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Résumé

Ce protocole est une méthode efficace et rapide de culture des levures et de la moisissure Aspergillus fumigatus à partir de grands ensembles d’échantillons de sol en aussi peu que 7 jours. Les méthodes peuvent être facilement modifiées pour s’adapter à une gamme de milieux d’incubation et de températures au besoin pour les expériences.

Résumé

Le sol est l’hôte d’une quantité incroyable de vie microbienne, chaque gramme contenant jusqu’à des milliards de cellules bactériennes, archéales et fongiques. Les champignons multicellulaires tels que les moisissures et les champignons unicellulaires, définis au sens large comme des levures, jouent un rôle essentiel dans les écosystèmes du sol en tant que décomposeurs de matières organiques et en tant que sources de nourriture pour les autres habitants du sol. La diversité des espèces fongiques dans le sol dépend d’une multitude de facteurs climatiques tels que les précipitations et la température, ainsi que des propriétés du sol, y compris la matière organique, le pH et l’humidité. Le manque d’échantillonnage environnemental adéquat, en particulier dans les régions d’Asie, d’Afrique, d’Amérique du Sud et d’Amérique centrale, entrave la caractérisation des communautés fongiques du sol et la découverte de nouvelles espèces.

Nous avons caractérisé les communautés fongiques du sol dans neuf pays sur six continents en utilisant environ 4 000 échantillons de sol et un protocole développé en laboratoire pour l’isolement des levures et des moisissures. Ce protocole commence par un enrichissement sélectif séparé pour les levures et la moisissure médicalement pertinente Aspergillus fumigatus, dans un milieu liquide tout en inhibant la croissance bactérienne. Les colonies résultantes sont ensuite transférées dans des milieux solides et traitées pour obtenir des cultures pures, suivies d’une caractérisation génétique en aval. L’identité des espèces de levures est établie par le séquençage de leur région interne d’espaceur transcrit (ITS) du groupe de gènes de l’ARN ribosomique nucléaire, tandis que la structure de la population mondiale d’A. fumigatus est explorée par l’analyse de marqueurs microsatellites.

Le protocole a été appliqué avec succès pour isoler et caractériser les populations de levure du sol et d’A. fumigatus au Cameroun, au Canada, en Chine, au Costa Rica, en Islande, au Pérou, en Nouvelle-Zélande et en Arabie saoudite. Ces résultats ont révélé des informations indispensables sur les modèles mondiaux de diversité des levures du sol, ainsi que sur la structure de la population mondiale et les profils de résistance antifongique d’A. fumigatus. Cet article présente la méthode d’isolement des levures et d’A. fumigatus à partir d’échantillons de sol internationaux.

Introduction

Les champignons dans les écosystèmes du sol jouent un rôle essentiel dans la décomposition de la matière organique, le cycle des nutriments et la fertilisation du sol1. Les approches indépendantes de la culture (c.-à-d. séquençage à haut débit) et dépendantes de la culture sont largement utilisées dans l’étude des champignons du sol 2,3. Bien que la grande quantité de données générées par le séquençage de métacodes à barres à haut débit soit utile pour élucider les modèles à grande échelle de la structure et de la diversité des communautés, l’approche dépendante de la culture peut fournir des informations très complémentaires sur les structures taxonomiques et fonctionnelles des communautés fongiques, ainsi que des profils plus spécifiques d’organismes individuels grâce à la diversité en aval et aux analyses fonctionnelles en raison de la disponibilité de cultures fongiques pures.

Bien qu’elles dépassent rarement des milliers de cellules par gramme de sol, les levures, définies au sens large comme des champignons unicellulaires, sont des décomposeurs essentiels et des sources de nourriture pour les autres habitants du sol 4,5. En fait, les levures peuvent être les champignons du sol prédominants dans les biosphères froides telles que l’Antarctique continental 6,7. Le sol est également un réservoir primaire de levures médicalement pertinentes qui causent de graves infections opportunistes chez les humains et d’autres mammifères8. Malgré les similitudes morphologiques, les espèces de levures sont phylogénétiquement diverses et se trouvent parmi les champignons filamenteux dans deux phylums majeurs, Ascomycota et Basidiomycota, dans le règne fongique9. Les levures n’ont pas de signature ADN déterminante au niveau du gène de codage à barres fongique, la région interne de l’espaceur transcrit (ITS) du groupe de gènes de l’ARN ribosomique nucléaire10, ce qui les rend impossibles à distinguer des autres champignons dans les études métagénomiques et nécessite donc l’utilisation de méthodes dépendantes de la culture pour isoler les espèces de levure.

Le protocole ci-dessous a été mis en œuvre pour caractériser les communautés de levures du sol de neuf pays et identifier les tendances et les modèles mondiaux de la diversité des levures du sol 9,11,12. Les approches métagénomiques sont d’une utilité limitée pour étudier des groupes ciblés d’organismes tels que les levures 2,3. En raison de leur diversité phylogénétique, les levures ne peuvent pas être distinguées des autres champignons sur la base de la seule séquence d’ADN. Ainsi, l’étude des populations de levures nécessite l’utilisation continue de l’isolement dépendant de la culture. Cependant, la culture prend souvent beaucoup plus de temps et nécessite plus de personnel pour effectuer les expériences. Par conséquent, le protocole a été optimisé et rationalisé pour un traitement plus rapide avec un personnel limité. Le principal avantage de la culture est que les espèces de levures identifiées sont des levures vivantes et non mortes, et sont donc plus susceptibles d’être de vrais habitants du sol plutôt que des cellules transitoires présentes dans les sols. On estime qu’environ 40 % de l’ADN fongique dans le sol est soit constitué de contaminants provenant d’autres environnements, soit extracellulaires, soit provenant de cellules qui ne sont plus intactes, ce qui entraîne des approches de séquençage à haut débit pour surestimer la richesse fongique jusqu’à 55 %13. L’isolement dépendant de la culture peut facilement confirmer l’identité des espèces de levures avec l’avantage supplémentaire de garantir une culture pure à utiliser dans les analyses en aval. En effet, des cultures pures de 44 nouvelles espèces de levures putatives ont été identifiées à l’aide de ce protocole d’isolement du sol qui a permis l’utilisation d’une gamme de méthodes pour étudier en détail leurs propriétés taxonomiques et fonctionnelles14.

Le protocole ci-dessous peut également être utilisé pour isoler les moisissures présentes dans le sol, telles que A. fumigatus. Aspergillus fumigatus est une moisissure thermophile et saprophyte avec une large distribution mondiale dans le sol15. Il a été isolé dans de nombreux environnements cliniques et non cliniques. L’échantillonnage non clinique comprend généralement l’air, les débris organiques (compost, sciure de bois, déchets de bulbes de tulipes) et le sol (sols agricoles, de jardin et naturels)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus est un agent pathogène opportuniste humain causant une gamme d’infections collectivement appelées aspergillose, affectant plus de 8 millions de personnes dans le monde16,20. Environ 300 000 personnes dans le monde souffrent d’aspergillose invasive, qui est la forme la plus grave d’aspergillose16. Selon des facteurs tels que la population de patients, le site de l’infection et l’efficacité du traitement antifongique, le taux de mortalité peut atteindre 90%. Au cours des dernières décennies, la résistance aux thérapies antifongiques a augmenté, nécessitant des efforts de surveillance mondiale dans les populations cliniques et environnementales pour suivre ces génotypes de résistance 21,22,23. Compte tenu de sa capacité à croître à des températures supérieures à 50 °C, cette température peut être exploitée pour sélectionner des isolats d’A. fumigatus dans le sol en utilisant des méthodes dépendantes de la culture. Les isolats d’Aspergillus fumigatus sont généralement génotypés à neuf loci à répétition courte en tandem (STR) hautement polymorphes, dont le pouvoir discriminatoire est élevé entre les souches24. Ces génotypes STR peuvent être comparés à d’autres populations précédemment étudiées pour suivre la propagation des génotypes d’A. fumigatus, y compris les gènes de résistance aux médicaments, dans le monde entier.

Nous décrivons ci-dessous un protocole pour l’isolement rapide des levures et d’A. fumigatus à partir d’échantillons de sol en fonction de la culture. Selon la quantité de sol obtenue par échantillon, les échantillons de sol peuvent être partagés entre les deux protocoles. Par rapport à des méthodes similaires qui isolent la levure et A. fumigatus du sol, ce protocole utilise 10 fois moins de sol par isolat obtenu. Les études visant à isoler A. fumigatus du sol nécessitent entre 1 et 2 g de sol par isolat, alors que ce protocole ne nécessite que 0,1 à 0,2 g de sol 18,19,25. Ce protocole utilise des plastiques et des conteneurs plus petits qui facilitent sa conception à haut débit. Par conséquent, un plus grand nombre d’échantillons peuvent être traités en utilisant moins d’espace pour les équipements tels que les incubateurs et les tambours à rouleaux. Les échantillons de sol peuvent être entièrement traités pour obtenir des isolats en aussi peu que 7 jours. Ce protocole a été optimisé pour permettre le traitement de jusqu’à 150 à 200 échantillons par jour et par personne.

Protocole

REMARQUE: Toute étape utilisant des échantillons de sol internationaux et / ou des spores et des mycéliums d’A. fumigatus nécessite de travailler dans une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau 2 (BSCII).

