع البيانات الخام التي تم الحصول عليها من الرحلان الكهربائي الشعري. سجل أحجام الأجزاء استنادا إلى أكبر ذروة باستخدام برنامج تحليل الأجزاء (على سبيل المثال ، أوزوريس).
      2. قم بتحويل أحجام الأجزاء إلى أرقام متكررة لكل موقع من المواقع التسعة. استخدم أحجام الأجزاء للأرقام المتكررة للسلالة المرجعية Af293 كما وصفها سابقا De Valk et al.24.
        ملاحظة: قد تحدث اختلافات طفيفة في أحجام الشظايا بين منصات الرحلان الكهربائي الشعري المختلفة. وبالتالي ، من المهم تضمين سلالة مرجعية مشتركة (وسلم داخلي) مع حجم شظية معروف لكل من المواقع التسعة لسلالات التنميط الجيني.

النتائج

عزل الخميرة عن التربة
تم تنفيذ بروتوكول عزل الخميرة المذكور أعلاه لاستزراع الخمائر من عينات التربة الناشئة من 53 موقعا في تسعة بلدان 9,12. في المجموع، تم عزل 1,473 سلالة خميرة من 3,826 عينة تربة. ونظرا لاختلاف الظروف المناخية للبلدان التسعة الأصلية، حدد?...

Discussion

البروتوكول الذي تم تطويره لعزل الخمائر و A. fumigatus من التربة هو طريقة سريعة وفعالة لمعالجة التربة عالية الإنتاجية والعزل الفطري. ولا يتطلب البروتوكول سوى كمية صغيرة من التربة (0.1-0.2 جم) لكل عينة، مما يسمح بأخذ عينات من المزيد من المواقع بجهد مماثل. يضمن وقت الاستجابة السريع إمكانية الحصو?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من خلال منح من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (رقم المنحة. ALLRP 570780-2021) وجامعة ماكماستر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeSarstedt Inc72.690.001
Benomyl powder Toronto Research ChemicalsB161380
Chloramphenicol powder Sigma-AldrichSKU: C0378-5G
DextroseSigma-AldrichSKU: D9434-500G
Fragment Analysis SoftwareNCBI's Osirishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence databaseNCBI GenBank https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence databaseUNITE https://unite.ut.ee/
PeptoneSigma-AldrichSKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders Fisher Scientific08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes Sarstedt Inc83.3902
Sterile 13 mL culture tubes Sarstedt Inc62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks Fisher Scientific23-400-112
Yeast extractSigma-AldrichSKU: Y1625-250G

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved