JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Özet

Toprak, inanılmaz miktarda mikrobiyal yaşama ev sahipliği yapar ve her gram milyarlarca bakteriyel, arkeal ve mantar hücresi içerir. Genel olarak mayalar olarak tanımlanan küfler ve tek hücreli mantarlar gibi çok hücreli mantarlar, toprak ekosistemlerinde organik malzemenin ayrıştırıcıları ve diğer toprak sakinleri için besin kaynakları olarak önemli roller üstlenirler. Topraktaki mantar türü çeşitliliği, yağış ve sıcaklık gibi çok sayıda iklim faktörünün yanı sıra organik madde, pH ve nem gibi toprak özelliklerine bağlıdır. Özellikle Asya, Afrika, Güney Amerika ve Orta Amerika bölgelerinde yeterli çevresel örneklemenin olmaması, toprak mantar topluluklarının karakterizasyonunu ve yeni türlerin keşfedilmesini engellemektedir.

Altı kıtada dokuz ülkedeki toprak mantar topluluklarını ~ 4.000 toprak örneği ve mayaların ve küflerin izolasyonu için laboratuvarda geliştirilen bir protokol kullanarak karakterize ettik. Bu protokol, mayalar ve tıbbi olarak ilgili küf Aspergillus fumigatus için ayrı seçici zenginleştirme ile başlar, sıvı ortamda, bakteri büyümesini inhibe ederken. Elde edilen koloniler daha sonra katı ortama aktarılır ve saf kültürler elde etmek için daha fazla işlenir, ardından aşağı akış genetik karakterizasyonu yapılır. Maya türü kimliği, nükleer ribozomal RNA gen kümesinin iç transkribe edilmiş aralayıcı (ITS) bölgesinin sıralanması yoluyla belirlenirken, A. fumigatus'un küresel popülasyon yapısı mikrosatellit belirteç analizi ile araştırılmaktadır.

Protokol, Kamerun, Kanada, Çin, Kosta Rika, İzlanda, Peru, Yeni Zelanda ve Suudi Arabistan'daki toprak mayası ve A. fumigatus popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için başarıyla uygulandı. Bu bulgular, toprak mayası çeşitliliğindeki küresel modellerin yanı sıra A. fumigatus'un küresel popülasyon yapısı ve antifungal direnç profilleri hakkında çok ihtiyaç duyulan içgörüleri ortaya koydu. Bu yazıda hem mayaların hem de A. fumigatus'un uluslararası toprak örneklerinden izole edilmesi yöntemi sunulmaktadır.

Giriş

Toprak ekosistemlerindeki mantarlar organik madde ayrışması, besin döngüsü ve toprak gübrelemesinde önemli roller oynamaktadır1. Hem kültürden bağımsız (yani, yüksek verimli dizileme) hem de kültüre bağımlı yaklaşımlar, toprak mantarlarının incelenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3. Yüksek verimli metabarkod dizilemesi ile üretilen büyük miktarda veri, topluluk yapısı ve çeşitliliğindeki geniş ölçekli kalıpları aydınlatmak için yararlı olsa da, kültüre bağımlı yaklaşım, mantar topluluklarının taksonomik ve fonksiyonel yapıları hakkında oldukça tamamlayıcı bilgilerin yanı sıra, saf mantar kültürlerinin mevcudiyeti nedeniyle aşağı akış çeşitliliği ve fonksiyonel analizler yoluyla bireysel organizmaların daha spesifik profilleri hakkında da oldukça tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir.