1. Isolement de la levure du sol

  1. Préparation de solutions antibactériennes et antifongiques
    1. Suspendre la poudre de chloramphénicol dans de l’éthanol à 70 % pour préparer une solution mère à 50 g/L. Stériliser par filtration sur seringue et conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Cet antibiotique empêchera la croissance de la plupart des bactéries pendant l’isolement de la levure du sol. Comme les bactéries résistantes au chloramphénicol peuvent encore se développer, la morphologie des colonies doit être soigneusement prise en considération lors de la distinction entre les levures et les bactéries. Des antibiotiques supplémentaires peuvent être ajoutés aux milieux lorsque vous travaillez avec un sol soupçonné de contenir des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. La contamination bactérienne dans les milieux supplémentés en chloramphénicol n’était pas un problème rencontré lors de l’isolement des levures des sols environnementaux.
    2. Suspendre la poudre de bénomyle dans du DMSO pour préparer une solution mère de 5 g/L. Stériliser par filtration sur seringue et conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Ce médicament antifongique sélectif empêche la croissance de la plupart des champignons filamenteux sans affecter la croissance des levures pendant l’isolement des levures du sol26,27.
  2. Préparation des milieux de culture et de l’équipement stérile
    1. Pour préparer le bouillon YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose), ajouter 10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone et 20 g de dextrose à 1 L d’eau double distillée. Remuer jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé et autoclaver pendant 40 min à 121 °C. Conserver à température ambiante jusqu’à utilisation.
    2. Milieu de gélose solide YEPD
      1. Mélanger 10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone, 20 g de dextrose et 20 g de gélose dans 1 L d’eau. Bien mélanger pour mélanger et autoclaver pendant 40 min à 121 °C.
      2. Une fois suffisamment refroidi, ajouter 1 mL de chloramphénicol et de bénomyl provenant de solutions mères pour porter les concentrations finales des deux antimicrobiens à 50 mg/L et 5 mg/L, respectivement.
      3. Bien mélanger en remuant et verser dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre. Laisser à température ambiante pendant la nuit pour régler et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
        REMARQUE: À partir de 1 L de YEPD, environ 40 plaques peuvent être versées.
    3. Stérilisez les bâtonnets applicateurs en bois à pointe plate et les épandeurs de cellules réutilisables par autoclavage et conservez-les à température ambiante.
  3. Incubation du sol dans un bouillon liquide
    1. Préparez un ensemble de tubes de culture stériles de 13 mL en les étiquetant avec l’ID de l’échantillon de sol.
    2. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 5 mL de bouillon YEPD complété par du chloramphénicol et du bénomyl dans chaque tube.
    3. En travaillant dans un BSCII, transférer environ 0,1 g de sol dans le tube de culture approprié à l’aide d’un applicateur stérile en bois à pointe plate.
      REMARQUE: Utilisez un applicateur frais pour chaque échantillon de sol et jetez-le immédiatement après utilisation pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.
    4. Boucher le tube solidement jusqu’au premier arrêt pour éviter les déversements tout en permettant l’échange d’air pendant l’incubation. Incuber les tubes de culture dans un tambour à rouleaux pendant 24 h à une température jugée optimale pour maximiser la croissance des levures.
      NOTE: La température d’incubation doit être décidée en fonction de la température annuelle moyenne du pays d’origine des échantillons de sol. Par exemple, lors de l’isolement des levures de sol d’Islande, les tubes de culture ont été incubés à 14 ° C, tandis que les sols d’Arabie saoudite ont été incubés à 30 ° C. En raison du ralentissement de la croissance des levures à des températures plus basses, le temps d’incubation peut devoir être prolongé jusqu’à 72 h.
  4. Transférer le surnageant dans le milieu solide.
    1. À l’aide de l’ensemble de plaques de gélose YEPD + chloramphénicol + bénomyle préparées à l’étape 1.2, étiquetez-les avec l’ID de l’échantillon de sol.
    2. Retirez les tubes de culture préparés à l’étape 1.3 du tambour à rouleaux. En travaillant dans un BSCII, vortexz brièvement le tube pour aspirer les particules de sol et les cellules qui peuvent s’être déposées au fond en suspension.
    3. À l’aide d’une micropipette, transférer 100 μL du surnageant sur une plaque. Utilisez un épandeur de cellules stérile et réutilisable pour répartir le liquide de manière complète et uniforme sur la surface de la gélose.
      REMARQUE: Travailler en ensembles de 10 échantillons peut accélérer considérablement ce processus. Pipetez d’abord le surnageant sur 10 plaques, puis effectuez l’étalement. Utilisez un épandeur frais pour chaque échantillon afin d’éviter la contamination croisée entre les échantillons.
    4. Empilez les assiettes dans des sacs en plastique, scellez et incubez à l’envers pendant 2-3 jours à la même température que celle utilisée précédemment pour l’incubation du bouillon liquide jusqu’à ce que la croissance microbienne soit visible.
  5. Détection de levures et de stries pour des colonies individuelles
    1. Après avoir prévu un temps d’incubation suffisant (généralement 2-3 jours, mais peut prendre plus de temps à des températures plus basses), inspectez les plaques dans un BSCII pour toute croissance de levure. Recherchez des levures crémeuses, rondes et mates qui se distinguent facilement des colonies bactériennes et de moisissures.
      REMARQUE: Certaines levures produisent des pigments colorés et peuvent apparaître noir / brun, jaune ou rouge, mais leur texture et leur forme globales de colonie seraient similaires à celles des levures non pigmentées.
    2. Sélectionnez une colonie ressemblant à de la levure dans chaque plaque pour un traitement ultérieur.
      REMARQUE: Si plus d’un type de morphologie est observé sur une seule plaque, sélectionnez une colonie représentative pour chaque type morphologique.
    3. À l’aide de bâtonnets applicateurs stériles en bois à pointe unie, transférez chaque colonie sélectionnée sur une plaque YEPD + chloramphénicol + bénomyle fraîche et tracez pour les colonies individuelles. Effectuez trois stries distinctes.
      1. Strier d’avant en arrière sur un tiers de la plaque à l’aide d’un bâton applicateur. Commencez la deuxième et la troisième série en striant l’applicateur sur la traînée précédente une fois. Utilisez un nouveau bâton applicateur pour chaque traînée.
        REMARQUE: Utilisez une plaque par isolat. Jetez les applicateurs immédiatement après utilisation pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.
    4. Empilez les assiettes dans des sacs en plastique, scellez et incubez à l’envers pendant 2-3 jours à la même température que celle utilisée précédemment jusqu’à ce que des colonies individuelles deviennent visibles.
  6. Identification des espèces de levures par séquençage ITS
    1. Sélectionnez une colonie unique bien séparée par isolat de sol et par sous-culture sur une plaque fraîche YEPD + chloramphénicol + bénomyle pour obtenir plus de cellules. Incuber pendant 2-3 jours à la même température utilisée précédemment.
    2. Récoltez les cellules fraîchement cultivées et suspendez-les dans des tubes congélateurs à -80 °C contenant 1 mL de glycérol stérilisé à 30 % dans de l’eau distillée en double pour créer des suspensions cellulaires. Maintenir ces suspensions à -80 °C en tant que solutions mères.
    3. Utilisez des cellules fraîches pour effectuer la PCR des colonies (réaction en chaîne par polymérase) avec les amorces ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') et ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') pour amplifier le gène de codage à barres fongique, ITS9. Utilisez les conditions de thermocyclage suivantes : une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 10 min suivie de 35 cycles de (i) 95 °C pendant 30 s, (ii) 55 °C pendant 30 s et (iii) 72 °C pendant 1 min.
      REMARQUE: La PCR de colonie a un taux de réussite élevé et un délai d’exécution plus rapide que l’extraction de l’ADN suivie de la PCR.
    4. Si la PCR des colonies échoue à plusieurs reprises pour une souche, extrayez l’ADN en utilisant le protocole de votre choix et effectuez la PCR ITS en utilisant l’ADN génomique extrait comme modèle (utilisez les mêmes conditions de thermocyclage que ci-dessus).
      REMARQUE: Une extraction d’ADN à base de chloroforme relativement peu coûteuse est recommandée28.
    5. Effectuez le séquençage de Sanger pour déterminer la séquence d’ADN de la région ITS amplifiée pour chaque souche.
    6. Comparer la séquence ITS obtenue des souches de levure aux séquences déposées dans des bases de données publiques telles que NCBI GenBank et UNITE pour établir l’identité de l’espèce.

2. Isolement d’Aspergillus fumigatus du sol

  1. Préparer 1 mL de bouillon stérile de dextrose Sabouraud (SDB) complété par l’antibiotique chloramphénicol par échantillon de sol.
    1. Ajouter 10 g de peptone et 20 g de dextrose à 1 L d’eau distillée. Autoclave à 121 °C pendant 40 min.
    2. Laisser refroidir le SDB à ~50 °C, ajouter 1 mL de chloramphénicol de 50 g/L pour porter la concentration à 50 mg/L.
      REMARQUE: Le chloramphénicol est préparé de la même manière que décrite ci-dessus pour l’isolement de la levure. En plus d’inhiber la croissance bactérienne, le chloramphénicol empêche également la production de gaz à partir de bactéries qui provoqueront l’ouverture des tubes pendant l’étape d’incubation détaillée à l’étape 2.2.
    3. Aliquote aseptique de 1 mL de SDB dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL par échantillon de sol à l’aide d’une pipette mécanique.
  2. Ajouter la terre dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
    1. Posez un paillasson ou un rembourrage absorbant à l’intérieur d’un BSCII pour aider à l’élimination de la terre renversée.
    2. À l’aide de bâtonnets applicateurs autoclavés, transférer environ 0,1 g de terre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de SBD. Fermer le tube et le vortex. Incuber le sol en suspension à 50 °C pendant 3 jours.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de secouer pendant l’incubation.
  3. Récolte mycélienne de bouillon inoculé au sol
    1. Préparez des assiettes d’agar à l’extrait de malt (MEA).
      1. Par litre de MEA : ajouter 20 g d’extrait de malt, 20 g de dextrose, 6 g de peptone et 15 g de gélose à 1 L d’eau distillée. Autoclave à 121 °C pendant 40 min.
      2. Laisser refroidir le MEA à ~50 °C, puis ajouter 1 mL de chloramphénicol de 50 g/L pour atteindre une concentration finale de 50 mg/L.
    2. Transférer le mycélium du bouillon inoculé dans le sol sur des plaques MEA.
      1. Identifier les inoculums du sol qui ont une croissance mycélienne visible à la limite de l’air SDB.
      2. Utilisez des bâtonnets applicateurs en bois stérilisés à pointe plate pour transférer le mycélium au centre d’une plaque MEA. Incuber les plaques MEA à 37 °C pendant 3 jours.
  4. Sélection de mycéliums aux propriétés morphologiques d’A. fumigatus .
    1. Identifier les colonies de moisissures qui ont des propriétés morphologiques caractéristiques d’A. fumigatus (croissance semblable à celle du daim vert).
    2. En travaillant dans un BSCII, utilisez des bâtonnets applicateurs en bois stérilisés à pointe plate ou une boucle d’inoculation pour récolter les conidies / mycéliums en grattant la surface une fois. Transférer les spores/mycéliums au centre d’une plaque MEA en striant sur la gélose pour des colonies uniques. Incuber à 37 °C pendant 2 jours.
      REMARQUE: Comme plusieurs souches d’A. fumigatus et / ou d’autres champignons peuvent être présents sur la plaque, il est important de strier pour des colonies uniques. Le protocole de stries à colonie unique de l’étape 1.5.3 du protocole d’isolement des levures peut être utilisé.
    3. À l’aide d’un bâton applicateur stérile ou d’une boucle d’inoculation, sous-cultiver une seule colonie générée à l’étape 2.4.1.2 sur MEA en striant la colonie une fois. Étalez les spores récoltées au centre de la plaque. Incuber à 37 °C pendant 2 jours.
  5. Récolte des spores/ mycéliums d’A. fumigatus pour l’entreposage en culture
    1. Préparer une solution stérile de glycérol à 30 % (pour une solution de 100 mL, ajouter 30 mL de glycérol à 100 % mélangé à 70 mL d’eau double distillée, stérilisée à 121 °C pendant 40 min).
    2. En travaillant dans un BSCII, utilisez une pipette p1000 pour aspirer 1 mL de la solution de glycérol à 30%. Distribuer 1 mL de solution de glycérol sur la colonie d’A. fumigatus pour récolter les spores/mycéliums.
      1. En raison de l’hydrophobicité des spores /mycélium d’A. fumigatus , utilisez l’embout de la pipette pour gratter une région densément sporulée de la plaque.
        REMARQUE: Lorsque le glycérol est distribué dans la rayure, le glycérol adhère à la zone de rayure plutôt que de rouler sur la gélose.
      2. Distribuer lentement le glycérol sur la zone de rayure pour déloger les spores et les suspendre dans la solution de glycérol.
      3. Une fois complètement distribué, basculez légèrement la plaque et aspirez la suspension de spores de glycérol / mycélium.
        REMARQUE : Environ 750 à 800 μL seront aspirés.
      4. Transférer l’aspiration dans un tube congélateur stérile et conserver à -80 °C. Si nécessaire, créez un stock de travail en répétant les étapes 2.5.2.1 à 2.5.2.4.
  6. Identification phénotypique des souches d’A. fumigatus
    1. En utilisant le stock de spores créé à partir de l’étape 2.5.2, créez une dilution 100x dans l’eau.
      1. Aspirer 10 μL des stocks de mycélium et de spores et distribuer dans 990 μL d’eau. Vortex la suspension.
    2. Distribuer 10 μL de la suspension de spores diluées sur une lame de microscope standard.
    3. FACULTATIF: Tacher la suspension de mycélien et de spores avec du bleu de méthylène.
      1. Pour tacher avec du bleu de méthylène, fixez les conidies et les conidiophores à la glissière en passant la glissière sur un brûleur Bunsen jusqu’à ce qu’elle soit sèche.
      2. Appliquer le bleu de méthylène pendant 1-2 min et laver à l’eau.
      3. Séchez la diapositive avec du papier buvard.
    4. À l’aide d’un microscope composé à un grossissement de 400x, visualisez la suspension et localisez les conidiophores. Comparez la morphologie des conidiophores observée avec la morphologie des conidiophores d’A. fumigatus .
  7. Identification moléculaire des souches d’A. fumigatus
    1. Extraire l’ADN de chaque isolat en suivant les protocoles courants d’extraction de l’ADN fongique.
    2. À l’aide d’amorces spécifiques aux gènes aspergillus β-tubuline (β-tub1 et β-tub4), exécutez la PCR et obtenez la séquence des produits amplifiés, en suivant les protocoles décrits par Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Comparez les séquences obtenues aux séquences déposées dans des bases de données publiques telles que NCBI GenBank à l’aide de BLAST.
      2. Vérifiez que les séquences de déformation correspondent le mieux aux séquences d’A. fumigatus dans la base de données.
    3. Alternativement à l’étape 2.7.2, exécuter une réaction PCR multiplex ciblant les types d’accouplement A. fumigatus MAT1-1 et MAT1-229.
      1. Utilisez les trois séquences d’amorce suivantes dans la réaction de PCR multiplex : AFM1 : 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3' ; AFM2 : 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Utilisez les paramètres de thermocycleur suivants : 5 min à 95 °C, 35 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s à 60 °C et 1 min à 72 °C avant un dernier 5 min à 72 °C.
      3. Exécuter l’électrophorèse sur gel pour identifier les produits; recherchez 834 bp MAT-1 ou 438 bp MAT1-2. Utilisez des souches d’A. fumigatus qui ont confirmé l’amplification de type d’accouplement comme témoins positifs et négatifs.
  8. Génotypage microsatellite de souches d’A. fumigatus par analyse de fragments
    REMARQUE : Bien que les étapes énumérées ci-dessous couvrent largement le génotypage d’A. fumigatus à neuf loci de microsatellite (STR), seules quelques considérations importantes ont été mises en évidence. Pour plus de détails sur le génotypage STR d’A. fumigatus, voir De Valk et al.24,30.
    1. Préparez trois mélanges maîtres multiplex PCR à l’aide des amorces STRAf décrites précédemment par De Valk et al.24.
      1. Marquez par fluorescence les amorces avant pour déterminer la taille du fragment par électrophorèse capillaire. S’assurer que la concentration des amorces avant est la moitié (0,5 μM) de celle des amorces inverses (1 μM) dans le mélange maître.
        REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, utilisez des étiquettes fluorescentes dont les longueurs d’onde d’absorbance correspondent à celles de l’étalon de colorant choisi utilisé lors de l’électrophorèse capillaire.
      2. Utilisez la polymérase de démarrage à chaud pour de meilleurs résultats.
      3. Utilisez une concentration d’ADN de 0,1 ng par réaction.
    2. Exécutez la PCR multiplex pour chaque souche à l’aide du programme de PCR suivant : 95 °C pendant 10 min, 40 cycles de 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 60 s, suivis de 72 °C pendant 10 min et d’un maintien à 4 °C.
    3. Vérifiez la présence de produits amplifiés par électrophorèse sur gel.
    4. Diluer les produits au niveau souhaité (généralement ~ 50x) comme recommandé par les spécialistes de l’analyse de fragments et exécuter l’électrophorèse capillaire. Effectuez trois essais pour chaque souche, chaque essai couvrant trois réactions multiplexées avec trois sondes fluorescentes différentes.
    5. Pour déterminer la taille de fragment correcte pour chacun des neuf loci STR, utilisez un logiciel capable d’analyser des fragments.
      1. Récupérer les données brutes obtenues par électrophorèse capillaire. Notez la taille des fragments en fonction du pic le plus élevé à l’aide du logiciel d’analyse de fragments (par exemple, Osiris).
      2. Convertissez les tailles de fragment en nombres répétés pour chacun des neuf loci. Utilisez les tailles de fragment des nombres de répétition de la souche de référence Af293 comme décrit précédemment par De Valk et al.24.
        REMARQUE: De légères variations dans la taille des fragments peuvent se produire entre différentes plates-formes d’électrophorèse capillaire. Ainsi, il est important d’inclure une souche de référence commune (et une échelle interne) avec une taille de fragment connue pour chacun des neuf loci pour les souches de génotypage.

Résultats

Isolement des levures du sol
Le protocole d’isolement des levures ci-dessus a été mis en œuvre pour cultiver des levures à partir d’échantillons de sol provenant de 53 sites dans neuf pays 9,12. Au total, 1 473 souches de levure ont été isolées à partir de 3 826 échantillons de sol. Compte tenu des conditions climatiques différentes des neuf pays d’origine, la meilleure température d’incubation pour chaque pays a été dét...

Discussion

Le protocole développé pour isoler les levures et A. fumigatus du sol est une méthode rapide et efficace pour le traitement du sol à haut débit et l’isolement fongique. Le protocole ne nécessite qu’une petite quantité de sol (0,1-0,2 g) par échantillon, ce qui permet d’échantillonner plus de sites avec un effort similaire. Le délai d’exécution rapide garantit que les résultats peuvent être obtenus dans un court laps de temps et laisse le temps de dépanner et de répéter les expériences si...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no. ALLRP 570780-2021) et l’Université McMaster.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeSarstedt Inc72.690.001
Benomyl powder Toronto Research ChemicalsB161380
Chloramphenicol powder Sigma-AldrichSKU: C0378-5G
DextroseSigma-AldrichSKU: D9434-500G
Fragment Analysis SoftwareNCBI's Osirishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence databaseNCBI GenBank https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence databaseUNITE https://unite.ut.ee/
PeptoneSigma-AldrichSKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders Fisher Scientific08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes Sarstedt Inc83.3902
Sterile 13 mL culture tubes Sarstedt Inc62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks Fisher Scientific23-400-112
Yeast extractSigma-AldrichSKU: Y1625-250G

Références

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