Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Zusammenfassung

Der Boden beherbergt eine unglaubliche Menge an mikrobiellem Leben, wobei jedes Gramm bis zu Milliarden von bakteriellen, archaealen und Pilzzellen enthält. Mehrzellige Pilze wie Schimmelpilze und einzellige Pilze, die allgemein als Hefen definiert werden, spielen in Bodenökosystemen eine wesentliche Rolle als Zersetzer von organischem Material und als Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner. Die Vielfalt der Pilzarten im Boden hängt von einer Vielzahl von klimatischen Faktoren wie Niederschlag und Temperatur sowie von Bodeneigenschaften wie organischer Substanz, pH-Wert und Feuchtigkeit ab. Das Fehlen angemessener Umweltproben, insbesondere in Regionen Asiens, Afrikas, Südamerikas und Mittelamerikas, behindert die Charakterisierung von Bodenpilzgemeinschaften und die Entdeckung neuartiger Arten.

Wir charakterisierten Bodenpilzgemeinschaften in neun Ländern auf sechs Kontinenten anhand von ~ 4.000 Bodenproben und einem im Labor entwickelten Protokoll zur Isolierung von Hefen und Schimmelpilzen. Dieses Protokoll beginnt mit einer separaten selektiven Anreicherung für Hefen und den medizinisch relevanten Schimmelpilz Aspergillus fumigatus in flüssigen Medien unter Hemmung des Bakterienwachstums. Resultierende Kolonien werden dann in feste Medien übertragen und weiterverarbeitet, um Reinkulturen zu erhalten, gefolgt von einer nachgelagerten genetischen Charakterisierung. Die Identität der Hefespezies wird durch Sequenzierung ihrer internen transkribierten Spacer (ITS) -Region des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters festgestellt, während die globale Populationsstruktur von A. fumigatus mittels Mikrosatelliten-Markeranalyse untersucht wird.

Das Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um Bodenhefe- und A. fumigatus-Populationen in Kamerun, Kanada, China, Costa Rica, Island, Peru, Neuseeland und Saudi-Arabien zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Ergebnisse zeigten dringend benötigte Einblicke in globale Muster in der Bodenhefediversität sowie in die globale Populationsstruktur und antimykotische Resistenzprofile von A. fumigatus. In diesem Beitrag wird die Methode zur Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus internationalen Bodenproben vorgestellt.

Einleitung

Pilze in Bodenökosystemen spielen eine wesentliche Rolle bei der Zersetzung organischer Stoffe, dem Nährstoffkreislauf und der Bodendüngung¹. Sowohl kulturunabhängige (d.h. Hochdurchsatz-Sequenzierung) als auch kulturabhängige Ansätze werden häufig bei der Untersuchung von Bodenpilzen ^2,3 eingesetzt. Während die große Datenmenge, die durch die Hochdurchsatz-Metabarcode-Sequenzierung generiert wird, nützlich ist, um breit angelegte Muster in der Gemeinschaftsstruktur und -diversität aufzuklären, kann der kulturabhängige Ansatz sehr komplementäre Informationen über die taxonomischen und funktionellen Strukturen von Pilzgemeinschaften sowie spezifischere Profile einzelner Organismen durch nachgelagerte Diversitäts- und Funktionsanalysen aufgrund der Verfügbarkeit reiner Pilzkulturen liefern.

Obwohl sie selten Tausende von Zellen pro Gramm Boden überschreiten, sind Hefen, die allgemein als einzellige Pilze definiert werden, essentielle Zersetzer und Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner ^4,5. Tatsächlich können Hefen die vorherrschenden Bodenpilze in kalten Biosphären wie der kontinentalen Antarktis^{sein 6,7}. Der Boden ist auch ein primäres Reservoir für medizinisch relevante Hefen, die beim Menschen und anderen Säugetieren schwere opportunistische Infektionen verursachen⁸. Trotz morphologischer Ähnlichkeiten sind Hefearten phylogenetisch vielfältig und kommen unter filamentösen Pilzen in zwei Hauptstämmen, Ascomycota und Basidiomycota, innerhalb des Pilzreichs⁹ vor. Hefen fehlt eine definierende DNA-Signatur am pilzlichen Barcoding-Gen, der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters¹⁰, was sie in metagenomischen Untersuchungen nicht von anderen Pilzen unterscheidbar macht und daher den Einsatz kulturabhängiger Methoden zur Isolierung von Hefearten erfordert.

Das folgende Protokoll wurde implementiert, um Bodenhefegemeinschaften von neun Ländern zu charakterisieren und globale Trends und Muster in der Bodenhefediversität^zu identifizieren 9,11,12. Metagenomik-Ansätze sind von begrenztem Nutzen bei der Untersuchung von Zielgruppen von Organismen wie Hefen ^2,3. Aufgrund ihrer phylogenetischen Vielfalt können Hefen allein aufgrund der DNA-Sequenz nicht von anderen Pilzen unterschieden werden. Daher erfordert die Untersuchung von Hefepopulationen die fortgesetzte Verwendung einer kulturabhängigen Isolation. Die Kultivierung ist jedoch oft deutlich zeitaufwendiger und erfordert mehr Personal, um die Experimente durchzuführen. Daher wurde das Protokoll für eine schnellere Verarbeitung mit begrenztem Personal optimiert und optimiert. Der Hauptvorteil der Kultivierung besteht darin, dass die identifizierten Hefearten lebende Hefen und keine toten sind und daher eher echte Bodenbewohner als vorübergehende Zellen in den Böden sind. Es wurde geschätzt, dass etwa 40% der Pilz-DNA im Boden entweder Verunreinigungen aus anderen Umgebungen, extrazellulär sind oder aus Zellen stammen, die nicht mehr intakt sind, was dazu führt, dass Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze den Pilzreichtum um bis zu 55% ^{überschätzen13.} Kulturabhängige Isolierung kann die Identität von Hefearten leicht bestätigen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass die Reinkultur für die Verwendung in nachgelagerten Analysen gesichert wird. Tatsächlich wurden Reinkulturen von 44 mutmaßlichen neuen Hefearten unter Verwendung dieses Bodenisolationsprotokolls identifiziert, das die Verwendung einer Reihe von Methoden zur detaillierten Untersuchung ihrer taxonomischen und funktionellen Eigenschaften^{ermöglichte 14}.

Das folgende Protokoll kann auch verwendet werden, um im Boden vorhandene Formen wie A. fumigatus zu isolieren. Aspergillus fumigatus ist ein thermophiler und saprophytischer Schimmelpilz mit einer weiten, globalen Verbreitung im Boden¹⁵. Es wurde aus zahlreichen klinischen und nicht-klinischen Umgebungen isoliert. Nicht-klinische Probenahmen umfassen üblicherweise Luft, organische Ablagerungen (Kompost, Sägestaub, Tulpenzwiebelabfälle) und Boden (landwirtschaftliche, gartenbezogene und natürliche Böden) 16,17,18,19. Aspergillus fumigatus ist ein humaner opportunistischer Erreger, der eine Reihe von Infektionen verursacht, die zusammen als Aspergillose bezeichnet werden und über 8 Millionen Menschen weltweit^{betreffen 16,20}. Etwa 300.000 Menschen auf der ganzen Welt leiden an invasiver Aspergillose, der schwersten Form der Aspergillose¹⁶. Abhängig von Faktoren wie der Patientenpopulation, dem Infektionsort und der Wirksamkeit der antimykotischen Therapie kann die Sterblichkeitsrate bis zu 90% betragen. In den letzten Jahrzehnten hat die Resistenz gegen antimykotische Therapien zugenommen, was globale Überwachungsbemühungen sowohl in klinischen als auch in Umweltpopulationen erfordert, um diese Resistenzgenotypen^21,22,23 zu verfolgen. Aufgrund seiner Fähigkeit, bei Temperaturen von über 50 ° C zu wachsen, kann diese Temperatur genutzt werden, um A. fumigatus-Isolate aus dem Boden mit kulturabhängigen Methoden auszuwählen. Aspergillus fumigatus-Isolate werden üblicherweise an neun hochpolymorphen STR-Loci (Short Tandem Repeat) genotypisiert, von denen gezeigt wird, dass sie eine hohe Unterscheidungskraft zwischen den Stämmen^{aufweisen 24}. Diese STR-Genotypen können mit anderen zuvor untersuchten Populationen verglichen werden, um die Ausbreitung von A. fumigatus-Genotypen, einschließlich Arzneimittelresistenzgenen, auf der ganzen Welt zu verfolgen.

Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Isolation von Hefen und A. fumigatus aus Bodenproben in kulturabhängiger Weise. Abhängig von der Menge an Boden, die pro Probe erhalten wird, können die Bodenproben zwischen den beiden Protokollen geteilt werden. Im Vergleich zu ähnlichen Methoden, die Hefe und A. fumigatus aus dem Boden isolieren, verwendet dieses Protokoll 10x weniger Boden pro erhaltenem Isolat. Studien, die versuchen, A. fumigatus aus dem Boden zu isolieren, erfordern zwischen 1 und 2 g Boden pro Isolat, während dieses Protokoll nur 0,1-0,2 g Boden^18,19,25 erfordert. Dieses Protokoll verwendet kleinere Kunststoffe und Behälter, die das Hochdurchsatzdesign erleichtern. Daher kann eine größere Anzahl von Proben mit weniger Platz für Geräte wie Inkubatoren und Walzentrommeln verarbeitet werden. Bodenproben können in nur 7 Tagen vollständig verarbeitet werden, um Isolate zu erhalten. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Verarbeitung von bis zu 150-200 Proben pro Tag und Person zu ermöglichen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Schritte, bei denen internationale Bodenproben und/oder A. fumigatus-Sporen und Myzelien verwendet werden, müssen in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe 2 (BSCII) gearbeitet werden.