Toprağın gramı başına binlerce hücreyi nadiren aşmasına rağmen, geniş ölçüde tek hücreli mantarlar olarak tanımlanan mayalar, diğer toprak sakinleri için temel ayrıştırıcılar ve besin kaynaklarıdır 4,5. Aslında, mayalar kıtasal Antarktika 6,7 gibi soğuk biyosferlerde baskın toprak mantarları olabilir. Toprak aynı zamanda insanlarda ve diğer memelilerde ciddi fırsatçı enfeksiyonlara neden olan tıbbi olarak ilgili mayaların birincil rezervuarıdır8. Morfolojik benzerliklere rağmen, maya türleri filogenetik olarak çeşitlidir ve mantar krallığı9 içindeki iki ana filumda, Ascomycota ve Basidiomycota'da filamentli mantarlar arasında görülür. Mayalar, mantar barkodlama geninde, nükleer ribozomal RNA gen kümesi10'un iç transkribe edilmiş ara parçası (ITS) bölgesinde tanımlayıcı bir DNA imzasından yoksundur, bu da onları metagenomik araştırmalarda diğer mantarlardan ayırt edilemez hale getirir ve bu nedenle maya türlerini izole etmek için kültüre bağımlı yöntemlerin kullanılmasını gerektirir.

Aşağıdaki protokol, dokuz ülkenin toprak mayası topluluklarını karakterize etmek ve toprak mayası çeşitliliğindeki küresel eğilimleri ve kalıpları belirlemekiçin uygulanmıştır 9,11,12. Metagenomik yaklaşımlar, mayalar 2,3 gibi hedeflenen organizma gruplarını incelerken sınırlı bir şekilde kullanılmaktadır. Filogenetik çeşitliliği nedeniyle, mayalar sadece DNA dizisine dayanan diğer mantarlardan ayırt edilemez. Bu nedenle, maya popülasyonlarını incelemek, kültüre bağımlı izolasyonun sürekli kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, kültürleme genellikle önemli ölçüde daha fazla zaman alıcıdır ve deneyleri gerçekleştirmek için daha fazla personel gerektirir. Bu nedenle, protokol sınırlı personelle daha hızlı işlem için optimize edilmiş ve kolaylaştırılmıştır. Kültürlemenin temel avantajı, tanımlanan maya türlerinin ölü değil canlı mayalar olması ve bu nedenle topraklarda bulunan geçici hücrelerden ziyade gerçek toprak sakinleri olma ihtimalinin daha yüksek olmasıdır. Topraktaki mantar DNA'sının yaklaşık% 40'ının ya diğer ortamlardan, hücre dışı kirleticiler olduğu ya da artık bozulmamış hücrelerden geldiği ve mantar zenginliğini% 55'e kadar abartmak için yüksek verimli dizileme yaklaşımlarına neden olduğu tahmin edilmektedir13. Kültüre bağlı izolasyon, aşağı akış analizlerinde kullanılacak saf kültürün güvence altına alınmasının ek yararı ile maya türlerinin kimliğini kolayca doğrulayabilir. Gerçekten de, 44 varsayılan yeni maya türünün saf kültürleri, taksonomik ve fonksiyonel özelliklerini ayrıntılı olarak incelemek için bir dizi yöntemin kullanılmasına izin veren bu toprak izolasyon protokolü kullanılarak tanımlanmıştır14.

Aşağıdaki protokol, A. fumigatus gibi toprakta bulunan küfleri izole etmek için de kullanılabilir. Aspergillus fumigatus, toprakta geniş, küresel bir dağılıma sahip termofilik ve saprofitik bir küftür15. Çok sayıda klinik ve klinik olmayan ortamdan izole edilmiştir. Klinik olmayan örnekleme genellikle hava, organik döküntü (kompost, testere tozu, lale soğanı atığı) ve toprağı (tarımsal, bahçe ve doğal topraklar) içerir16,17,18,19. Aspergillus fumigatus, dünya çapında 8 milyondan fazla insanı etkileyen, toplu olarak aspergilloz olarak adlandırılan bir dizi enfeksiyona neden olan insan fırsatçı bir patojendir16,20. Dünya çapında yaklaşık 300.000 kişi, aspergillozun en şiddetli şekli olan invaziv aspergillozdan muzdariptir16. Hasta popülasyonu, enfeksiyon yeri ve antifungal tedavinin etkinliği gibi faktörlere bağlı olarak mortalite oranı %90 gibi yüksek olabilmektedir. Son birkaç on yılda, antifungal tedavilere karşı direnç artmış ve bu direnç genotiplerini izlemek için hem klinik hem de çevresel popülasyonlarda küresel sürveyans çabaları gerektirmiştir21,22,23. 50 ° C'ye kadar olan sıcaklıklarda büyüme kabiliyeti göz önüne alındığında, bu sıcaklık, kültüre bağlı yöntemler kullanılarak topraktan A. fumigatus izolatlarını seçmek için kullanılabilir. Aspergillus fumigatus izolatları genellikle dokuz yüksek polimorfik kısa tandem tekrar (STR) lokusunda genotiplendirilir ve suşlar24 arasında yüksek ayırt edici güce sahip olduğu gösterilmiştir. Bu STR genotipleri, ilaca dirençli genler de dahil olmak üzere A. fumigatus genotiplerinin dünya çapında yayılmasını izlemek için daha önce araştırılan diğer popülasyonlarla karşılaştırılabilir.

Aşağıda, mayaların ve A. fumigatus'un toprak örneklerinden kültüre bağlı bir şekilde hızlı bir şekilde izole edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Numune başına elde edilen toprak miktarına bağlı olarak, toprak örnekleri iki protokol arasında paylaşılabilir. Maya ve A. fumigatus'u topraktan izole eden benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol elde edilen izolatın başına 10 kat daha az toprak kullanır. A. fumigatus'u topraktan izole etmeye çalışan çalışmalar, izolat başına 1 ila 2 g toprak gerektirirken, bu protokol sadece 0.1-0.2 g toprak18,19,25 gerektirir. Bu protokol, yüksek verimli tasarımını kolaylaştıran daha küçük plastikler ve kaplar kullanır. Bu nedenle, inkübatörler ve makaralı variller gibi ekipmanlar için daha az alan kullanılarak daha fazla sayıda numune işlenebilir. Toprak örnekleri, 7 gün gibi kısa bir sürede izolatlar elde etmek için tamamen işlenebilir. Bu protokol, kişi başına günde 150-200 numunenin işlenmesine izin verecek şekilde optimize edilmiştir.

Protokol

NOT: Uluslararası toprak örneklerini ve/veya A. fumigatus sporlarını ve miseliyi kullanan herhangi bir adım, seviye 2 organizmalar (BSCII) için bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmayı gerektirir.

1. Mayanın topraktan izolasyonu

  1. Antibakteriyel ve antifungal çözeltilerin hazırlanması
    1. 50 g / L'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için% 70 etanol içinde kloramfenikol tozunu askıya alın. Şırınga filtrasyonu ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu antibiyotik, toprak mayası izolasyonu sırasında çoğu bakterinin büyümesini önleyecektir. Kloramfenikole dirençli bakteriler hala büyüyebileceğinden, mayaları bakterilerden ayırt ederken koloni morfolojisi dikkatlice dikkate alınmalıdır. Antibiyotiğe dirençli bakteri suşları içerdiğinden şüphelenilen toprakla çalışırken ortama ek antibiyotikler eklenebilir. Kloramfenikol takviyeli ortamlarda bakteriyel kontaminasyon, mayaları çevresel topraklardan izole ederken karşılaşılan bir sorun değildi.
    2. 5 g / L'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için DMSO'da benomil tozunu askıya alın. Şırınga filtrasyonu ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu seçici antifungal ilaç, toprak mayası izolasyonu sırasında maya büyümesini etkilemeden çoğu filamentli mantarın büyümesini önler26,27.
  2. Kültür ortamının ve steril ekipmanın hazırlanması
    1. YEPD (Maya Ekstraktı-Pepton-Dekstroz) suyu hazırlamak için, 1 L çift damıtılmış suya 10 g Maya Özü, 20 g pepton ve 20 g dekstroz ekleyin. İyice karışana kadar karıştırın ve 121 ° C'de 40 dakika otoklav yapın. Kullanana kadar oda sıcaklığında saklayınız.
    2. YEPD katı agar ortamı
      1. 10 g maya özü, 20 g pepton, 20 g dekstroz ve 20 g agar'ı 1 L suda karıştırın. Karıştırmak ve otoklav yapmak için iyice karıştırın ve 121 ° C'de 40 dakika boyunca karıştırın.
      2. Yeterince soğutulduktan sonra, iki antimikrobiyalin nihai konsantrasyonlarını sırasıyla 50 mg / L ve 5 mg / L'ye getirmek için stok çözeltilerinden 1 mL kloramfenikol ve benomil ekleyin.
      3. Karıştırarak iyice karıştırın ve 10 cm çapında Petri kaplarına dökün. Kullanana kadar 4 °C'de ayarlamak ve saklamak için gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
        NOT: 1 L YEPD'den yaklaşık 40 plaka dökülebilir.
    3. Ahşap düz uçlu aplikatör çubuklarını ve yeniden kullanılabilir hücre yayıcıları otoklavlama ile sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.
  3. Toprağın sıvı et suyunda inkübasyonu
    1. Steril 13 mL kültür tüplerini toprak numune kimliği ile etiketleyerek hazırlayın.
    2. Serolojik bir pipet kullanarak, her tüpe kloramfenikol ve benomil ile desteklenmiş 5 mL YEPD suyu ekleyin.
    3. Bir BSCII'de çalışırken, steril, ahşap düz uçlu bir aplikatör kullanarak ~ 0.1 g toprağı uygun kültür tüpüne aktarın.
      NOT: Her toprak numunesi için taze bir aplikatör kullanın ve numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için kullanımdan hemen sonra atın.
    4. Dökülmeyi önlemek için tüpü ilk durağa kadar güvenli bir şekilde kapatın, ancak inkübasyon sırasında hava değişimine izin verin. Kültür tüplerini, maya büyümesini en üst düzeye çıkarmak için optimum kabul edilen bir sıcaklıkta 24 saat boyunca bir makaralı tamburda inkübe edin.
      NOT: Kuluçka sıcaklığına, toprak numunelerinin menşe ülkesinin yıllık ortalama sıcaklığına göre karar verilmelidir. Örneğin, toprak mayalarını İzlanda'dan izole ederken, kültür tüpleri 14 ° C'de inkübe edilirken, Suudi Arabistan'dan gelen topraklar 30 ° C'de inkübe edildi. Düşük sıcaklıklarda daha yavaş maya büyümesi nedeniyle, inkübasyon süresinin 72 saate kadar uzatılması gerekebilir.
  4. Süpernatantı katı ortama aktarın.
    1. Adım 1.2'de hazırlanan YEPD + kloramfenikol + benomil agar plakaları setini kullanarak, bunları toprak numune kimliği ile etiketleyin.
    2. Adım 1.3'te hazırlanan kültür tüplerini makaralı tamburdan çıkarın. Bir BSCII'de çalışarak, altta yerleşmiş olabilecek toprak parçacıklarını ve hücreleri tekrar süspansiyona çekmek için tüpü kısaca vorteksleyin.
    3. Bir mikropipet kullanarak, süpernatantın 100 μL'sini bir plakaya aktarın. Sıvıyı agar yüzeyine iyice ve eşit bir şekilde yaymak için steril, yeniden kullanılabilir bir hücre yayıcı kullanın.
      NOT: 10 numuneden oluşan setler halinde çalışmak bu süreci önemli ölçüde hızlandırabilir. Süpernatantı önce 10 plakaya pipetleyin ve ardından yayılma işlemini gerçekleştirin. Numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için her numune için taze bir serpme makinesi kullanın.
    4. Plakaları plastik torbalara istifleyin, kapatın ve mikrobiyal büyüme görünene kadar sıvı et suyu inkübasyonu için daha önce kullanılan aynı sıcaklıkta 2-3 gün boyunca baş aşağı inkübe edin.
  5. Mayaların tespiti ve tek koloniler için çizgiler
    1. Yeterli inkübasyon süresine izin verdikten sonra (tipik olarak 2-3 gün, ancak daha düşük sıcaklıklarda daha uzun sürebilir), herhangi bir maya büyümesi için bir BSCII'deki plakaları inceleyin. Bakteri ve küf kolonilerinden kolayca ayırt edilebilen kremsi, yuvarlak, mat benzeri mayalar arayın.
      NOT: Bazı mayalar renkli pigmentler üretir ve siyah / kahverengi, sarı veya kırmızı görünebilir, ancak genel koloni dokusu ve şekli pigmentli olmayan mayalara benzer olacaktır.
    2. Daha fazla işlem için her plakadan bir maya benzeri koloni seçin.
      NOT: Tek bir plakada birden fazla morfoloji türü gözlenirse, her morfolojik tip için bir temsili koloni seçin.
    3. Steril, ahşap düz uçlu aplikatör çubukları kullanarak, seçilen her koloni taze bir YEPD + kloramfenikol + benomil plakaya ve tek koloniler için çizgiye aktarın. Üç ayrı çizgi gerçekleştirin.
      1. Bir aplikatör çubuğu kullanarak plakanın üçte birinden fazlasını ileri geri çizin. İkinci ve üçüncü çizgiye, aplikatörü önceki çizgi boyunca bir kez çizerek başlayın. Her çizgi için yeni bir aplikatör çubuğu kullanın.
        NOT: İzolat başına bir plaka kullanın. Numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için aplikatörleri kullanımdan hemen sonra atın.
    4. Plakaları plastik torbalara istifleyin, kapatın ve tek koloniler görünür hale gelene kadar daha önce kullanılan sıcaklıkta 2-3 gün boyunca baş aşağı inkübe edin.
  6. Maya türlerinin ITS dizilimi ile tanımlanması
    1. Daha fazla hücre elde etmek için toprak izolatı ve alt kültürü başına taze bir YEPD + kloramfenikol + benomil plaka üzerine iyi ayrılmış, tek bir koloni seçin. Daha önce kullanılan aynı sıcaklıkta 2-3 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
    2. Taze yetiştirilmiş hücreleri hasat edin ve hücre süspansiyonları oluşturmak için çift damıtılmış suda 1 mL sterilize% 30 gliserol içeren -80 ° C dondurucu tüplerinde askıya alın. Bu süspansiyonları stok çözeltileri olarak -80 °C'de tutun.
    3. Mantar barkodlama geni ITS9'u yükseltmek için ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') ve ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') primerleri ile koloni PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) gerçekleştirmek için taze hücreler kullanın. Aşağıdaki termosiklet koşullarını kullanın: 10 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı, ardından 30 s için (i) 95 ° C, (ii) 30 s için 55 ° C ve (iii) 1 dakika için 72 ° C'lik 35 döngü.
      NOT: Koloni PCR'si, DNA ekstraksiyonundan ve ardından PCR'den daha hızlı bir geri dönüş süresine sahiptir.
    4. Koloni PCR'si bir suş için tekrar tekrar başarısız olursa, seçilen protokolü kullanarak DNA'yı çıkarın ve ekstrakte edilmiş genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak ITS PCR'yi gerçekleştirin (yukarıdaki gibi aynı termosiklet koşullarını kullanın).
      NOT: Nispeten ucuz bir kloroform bazlı DNA ekstraksiyonu önerilir28.
    5. Her suş için güçlendirilmiş ITS bölgesinin DNA dizisini belirlemek için Sanger dizilimini gerçekleştirin.
    6. Maya suşlarının elde edilen ITS dizisini, tür kimliğini oluşturmak için NCBI GenBank ve UNITE gibi halka açık veritabanlarında depolanan dizilerle karşılaştırın.

2. Aspergillus fumigatus'un topraktan izolasyonu

  1. Toprak örneği başına antibiyotik kloramfenikol ile desteklenmiş 1 mL steril Sabouraud dekstroz suyu (SDB) hazırlayın.
    1. 1 L damıtılmış suya 10 g pepton ve 20 g dekstroz ekleyin. 40 dakika boyunca 121 °C'de otoklav.
    2. SDB'nin ~ 50 ° C'ye soğumasına izin verin, konsantrasyonu 50 mg / L'ye getirmek için 1 mL 50 g / L kloramfenikol ekleyin.
      NOT: Kloramfenikol, maya izolasyonu için yukarıda tarif edilenle aynı şekilde hazırlanır. Bakteri büyümesini inhibe etmenin yanı sıra, kloramfenikol, Adım 2.2'de ayrıntılı olarak açıklanan inkübasyon adımı sırasında tüplerin açılmasına neden olacak bakterilerden gaz üretimini de önler.
    3. Mekanik pipet kullanarak toprak numunesi başına 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL SDB'yi aseptik olarak alikot edin.
  2. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toprak ekleyin.
    1. Dökülen toprağın bertaraf edilmesine yardımcı olmak için BSCII'nin içine tezgah kaplaması veya emici dolgu dolgusu yerleştirin.
    2. Otoklavlanmış aplikatör çubukları kullanarak, yaklaşık 0.1 g toprağı 1 mL SBD içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Asılı toprağı 3 gün boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Kuluçka sırasında çalkalanması gerekli değildir.
  3. Toprak aşılanmış et suyunun misel hasadı
    1. Malt özü agar (MEA) plakaları hazırlayın.
      1. MEA'nın litresi başına: 1 L damıtılmış suya 20 g malt özü, 20 g dekstroz, 6 g pepton ve 15 g agar ekleyin. 40 dakika boyunca 121 °C'de otoklav.
      2. MEA'nın ~ 50 ° C'ye soğumasına izin verin, ardından 50 mg / L'lik bir son konsantrasyona getirmek için 1 mL 50 g / L kloramfenikol ekleyin.
    2. Miseliyi toprak aşılanmış et suyundan MEA plakalarına aktarın.
      1. SDB'de hava sınırına görünür misel büyümesine sahip toprak inokülumlarını tanımlayın.
      2. Miseliyi bir MEA plakasının merkezine aktarmak için sterilize edilmiş ahşap düz uçlu aplikatör çubukları kullanın. MEA plakalarını 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. A. fumigatus morfolojik özellikleri ile miselinin seçimi.
    1. Karakteristik A. fumigatus morfolojik özelliklerine (yeşil süet benzeri büyüme) sahip küf kolonilerini tanımlayın.
    2. Bir BSCII'de çalışırken, yüzeyi bir kez kazıyarak konidia / miseliyi hasat etmek için sterilize edilmiş ahşap düz uçlu aplikatör çubukları veya bir aşılama döngüsü kullanın. Sporları / miselyaları, tek koloniler için agar üzerine çizerek bir MEA plakasının merkezine aktarın. 2 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Plakada birden fazla A. fumigatus suşu ve / veya diğer mantarlar bulunabileceğinden, tek koloniler için çizgi çizmek önemlidir. Maya izolasyon protokolünde Adım 1.5.3'teki tek kolonili çizgi protokolü kullanılabilir.
    3. Steril bir aplikatör çubuğu veya aşılama döngüsü kullanarak, Adım 2.4.1.2'de üretilen tek bir koloniyi, koloniyi bir kez çizerek MEA'ya alt kültüre alın. Hasat edilen sporları plakanın ortasına yayın. 2 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Kültür depolama için A. fumigatus sporlarının / miselinin toplanması
    1. Steril% 30 gliserol çözeltisi hazırlayın (100 mL'lik bir çözelti için, 70 mL çift damıtılmış su ile karıştırılmış, 40 dakika boyunca 121 ° C'de sterilize edilmiş, 30 mL% 100 gliserol ekleyin).
    2. BSCII'de çalışırken, %30 gliserol çözeltisinin 1 mL'sini aspire etmek için bir p1000 pipet kullanın. Sporları / miselleri hasat etmek için 1 mL gliserol çözeltisini A. fumigatus kolonisine dağıtın.
      1. A. fumigatus sporlarının / miselinin hidrofobikliği nedeniyle, plakanın yoğun sporlanmış bir bölgesini çizmek için pipet ucunu kullanın.
        NOT: Gliserol çizikte dağıtıldığında, gliserol agar üzerinde yuvarlanmak yerine çizik bölgesine yapışır.
      2. Sporları yerinden çıkarmak ve gliserol çözeltisinde askıya almak için gliserolü çizik bölgesine yavaşça dağıtın.
      3. Tamamen dağıtıldıktan sonra, plakayı hafifçe devirin ve gliserol sporu / misel süspansiyonunu aspire edin.
        NOT: Yaklaşık 750 ila 800 μL aspire edilecektir.
      4. Aspiratı steril bir dondurucu tüpe aktarın ve -80 ° C'de saklayın. Gerekirse, 2.5.2.1 ile 2.5.2.4 arasındaki adımları yineleyerek çalışan stok oluşturun.
  6. A. fumigatus suşlarının fenotipik tanımlanması
    1. Adım 2.5.2'den oluşturulan spor stoğunu kullanarak, suda 100x seyreltme oluşturun.
      1. Misel ve spor stoklarının 10 μL'sini aspire edin ve 990 μL suya dağıtın. Süspansiyonu vorteks.
    2. Seyreltilmiş spor süspansiyonunun 10 μL'sini standart bir mikroskop sürgüsüne dağıtın.
    3. İSTEĞE BAĞLI: Misel ve spor süspansiyonunu metilen mavisi ile sabitleyin.
      1. Metilen mavisi ile lekelemek için, kayarlığı kuruyana kadar bir Bunsen brülöründen geçirerek konidia ve konidioforları slayta sabitleyin.
      2. 1-2 dakika boyunca metilen mavisi uygulayın ve suyla yıkayın.
      3. Slaytı kurutma kağıdı ile kurulayın.
    4. 400x büyütmede bileşik bir mikroskop kullanarak, süspansiyonu görüntüleyin ve konidioforları bulun. Gözlenen konidiofor morfolojisini A. fumigatus conidiophore morfolojisi ile karşılaştırın.
  7. A. fumigatus suşlarının moleküler tanımlanması
    1. Ortak fungal DNA ekstraksiyon protokollerini izleyerek her izolattan DNA ekstraksiyonu.
    2. Aspergillus β-tübülin genlerine (β-tub1 ve β-tub4) özgü primerleri kullanarak, PCR'yi çalıştırın ve Alcazar-Fuoli ve ark.17 tarafından açıklanan protokolleri izleyerek güçlendirilmiş ürünlerin dizisini elde edin.
      1. Elde edilen dizileri, BLAST kullanarak NCBI GenBank gibi halka açık veritabanlarında depolanan dizilerle karşılaştırın.
      2. Gerinim dizilerinin veritabanındaki A. fumigatus dizileriyle en iyi eşleşme olduğunu onaylayın.
    3. Adım 2.7.2'ye alternatif olarak, A. fumigatus çiftleşme tipleri MAT1-1 ve MAT1-229'u hedefleyen çok katlı bir PCR reaksiyonu çalıştırın.
      1. Multipleks PCR reaksiyonunda aşağıdaki üç astar dizisini kullanın: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Aşağıdaki termosikler parametrelerini kullanın: 95 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 30 sn'lik 35 döngü, 60 °C'de 30 s ve 72 °C'de son 5 dakikadan önce 72 °C'de 1 dakika.
      3. Ürünleri tanımlamak için jel elektroforezi çalıştırın; 834 bp MAT-1 veya 438 bp MAT1-2 arayın. Çiftleşme tipi amplifikasyonu pozitif ve negatif kontroller olarak onaylayan A. fumigatus suşlarını kullanın.
  8. Fragman analizi yoluyla A. fumigatus suşlarının mikrosatellit genotiplemesi
    NOT: Aşağıda listelenen adımlar, dokuz mikrosatellit (STR) lokusunda genotipleme A. fumigatus'u geniş bir şekilde kapsasa da, yalnızca birkaç önemli husus vurgulanmıştır. A. fumigatus STR genotiplemesi hakkında ayrıntılı bilgi için De Valk et al.24,30'a bakınız.
    1. Daha önce De Valk ve ark.24 tarafından tanımlanan STRAf primerlerini kullanarak üç PCR multipleks ana karışımı hazırlayın.
      1. Kılcal elektroforez yoluyla parça boyutunu belirlemek için ileri primerleri floresan olarak etiketleyin. İleri astarların konsantrasyonunun, ana karışım içindeki ters astarların (1 μM) yarısı (0,5 μM) olduğundan emin olun.
        NOT: En iyi sonuçlar için, kılcal elektroforez sırasında kullanılan seçilen boya standardınınkilerle eşleşen absorbans dalga boylarına sahip floresan etiketler kullanın.
      2. En iyi sonuçlar için sıcak başlatma polimeraz kullanın.
      3. Reaksiyon başına 0.1 ng'lik bir DNA konsantrasyonu kullanın.
    2. Aşağıdaki PCR programını kullanarak her bir suş için multipleks PCR'yi çalıştırın: 10 dakika boyunca 95 °C, 30 s için 95 °C'lik 40 döngü, 30 s için 60 °C ve 60 s için 72 °C, ardından 10 dakika boyunca 72 °C ve 4 °C'de bekletin.
    3. Jel elektroforezi ile güçlendirilmiş ürünleri kontrol edin.
    4. Ürünleri parça analizi uzmanları tarafından önerildiği şekilde istenen seviyeye (tipik olarak ~ 50x) seyreltin ve kılcal elektroforez çalıştırın. Her bir gerinim için üç çalıştırma gerçekleştirin, her çalışma üç farklı floresan probu ile üç çoklanmış reaksiyonu kapsar.
    5. Dokuz STR lokusunun her biri için doğru parça boyutunu belirlemek üzere, parça analizi yapabilen bir yazılım kullanın.
      1. Kılcal elektroforezden elde edilen ham verileri alın. Parça analiz yazılımını (örneğin, Osiris) kullanarak parça boyutlarını en büyük zirveye göre puanlayın.
      2. Dokuz lokusun her biri için sayıları yinelemek üzere parça boyutlarını dönüştürün. Daha önce De Valk et al.24 tarafından açıklandığı gibi Af293 referans geriniminin tekrar sayılarının parça boyutlarını kullanın.
        NOT: Farklı kılcal elektroforez platformları arasında parça boyutlarında küçük değişiklikler meydana gelebilir. Bu nedenle, genotipleme suşları için dokuz lokusun her biri için bilinen parça boyutuna sahip ortak bir referans suşu (ve bir iç merdiven) dahil etmek önemlidir.