1. Isolierung von Hefe aus dem Boden

1. Herstellung von antibakteriellen und antimykotischen Lösungen
   1. Suspendieren Sie Chloramphenicolpulver in 70% Ethanol, um eine 50 g / L Stammlösung herzustellen. Durch Spritzenfiltration sterilisieren und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Dieses Antibiotikum verhindert das Wachstum der meisten Bakterien während der Bodenhefe-Isolierung. Da Chloramphenicol-resistente Bakterien noch wachsen können, muss die Koloniemorphologie bei der Unterscheidung von Hefen und Bakterien sorgfältig berücksichtigt werden. Bei der Arbeit mit Böden, die im Verdacht stehen, antibiotikaresistente Bakterienstämme zu enthalten, können den Medien zusätzliche Antibiotika zugesetzt werden. Bakterielle Kontamination in chloramphenicol-ergänzten Medien war kein Problem bei der Isolierung von Hefen aus Umweltböden.
   2. Suspend Benomylpulver in DMSO, um eine 5 g / L Stammlösung herzustellen. Durch Spritzenfiltration sterilisieren und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Dieses selektive Antimykotikum verhindert das Wachstum der meisten fadenförmigen Pilze, ohne das Hefewachstum während der Bodenhefeisolierung^{zu beeinträchtigen 26,27}.
2. Vorbereitung von Nährmedien und Sterilgutgeräten
   1. Um YEPD (Hefeextrakt-Pepton-Dextrose) Brühe herzustellen, fügen Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Dextrose zu 1 L doppelt destilliertem Wasser hinzu. Gut vermischt umrühren und 40 min bei 121 °C autoklavieren. Bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur lagern.
   2. YEPD festes Agarmedium
      1. Mischen Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Dextrose und 20 g Agar in 1 L Wasser. Gut rühren zum Mischen und Autoklavieren für 40 min bei 121 °C.
      2. Nach ausreichendem Abkühlen 1 ml Chloramphenicol und Benomyl aus Stammlösungen hinzufügen, um die Endkonzentrationen der beiden antimikrobiellen Mittel auf 50 mg/L bzw. 5 mg/L zu erhöhen.
      3. Unter Rühren gut vermischen und in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm gießen. Bei Raumtemperatur über Nacht einwirken lassen und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.
         HINWEIS: Aus 1 L YEPD können ca. 40 Platten gegossen werden.
   3. Sterilisieren Sie Holz-Applikatorstäbchen mit einfacher Spitze und wiederverwendbare Zellstreuer durch Autoklavieren und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
3. Inkubation von Erde in flüssiger Brühe
   1. Bereiten Sie einen Satz steriler 13-ml-Kulturröhrchen vor, indem Sie sie mit der Bodenproben-ID kennzeichnen.
   2. Mit einer serologischen Pipette 5 ml YEPD-Brühe mit Chloramphenicol und Benomyl in jede Tube geben.
   3. Wenn Sie in einem BSCII arbeiten, übertragen Sie ~ 0,1 g Erde in das entsprechende Kulturrohr mit einem sterilen, hölzernen Applikator mit glatter Spitze.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Bodenprobe einen frischen Applikator und verwerfen Sie ihn sofort nach der Verwendung, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
   4. Verschließen Sie das Rohr sicher bis zum ersten Anschlag, um ein Verschütten zu verhindern, aber dennoch den Luftaustausch während der Inkubation zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Kulturröhrchen in einer Walzentrommel für 24 h bei einer Temperatur, die als optimal für die Maximierung des Hefewachstums angesehen wird.
      HINWEIS: Die Inkubationstemperatur sollte auf der Grundlage der mittleren Jahrestemperatur des Herkunftslandes der Bodenproben festgelegt werden. So wurden beispielsweise bei der Isolierung von Bodenhefen aus Island die Kulturröhren bei 14 °C inkubiert, während Böden aus Saudi-Arabien bei 30 °C inkubiert wurden. Aufgrund des langsameren Hefewachstums bei niedrigeren Temperaturen muss die Inkubationszeit möglicherweise auf bis zu 72 h verlängert werden.
4. Übertragen Sie den Überstand auf das feste Medium.
   1. Beschriften Sie diese mit dem Satz YEPD + Chloramphenicol + Benomylagarplatten, der in Schritt 1.2 hergestellt wurde, mit der Bodenproben-ID.
   2. Entfernen Sie die in Schritt 1.3 vorbereiteten Kulturröhrchen von der Walzentrommel. Arbeiten Sie in einem BSCII und wirbeln Sie die Röhre kurzzeitig um, um Bodenpartikel und Zellen, die sich möglicherweise unten abgesetzt haben, wieder in die Suspension zu ziehen.
   3. Übertragen Sie mit einer Mikropipette 100 μL des Überstands auf eine Platte. Verwenden Sie einen sterilen, wiederverwendbaren Zellstreuer, um die Flüssigkeit gründlich und gleichmäßig über die Agaroberfläche zu verteilen.
      HINWEIS: Das Arbeiten in Sätzen von 10 Proben kann diesen Prozess erheblich beschleunigen. Den Überstand zuerst auf 10 Platten pipettieren und dann verteilen. Verwenden Sie für jede Probe einen frischen Streuer, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
   4. Stapeln Sie die Platten in Plastiktüten, versiegeln Sie sie und inkubieren Sie sie 2-3 Tage lang kopfüber bei der gleichen Temperatur, die zuvor für die Inkubation von Flüssigbrühe verwendet wurde, bis mikrobielles Wachstum sichtbar ist.
5. Nachweis von Hefen und Streifen für einzelne Kolonien
   1. Nachdem Sie eine ausreichende Inkubationszeit (typischerweise 2-3 Tage, aber bei niedrigeren Temperaturen länger dauern können) eingeplant haben, untersuchen Sie die Platten in einem BSCII auf Hefewachstum. Suchen Sie nach cremigen, runden, matten Hefen, die sich leicht von Bakterien- und Schimmelpilzkolonien unterscheiden lassen.
      HINWEIS: Einige Hefen produzieren farbige Pigmente und können schwarz / braun, gelb oder rot erscheinen, aber ihre allgemeine Kolonietextur und -form würde nicht pigmentierten Hefen ähneln.
   2. Wählen Sie aus jeder Platte eine hefeartige Kolonie für die weitere Verarbeitung aus.
      HINWEIS: Wenn mehr als eine Art von Morphologie auf einer einzelnen Platte beobachtet wird, wählen Sie eine repräsentative Kolonie für jeden morphologischen Typ aus.
   3. Übertragen Sie jede ausgewählte Kolonie mit sterilen, einfachen Applikatorstäbchen aus Holz auf eine frische YEPD + Chloramphenicol + Benomylplatte und einen Streifen für einzelne Kolonien. Führen Sie drei separate Streifen aus.
      1. Streichen Sie mit einem Applikatorstab über ein Drittel der Platte hin und her. Beginnen Sie den zweiten und dritten Streifen, indem Sie den Applikator einmal über den vorhergehenden Streifen streichen. Verwenden Sie für jeden Streifen einen neuen Applikatorstick.
         HINWEIS: Verwenden Sie eine Platte pro Isolat. Entsorgen Sie Applikatoren sofort nach der Verwendung, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
   4. Stapeln Sie die Platten in Plastiktüten, versiegeln Sie sie und inkubieren Sie sie 2-3 Tage lang kopfüber bei der gleichen Temperatur, die zuvor verwendet wurde, bis einzelne Kolonien sichtbar werden.
6. Identifizierung von Hefearten mittels ITS-Sequenzierung
   1. Wählen Sie eine gut getrennte, einzelne Kolonie pro Bodenisolat und Subkultur auf einer frischen YEPD + Chloramphenicol + Benomylplatte, um mehr Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie für 2-3 Tage bei der gleichen Temperatur, die zuvor verwendet wurde.
   2. Ernten Sie die frisch gewachsenen Zellen und suspendieren Sie sie in -80 ° C Gefrierröhrchen mit 1 ml sterilisiertem 30% Glycerin in doppelt destilliertem Wasser, um Zellsuspensionen herzustellen. Halten Sie diese Suspensionen bei -80 °C als Standardlösungen.
   3. Verwenden Sie frische Zellen, um eine Kolonie-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) mit den Grundierungen ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGGG 3') und ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') durchzuführen, um das pilzliche Barcoding-Gen, ITS⁹, zu amplifizieren. Verwenden Sie die folgenden Thermozyklusbedingungen: einen ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von (i) 95 °C für 30 s, (ii) 55 °C für 30 s und (iii) 72 °C für 1 min.
      HINWEIS: Die Colony PCR hat eine hohe Erfolgsquote und eine schnellere Bearbeitungszeit als die DNA-Extraktion mit anschließender PCR.
   4. Wenn die Kolonie-PCR für einen Stamm wiederholt ausfällt, extrahieren Sie die DNA mit dem Protokoll der Wahl und führen Sie eine ITS-PCR mit extrahierter genomischer DNA als Vorlage durch (verwenden Sie die gleichen Thermocycling-Bedingungen wie oben).
      HINWEIS: Eine relativ kostengünstige DNA-Extraktion auf Chloroformbasis^{wird empfohlen 28}.
   5. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um die DNA-Sequenz der amplifizierten ITS-Region für jeden Stamm zu bestimmen.
   6. Vergleichen Sie die erhaltene ITS-Sequenz der Hefestämme mit Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie NCBI GenBank und UNITE hinterlegt sind, um die Artenidentität festzustellen.

2. Isolierung von Aspergillus fumigatus aus dem Boden

1. Bereiten Sie 1 ml sterile Sabouraud-Dextrose-Brühe (SDB) vor, die mit dem Antibiotikum Chloramphenicol pro Bodenprobe ergänzt wird.
   1. Fügen Sie 10 g Pepton und 20 g Dextrose zu 1 L destilliertem Wasser hinzu. Autoklav bei 121 °C für 40 min.
   2. Lassen Sie das SDB auf ~ 50 ° C abkühlen, fügen Sie 1 ml 50 g / L Chloramphenicol hinzu, um die Konzentration auf 50 mg / L zu bringen.
      HINWEIS: Chloramphenicol wird wie oben beschrieben für die Hefeisolierung hergestellt. Neben der Hemmung des Bakterienwachstums verhindert Chloramphenicol auch die Produktion von Gas aus Bakterien, das dazu führt, dass sich die Röhrchen während des in Schritt 2.2 beschriebenen Inkubationsschritts öffnen.
   3. Aseptisch aliquotiert 1 ml SDB in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Bodenprobe mit einer mechanischen Pipette.
2. Fügen Sie Erde zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
   1. Verlegen Sie eine Bankschicht oder eine saugfähige Polsterung in einem BSCII, um die Entsorgung von verschüttetem Boden zu erleichtern.
   2. Übertragen Sie mit autoklavierten Applikatorstäben etwa 0,1 g Erde in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml SBD enthält. Schließen Sie die Röhre und den Vortex. Inkubieren Sie den suspendierten Boden bei 50 °C für 3 Tage.
      HINWEIS: Ein Schütteln während der Inkubation ist nicht erforderlich.
3. Myzelernte von bodengeimpfter Brühe
   1. Bereiten Sie Malzextrakt-Agar (MEA) -Platten vor.
      1. Pro Liter MEA: 20 g Malzextrakt, 20 g Dextrose, 6 g Pepton und 15 g Agar zu 1 L destilliertem Wasser hinzufügen. Autoklav bei 121 °C für 40 min.
      2. Lassen Sie das MEA auf ~ 50 ° C abkühlen, und fügen Sie dann 1 ml 50 g / L Chloramphenicol hinzu, um eine Endkonzentration von 50 mg / L zu erreichen.
   2. Übertragen Sie die Myzelien aus der bodengeimpften Brühe auf MEA-Platten.
      1. Identifizieren Sie Bodeninokule, die sichtbares Myzelwachstum an der SDB-Luftgrenze aufweisen.
      2. Verwenden Sie sterilisierte Applikatorstäbe mit einfacher Holzspitze, um die Myzelie in die Mitte einer MEA-Platte zu übertragen. Inkubieren Sie die MEA-Platten bei 37 °C für 3 Tage.
4. Selektion von Myzelien mit morphologischen Eigenschaften von A. fumigatus.
   1. Identifizieren Sie Schimmelpilzkolonien, die charakteristische morphologische Eigenschaften von A. fumigatus aufweisen (grünes Wildleder wie Wachstum).
   2. Wenn Sie in einem BSCII arbeiten, verwenden Sie sterilisierte Applikatorstäbchen mit einfacher Holzspitze oder eine Impfschleife, um Konidien / Myzelien zu ernten, indem Sie die Oberfläche einmal abkratzen. Übertragen Sie die Sporen / Myzelien in die Mitte einer MEA-Platte, indem Sie für einzelne Kolonien auf das Agar streifen. 2 Tage bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Da mehrere A. fumigatus-Stämme und / oder andere Pilze auf der Platte vorhanden sein können, ist es wichtig, nach einzelnen Kolonien zu streifen. Das Einzelkolonie-Streifenprotokoll in Schritt 1.5.3 im Hefeisolationsprotokoll kann verwendet werden.
   3. Subkulturieren Sie mit einem sterilen Applikatorstab oder einer Impfschleife eine einzelne Kolonie, die in Schritt 2.4.1.2 erzeugt wurde, auf MEA, indem Sie die Kolonie einmal streifen. Verteilen Sie die geernteten Sporen in der Mitte des Tellers. 2 Tage bei 37 °C inkubieren.
5. Ernte von A. fumigatus Sporen/Myzelien zur Kulturlagerung
   1. Bereiten Sie eine sterile 30% ige Glycerinlösung vor (für eine 100 ml Lösung fügen Sie 30 ml 100% Glycerin hinzu, gemischt mit 70 ml doppelt destilliertem Wasser, sterilisiert bei 121 ° C für 40 min).
   2. Wenn Sie in einem BSCII arbeiten, verwenden Sie eine p1000-Pipette, um 1 ml der 30% igen Glycerinlösung abzusaugen. Geben Sie die 1 ml Glycerinlösung auf die A. fumigatus-Kolonie ab, um Sporen / Myzelien zu ernten.
      1. Aufgrund der Hydrophobie von A. fumigatus Sporen/Myzelien verwenden Sie die Pipettenspitze, um eine dicht sporulierte Region der Platte zu zerkratzen.
         HINWEIS: Wenn Glycerin im Kratzer abgegeben wird, würde das Glycerin an der Kratzfläche haften, anstatt über den Agar zu rollen.
      2. Geben Sie das Glycerin langsam auf den Kratzbereich ab, um die Sporen zu entfernen und in der Glycerinlösung zu suspendieren.
      3. Nach vollständiger Abgabe die Platte leicht kippen und die Glycerinspore / Myzeliensuspension abpumpen.
         HINWEIS: Etwa 750 bis 800 μL werden abgesaugt.
      4. Das Aspirat in ein steriles Gefrierrohr geben und bei -80 °C lagern. Erstellen Sie bei Bedarf Arbeitsmaterial, indem Sie die Schritte 2.5.2.1 bis 2.5.2.4 wiederholen.
6. Phänotypische Identifizierung von A. fumigatus-Stämmen
   1. Erzeugen Sie mit dem aus Schritt 2.5.2 erstellten Sporenstock eine 100-fache Verdünnung in Wasser.
      1. 10 μL der Myzel- und Sporenbestände aspirieren und in 990 μL Wasser dosieren. Wirbeln Sie die Aufhängung ein.
   2. Dosieren Sie 10 μL der verdünnten Sporensuspension auf einen Standard-Objektträger.
   3. OPTIONAL: Färben Sie die Myzel- und Sporensuspension mit Methylenblau.
      1. Um mit Methylenblau zu färben, fixieren Sie die Konidien und Konidiophoren auf dem Objektträger, indem Sie das Dia über einen Bunsenbrenner führen, bis es trocken ist.
      2. Methylenblau für 1-2 min auftragen und mit Wasser abwaschen.
      3. Trocknen Sie den Objektträger mit Löschpapier.
   4. Mit einem zusammengesetzten Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung können Sie die Suspension betrachten und Konidiophoren lokalisieren. Vergleichen Sie die beobachtete Konidiophoremorphologie mit der A. fumigatus conidiophore Morphologie.
7. Molekulare Identifizierung von A. fumigatus-Stämmen
   1. Extrahieren Sie DNA aus jedem Isolat nach gängigen DNA-Extraktionsprotokollen für Pilze.
   2. Unter Verwendung von Primern, die für die Aspergillus-β-Tubulin-Gene (β-tub1 und β-tub4) spezifisch sind, führen Sie eine PCR durch und erhalten Sie die Sequenz für die amplifizierten Produkte gemäß den von Alcazar-Fuoli et al.17 beschriebenen Protokollen.
      1. Vergleichen Sie die erhaltenen Sequenzen mit Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie NCBI GenBank mit BLAST hinterlegt sind.
      2. Vergewissern Sie sich, dass die Dehnungssequenzen mit den A. fumigatus-Sequenzen in der Datenbank übereinstimmen.
   3. Alternativ zu Schritt 2.7.2 wird eine Multiplex-PCR-Reaktion durchgeführt, die auf die A. fumigatus-Paarungstypen MAT1-1 und MAT1-2²⁹ abzielt.
      1. Verwenden Sie die folgenden drei Primersequenzen in der Multiplex-PCR-Reaktion: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGGGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Parameter: 5 min bei 95 °C, 35 Zyklen à 30 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 1 min bei 72 °C vor letzten 5 min bei 72 °C.
      3. Führen Sie die Gelelektrophorese durch, um die Produkte zu identifizieren. Suchen Sie nach 834 bp MAT-1 oder 438 bp MAT1-2. Verwenden Sie A. fumigatus-Stämme , die die Verstärkung des Paarungstyps als Positiv- und Negativkontrollen bestätigt haben.
8. Mikrosatelliten-Genotypisierung von A. fumigatus-Stämmen durch Fragmentanalyse
   HINWEIS: Obwohl die unten aufgeführten Schritte die Genotypisierung von A. fumigatus an neun Mikrosatelliten (STR) -Loci weitgehend abdecken, wurden nur einige wichtige Überlegungen hervorgehoben. Einzelheiten zur A. fumigatus STR-Genotypisierung finden Sie in De Valk et ^al.24,30.
   1. Bereiten Sie drei PCR-Multiplex-Master-Mixe mit den zuvor von De Valk et ^al.24 beschriebenen STRAf-Primern vor.
      1. Fluoreszierende Markierung von Vorwärtsprimern zur Bestimmung der Fragmentgröße durch Kapillarelektrophorese. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Vorwärtsprimer die Hälfte (0,5 μM) der Konzentration der Reverse-Primer (1 μM) innerhalb des Master-Mixes beträgt.
         HINWEIS: Für die besten Ergebnisse verwenden Sie fluoreszierende Markierungen mit Absorptionswellenlängen, die denen des gewählten Farbstoffstandards entsprechen, der während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
      2. Verwenden Sie Heißstartpolymerase für beste Ergebnisse.
      3. Verwenden Sie eine DNA-Konzentration von 0,1 ng pro Reaktion.
   2. Führen Sie die Multiplex-PCR für jede Belastung mit dem folgenden PCR-Programm durch: 95 °C für 10 min, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 60 s, gefolgt von 72 °C für 10 min und einem Halt bei 4 °C.
   3. Suchen Sie nach verstärkten Produkten durch Gelelektrophorese.
   4. Verdünnen Sie die Produkte auf das gewünschte Niveau (typischerweise ~ 50x), wie von Fragmentanalysespezialisten empfohlen, und führen Sie eine Kapillarelektrophorese durch. Führen Sie drei Durchläufe für jede Dehnung durch, wobei jeder Durchlauf drei gemultiplexte Reaktionen mit drei verschiedenen fluoreszierenden Sonden abdeckt.
   5. Um die richtige Fragmentgröße für jeden der neun STR-Loci zu bestimmen, verwenden Sie eine Software, die zur Fragmentanalyse fähig ist.
      1. Rufen Sie die Rohdaten ab, die bei der Kapillarelektrophorese erhalten wurden. Bewerten Sie die Fragmentgrößen basierend auf dem größten Peak mit der Fragmentanalysesoftware (z. B. Osiris).
      2. Konvertieren Sie die Fragmentgrößen in Wiederholungszahlen für jeden der neun Loci. Verwenden Sie die Fragmentgrößen der Wiederholungsnummern des Referenzstamms Af293, wie zuvor von De Valk et ^al.24 beschrieben.
         HINWEIS: Leichte Abweichungen in der Fragmentgröße können zwischen verschiedenen Kapillarelektrophoreseplattformen auftreten. Daher ist es wichtig, einen gemeinsamen Referenzstamm (und eine interne Leiter) mit bekannter Fragmentgröße für jeden der neun Loci für Genotypisierungsstämme anzugeben.

Ergebnisse

Hefe-Isolierung vom Boden
Das obige Hefe-Isolationsprotokoll wurde umgesetzt, um Hefen aus Bodenproben von 53 Standorten in neun Ländern zu kultivieren ^9,12. Insgesamt wurden 1.473 Hefestämme aus 3.826 Bodenproben isoliert. Angesichts der unterschiedlichen klimatischen Bedingungen der neun Ursprungsländer wurde die beste Inkubationstemperatur für jedes Land auf der Grundlage seiner mittleren Jahrestemperatur ermittelt (Tabelle 1

Diskussion

Das für die Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus dem Boden entwickelte Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Hochdurchsatz-Bodenbearbeitung und Pilzisolation. Das Protokoll erfordert nur eine geringe Menge Boden (0,1-0,2 g) pro Probe, so dass mehr Standorte mit ähnlichem Aufwand beprobt werden können. Die schnelle Durchlaufzeit stellt sicher, dass die Ergebnisse innerhalb eines kurzen Zeitrahmens erzielt werden können, und lässt Zeit für die Fehlerbehebung und bei Bedarf wiederholte E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt Inc	72.690.001
Benomyl powder	Toronto Research Chemicals	B161380
Chloramphenicol powder	Sigma-Aldrich	SKU: C0378-5G
Dextrose	Sigma-Aldrich	SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software	NCBI's Osiris		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database	NCBI GenBank		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database	UNITE		https://unite.ut.ee/
Peptone	Sigma-Aldrich	SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes	Sarstedt Inc	83.3902
Sterile 13 mL culture tubes	Sarstedt Inc	62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112
Yeast extract	Sigma-Aldrich	SKU: Y1625-250G