Sonuçlar

Topraktan maya izolasyonu
Yukarıdaki maya izolasyon protokolü, dokuz ülkede 53 lokasyondan kaynaklanan toprak örneklerinden elde edilen kültür mayalarına uygulanmıştır 9,12. Toplamda, 3.826 toprak örneğinden 1.473 maya suşu izole edildi. Dokuz menşe ülkenin farklı iklim koşulları göz önüne alındığında, her ülke için en iyi inkübasyon sıcaklığı, yıllık ortalama sıcaklığına göre belirlenmiştir (Tab...

Tartışmalar

Mayaların ve A. fumigatus'un topraktan izole edilmesi için geliştirilen protokol, yüksek verimli toprak işleme ve mantar izolasyonu için hızlı ve verimli bir yöntemdir. Protokol, numune başına sadece az miktarda toprak (0.1-0.2 g) gerektirir ve bu da benzer çabayla daha fazla alanın örneklenmesini sağlar. Hızlı geri dönüş süresi, sonuçların kısa bir zaman dilimi içinde elde edilebilmesini sağlar ve gerekirse sorun giderme ve denemelerin tekrarlanması için zaman tanır. Bu protokol, st...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden gelen hibelerle desteklenmiştir (Hibe No. ALLRP 570780-2021) ve McMaster Üniversitesi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeSarstedt Inc72.690.001
Benomyl powder Toronto Research ChemicalsB161380
Chloramphenicol powder Sigma-AldrichSKU: C0378-5G
DextroseSigma-AldrichSKU: D9434-500G
Fragment Analysis SoftwareNCBI's Osirishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence databaseNCBI GenBank https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence databaseUNITE https://unite.ut.ee/
PeptoneSigma-AldrichSKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders Fisher Scientific08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes Sarstedt Inc83.3902
Sterile 13 mL culture tubes Sarstedt Inc62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks Fisher Scientific23-400-112
Yeast extractSigma-AldrichSKU: Y1625-250G

Referanslar

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 183Maya e itlili iAspergillus fumigatussaf k lt rmorfotiplemeDNA barkodlamasmikrosatellit genotiplemesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır