تقنية جراحية معدلة لزراعة الكلى في الفئران

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنية جراحية جديدة لزراعة كلى الفئران مع التركيز على استراتيجية مفاغرة شريانية معدلة. كما يتم تقديم تقنية خياطة الأوعية الدموية بما في ذلك طريقة بسيطة وأكثر أمانا لمفاغرة الحالب والمثانة. هذه التعديلات تقصر وقت العملية وتحسن معدل نجاح عملية زرع الكلى بالفئران.

Abstract

زرع الكلى في الفئران هو إجراء جراحي معقد وصعب. وهناك عدد قليل جدا من المنشورات التي تبين الخطوات الرئيسية لهذه العملية. لذلك ، تقدم هذه المقالة التقنية وتشير إلى المحاذير الجراحية المرتبطة بهذه العملية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح تعديلات مهمة مقارنة بالإجراء التقليدي. أولا ، يتم قطع رقعة من الشريان الأورطي البطني وإعدادها بحيث يتم نقل التشعبات القريبة من الشريان الكلوي ، بما في ذلك الشريان الحالبي مع الكلى المانحة في كتلة. هذا يقلل من خطر نخر الحالب ويتجنب تطور انسداد المسالك البولية. ثانيا ، تم إثبات طريقة جديدة لمفاغرة الأوعية الدموية تسمح للمشغل بزيادة أو تقليل حجم المفاغرة بمرونة بعد بدء تروية زرع الكلى بالفعل. هذا يتجنب تطور تضيقات الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. ثالثا ، يتم عرض تقنية تمكن من مفاغرة الحالب المانح الحساس والمثانة المتلقية التي لا تسبب صدمة. يمكن أن يؤدي اعتماد هذا البروتوكول إلى تقصير وقت التشغيل وتقليل الضرر الذي يلحق بمثانة المتلقي ، وبالتالي زيادة كبيرة في معدل نجاح العملية للفئران المتلقية.

Introduction

منذ أن طور Sakowitz et al. نماذج الفئران لزرع الكلى في عام 1973 لأول مرة¹ ، فقد ثبت أنه أداة تجريبية مهمة لدراسة آليات الإصابة الإقفارية المزروعة والرفض المناعي وكذلك لتطوير علاجات جديدة تهدف إلى إطالة أمد البقاء على قيد الحياة وربما لتحقيق التسامح المناعي. ومع ذلك ، فقد أثبتت التقنية الجراحية أنها معقدة ومتطلبة للغاية ، وأحيانا لها مضاعفات مثل تضيقات مفاغرة الأوعية الدموية التي تؤدي إلى فشل زرع الكلى غير المناعي قبل الكلوي² ، والفشل الكلوي الناجم عن نقص التروية والنخر اللاحق للحالب المزروع ، وتضيقات مفاغرة الحالب المزروع و / أو المثانة البول لدى المتلقي مما يؤدي إلى اضطراب في تدفق البول. كل هذه هي الأسباب التي تجعل زراعة الكلى في الفئران لم يتم تطويرها بشكل أكبر وبالتالي لا تستخدم على نطاق واسع. لا يزال إنشاء نموذج فعال ومستقر طويل الأجل لزراعة كلى الفئران دون مضاعفات الأوعية الدموية والمسالك البولية له أهمية لا يمكن الاستغناء عنها للعديد من الدراسات في مجال زراعة الأعضاء مع التركيز على المناعة الكلوية بوساطة ولكن أيضا الأمراض المعدية³. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع عمليات زرع الأعضاء الأخرى في نماذج الفئران مثل زراعة الرئة والقلب والأمعاء^4,5 ، يوفر نموذج زراعة الكلى للفأر فرصة لدراسة البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل حتى في وضع التباين الرئيسي في مستضد التوافق النسيجي ^3,6. وقد تبين أيضا أنه في نفس بيئة مجموعات الإجهاد بين المتبرع والمتلقي ، تتميز عمليات زرع الأعضاء المختلفة مثل القلب أو الكلى بديناميكيات وبداية مختلفة لرفض allograft³. علاوة على ذلك ، من وجهة نظر أمراض الكلى ، فهو نموذج أكثر ملاءمة لدراسة الآليات التنظيمية المناعية بوساطة المتني في سياق أحداث الرفض الحاد والمزمن من تجارب زراعة الجلد البسيطة.

على أساس التقارير السابقة حول التقنية الجراحية لزرع الكلى في الفئران³،⁷،⁸،⁹ ، نوضح هنا التحسينات الموثوقة التالية التي تم تطبيقها بنجاح خلال السنوات العشر الماضية ضمن مجموعتنا 10^،11،¹²: أولا ^، يتم الحفاظ على الشريان الحالبي بأمان حيث يتم استئصال الشريان الكلوي في كتلة واحدة. جنبا إلى جنب مع الجزء المعني من الشريان الأورطي البطني. ثانيا ، تقنية جديدة وبسيطة وسريعة لمفاغرة الأوعية الدموية بدون عقدة حيث لا يتم ربط الغرزة النهائية من المفاغرة بنهاية التعادل العلوي مثل النهج التقليدي ولكنها تظل حرة. تمكن هذه التقنية من زيادة أو تقليل حجم المفاغرة بعد التروية الكلوية لتجنب تضيق الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. ثالثا ، تم استخدام إبر حقنة 21 جم و 30 جم كأداة توجيه ثقب مساعدة من أجل زرع الحالب المانح في جدار المثانة المتلقي مما يقلل من الضرر الذي يلحق بالمثانة المتلقي ويسهل تكوين مفاغرة خالية من التضيق.

في هذا التقرير ، قارنا أيضا التقنية التقليدية المستخدمة على نطاق واسع مع التقنية المعدلة التي تم إنشاؤها في مختبرنا ولم نجد فرقا كبيرا في درجة ضمور الكلى الأنبوبي وتليف الأنسجة الخلالية لزرع الكلى. في الدراسات السابقة ، قارنا أيضا نتائج هذه التقنية الجديدة بالطريقة التقليدية من حيث النزيف الموضعي والجلطة ووقت إجراء مفاغرة الأوعية ومعدل البقاء على قيد الحياة. وجدنا تحسينات مثل التخفيضات الكبيرة في أحداث الجلطة المحلية (1.1٪ مقابل 6.6٪) ، وتقليل الوقت لإجراء المفاغرة ، والكسب غير المشروع الجيني للكلى القابل للتكرار على المدى الطويل (95٪ مقابل 84٪ مع النهج الكلاسيكي)¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن التوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية (بطاقة أخلاقيات الحيوان: وزارة سلامة الأغذية والأدوية في ولاية سكسونيا السفلى ، # 33.9-42502-04-11/0492). قم بإجراء الإجراءات باستخدام الأدوات الجراحية المعقمة والمواد الاستهلاكية (الأوتوكلاف) وحاول الحفاظ على منطقة العمليات معقمة قدر الإمكان.

ملاحظة: عملت الفئران الذكور C57BL/6J كمتبرعين ومتلقين (نموذج زرع syngeneic) في حين عملت الفئران Balb / c كمتلقين للألوغرافت الكلوي (نموذج لدراسة نموذج رفض allograft الحاد⁹). كان عمر الفئران بين 8-12 أسبوعا ، وكان وزنها ~ 25-30 جم عند الزرع وتم إيواؤها في ظل ظروف قياسية. تم إنشاء البيانات الواردة في هذه المخطوطة من قبل أربعة جراحين ذوي خبرة في جراحة الفئران.

1. الخطوات التحضيرية

1. بالنسبة للجراحة ، استخدم مجموعة من الأدوات المجهرية ، بما في ذلك مقص مجهري ، ملقط دقيق ، حامل إبرة ، مشابك مرقئ مرقئ دقيقة ، وقلم كهربائي. قم بإجراء الغرز باستخدام خيوط النايلون أحادية النايلون 7/0er أو 10/0er أو 4/0er.
2. للتخدير ، ضع الفأر في الصندوق لاستنشاق الأيزوفلوران (2٪) لمدة 40-60 ثانية من أجل الحث على فقدان الوعي.
3. بمجرد تخدير الماوس ، قم بوزن الماوس.
4. وفقا لوزن الفأر ، ضع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 مجم / كجم) + زيلازين (10 مجم / كجم) + أسيبرومازين (2 مجم / كجم) لتخدير الفأر¹³. تأكد من تخدير الماوس من خلال ملاحظة عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
5. عندما يصبح التخدير ساري المفعول ، قم بقص فرو البطن. ثم ، قم بإصلاح الماوس على طاولة التشغيل عن طريق شل حركة الأطراف بشكل فضفاض باستخدام شريط لاصق معقم.
6. تطهير بطن الماوس بعد وضع الماوس على طاولة العمليات. قم بإجراء التطهير باستخدام فرك بالتناوب من يوديد البوفيدون (اليودوفور) والكحول ، ثلاث مرات (استخدم نمطا متحد المركز ، وابدأ الفرك في منتصف البطن وانتقل إلى الخارج) ، ثم قم بلف الماوس بشكل صحيح باستخدام منشفة جراحية متجذرة.
7. ضع مرهم العين وحافظ على العقم طوال العملية.
   ملاحظة: لا ينصح بالمضادات الحيوية طوال الإجراء لأن هذه المواد قد تؤثر على الاستجابات المناعية.

2. إجراءات تشغيل المتبرع

1. استخدم المقص لقطع الجلد وإجراء شق عبر البطن يبلغ حوالي 3-4 سم. قطع عضلات جدار البطن. قم بتغطية الأحشاء ونقلها بحذر باستخدام شاش ملحي مشرب.
2. استخدم قطعة قطن لإزالة الأمعاء والمعدة والطحال بلطف نحو الجانب الأيمن (من وجهة نظر الماوس) ، وقم بتغطيتها وتحريكها بحذر بعيدا بشاش ملحي مشرب.
3. استخدم الملقط الدقيق لفضح الكلى اليسرى والشريان الأورطي والوريد الأجوف السفلي (IVC).
4. استخدم قلم رصاص كهربائي جراحي كي الأوردة القطنية اليسرى ، بما في ذلك فروعها الأساسية والأوعية الصغيرة الأخرى جنبا إلى جنب مع وعاء الغدة الكظرية الأيسر ، بعناية.
5. استخدم المقص الدقيق والملقط لتشريح الحالب الأيسر وتعبئته بحذر من الأنسجة المحيطة. نظيفة قطعها بالقرب من المثانة البولية. تعبئة المنطقة الأبهرية بين الشرايين الكلوية اليسرى واليمنى حوالي 2 مم في الطول.
6. استخدم ملقط صغير لفصل الوريد الأجوف السفلي (IVC) والشريان الأورطي ، ثم استخدم ملقطا منحنيا للمرور تحت الشريان الأورطي لوضع ربطة عنق فضفاضة من خياطة الحرير 7-0 حول هذا الوعاء.
7. قم بتثبيت منطقة الشريان الأورطي أسفل الشريان الكلوي الأيمن والوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام اثنين من المشابك الوعائية الدقيقة مقاس 5 مم.
8. انقل الوريد الكلوي الأيسر من الوريد الأجوف.
9. استخدم حقنة لطرد الشريان الأورطي ب 1 مل من محلول الهيبارين الملحي (60 U / mL).
10. استخدم ملقط صغير لشد الرباط المطبق في الخطوة 2.5. ثم ، قطع الشريان الأورطي أسفل الرباط وكذلك تحت المشبك القريب. مع هذا ، يتم تضمين التشعبات القريبة من الشريان الكلوي (يرجى ملاحظة أنه يجب قطع فتحة الشرايين بدقة ، وإلا فإنها ستؤثر على المفاغرة) والشريان الحالبي ونقلها في كتلة. تحضير بعناية ، بحيث يتم الحفاظ على الشريان الحالبي الحساس تماما.
11. استخدم قلم الرصاص الكهربائي الجراحي والملقط لتحرير الكلى اليسرى والأوعية المرتبطة بها تماما عن طريق كي جميع الأوعية المحيطة بحذر الأنسجة. إزالة الكلى وتخزينها في محلول ملحي في 4 درجات مئوية.
12. القتل الرحيم للفأر المانح المخدر عن طريق قطع الرأس.

3. إجراء عملية المستلم

1. قم بإجراء الخطوات الجراحية الأولية (بما في ذلك التخدير والتعقيم، انظر الخطوات من 1.1 إلى 1.7) كما هو موضح للفأر المتبرع.
2. استخدم المقص لفتح البطن عن طريق شق متوسط (طوله حوالي 2.5 سم) ، ثم قم بتغطية أعضاء البطن بشاش مبلل باستخدام محلول ملحي.
3. حافظ بعناية على الشريان الأورطي اللعابي والوريد الأجوف السفلي (IVC) وتأكد من كي كل فرع من فروع الأوعية الكبيرة. استخدم الكي الكهربائي أيضا لتشريح الحالب الأيسر بعناية في وضع قريب من حوض الكلى. ثم، قم بإزالة الكلى اليسرى.
4. استخدم الملقط الصغير وبراعم القطن لفضح الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي وفصلهما عن الأنسجة الدهنية المحيطة (طولها أكثر من 4 مم تقريبا).
5. استخدم اثنين من المشابك الوعائية الدقيقة وضعها بالقرب منها وبعيدا على كل من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي البطني في وقت واحد.
6. استخدم حامل إبرة صغير لتوجيه إبرة خياطة أحادية الخيط 10/0 (مصنوعة من الألياف الاصطناعية ذات السطح الأملس) ، والتي يتم وضعها عبر جدار الشريان الأورطي بطريقة قريبة إلى بعيدة.
7. حقق بضع الشرايين البيضاوي بحوالي 1 مم مع جر تصاعدي لطيف للخياطة ، مع القطع مباشرة أسفل الوجه السفلي للإبرة بمقص منحني ناعم.
8. استخدم المقص الدقيق لقطع الوريد الأجوف السفلي (IVC) طوليا بطول كاف يبلغ حوالي 1.5 مم. ضع هذا الشق أقل قليلا من نظيره الأبهري.
9. إجراء مفاغرة الشريان الأورطي من المتبرع والمتلقي بطريقة شاملة. ضع كلية المتبرع على الجانب الأيمن من الوريد الأجوف السفلي للمتلقي مع محاذاة كفة الشريان الأورطي البطني للمتبرع مع مفاغرة الشريان الأورطي البطني للمتلقي.
10. استخدم حامل إبرة صغير وخيطين منفصلين 10-0 لخياطة الأطراف القريبة والبعيدة من المفاغرة.
11. بعد الربط ، اترك الغرز الطويلة ، بما في ذلك الإبرة ، في مكانها. خياطة الجانب الأيسر من الجدار الأبهري للمفاغرة باستمرار مع اثنين من الغرز متباعدة بالتساوي في اتجاه بعيد قريب.
12. بعد الغرزة الأخيرة ، قم بتوجيه الخيط من خلال سمك جزئي لجدار الوعاء فوق ربطة عنق خياطة البقاء العلوية.
13. استخدم ملقط صغير لممارسة الجر اللطيف في وقت واحد إلى الطرف القصير من ربطة الخياطة السفلية.
    ملاحظة: في هذه التقنية الجديدة الخالية من العقدة، لا ترتبط الغرزة الأخيرة بالطرف القصير من ربطة العنق العلوية.
14. استخدم الملقط الصغير لتحويل الكلى المزروعة إلى وضعها الطبيعي. الآن خياطة باستمرار الجدار الأيمن من مفاغرة الأبهر باستخدام ثلاث غرز بطريقة قريبة إلى بعيدة.
    ملاحظة: بالمقارنة مع التقنية الجراحية التقليدية ^7,8 يتم دمج الخيط الأخير مع ربطة العنق البعيدة القريبة. لا تربطه بنهاية الخيط السفلي ، قم بقصه ليترك طولا حرا يتراوح بين 2-3 مم بدلا من ذلك.
15. قم بإجراء المفاغرة الوريدية باستخدام نفس إجراء الخياطة كما هو موضح سابقا مع اختلاف الحاجة إلى أربع إلى خمس غرز لكل جانب من جوانب المفاغرة. يتم ترك الغرزة النهائية كنهاية حرة بطول مماثل لمفاغرة الأبهر الموصوفة أعلاه.
16. بعد الانتهاء من كل من المفاغرة ، استخدم مسحة جافة لممارسة ضغط لطيف نحو المنطقة المخيطة لمدة تتراوح بين 10 و 20 ثانية.
17. استخدم ملقط قضيب مشبك لإزالة كلا المشابك، أولا في الجزء السفلي ثم العلوي. شطف تجويف البطن مع 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم عند درجة حرارة 38.0 درجة مئوية.
18. مراقبة تروية الكلى المزروعة.

4. زرع الحالب

1. استخدم حامل إبرة صغير لاختراق مثانة بول المتلقي بخياطة 10/0 (إبرة مستقيمة) وأدخلها في تجويف إبرة 21 جم للحصول على إرشادات (انظر الشكل التكميلي 1 أ).
2. الآن قم بتوجيه إبرة 21 G لخياطة ثقب في مكان تطبيق الإبرة السابق (الشكل التكميلي 1b).
3. اسحب إبرة 21 جم (الشكل التكميلي 1 ج).
4. استخدم حامل إبرة صغير وخياطة 10/0 لخياطة (بدون ربطة) نهاية الحالب المشذبة وثقب المثانة باستخدام هذه الخياطة 10/0 مرة أخرى في مكان إدخالها (الشكل التكميلي 1 د).
5. استخدم حامل إبرة صغير لسحب خيوط 10/0 والحالب إلى المثانة البولية من خلال الثقب المبني (الشكل التكميلي 1e).
6. استخدم حامل إبرة صغيرة وخياطة أخرى بنسبة 10/0 لمفاغرة الحالب المتبرع إلى مثانة بول المتلقي. هنا ، قم بتوصيل الغشاء الخارجي للحالب بالغشاء الخارجي لجدار المثانة ، وقم بإجراء خيوط متقطعة باستخدام 3 إلى 4 غرز. أخيرا ، اسحب خياطة الجر (الشكل التكميلي 1f).
7. استخدم الملقط لوضع الأمعاء مرة أخرى في تجويف البطن. قم بإجراء خيوط من طبقتين (أولا عضلات البطن تليها الجلد) لإغلاق جرح البطن باستخدام خيوط 4/0.
8. ضع الفئران المزروعة في غرفة الأكسجين والتحكم في درجة الحرارة للتعافي بعد الجراحة.
9. بالنسبة للتسكين بعد العملية الجراحية ، أعط ميتاميزول مباشرة 200 ملغم / كغم لكل نظام تشغيل بعد العملية.
   أربعة و 16 ساعة بعد العملية تعطي ميتاميزول 200 ملغم / كغم لكل نظام تشغيل بالإضافة إلى كاربروفين (5 ملغ / كغ) s.c. في المتابعة الإضافية ، ضع Carprofen (5 mg / kg) s.c. على الفئران المزروعة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام متتالية بعد العملية¹³. إذا كانت هناك أي علامات على عدم كفاية تسكين البوبرينورفين 0.05 مغ / كغ يعطى بالإضافة إلى ذلك كل 8 ساعات s.c.

5. استئصال الكلية المقابل والتضحية بالفأر المتلقي

ملاحظة: إجراء استئصال الكلية المضاد للفأر المتلقي بعد 5 أيام من الزرع.

1. قم بإجراء استئصال الكلية المضاد للفأر المزروع بعد 5 أيام من الزرع تحت التخدير. قم بقطع الشرايين والأوردة الكلوية اليمنى الذاتية للمتلقي ، وإزالة الكلى اليمنى وإغلاق تجويف البطن. الرعاية بعد العملية الجراحية والتسكين هي نفسها كما هو موضح من قبل (انظر الخطوة 4.7).
2. رفع وتسجيل حالة الماوس. توفير مسكن الفأر المزروع بعد العملية الجراحية والغذاء وإمدادات المياه.
3. بعد أربعة أسابيع من الزرع ، ضحى بنصف الفئران المزروعة وقم بإجراء تلطيخ H & E لعمليات زرع الكلى.
4. بعد 12 أسبوعا من الزرع ، قم بالتضحية بالفئران المتبقية وإجراء تلطيخ Masson Gold لعمليات زرع الكلى هذه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد أربعة أسابيع من الزرع ، أظهرت كل من التقنية المعدلة وكذلك التقنية التقليدية علامات معتدلة على ضمور أنبوبي كلوي^14,15 عند مقارنتها بالكلى المعاكسة الأصلية (الشكل 1). لم تظهر درجة ضمور الأنابيب الكلوية أي فرق كبير بين التقنيتين المختلفتين. أظ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في حين أن نموذج زراعة الجلد في الفئران بسيط وسهل الأداء لدراسة أحداث الرفض المناعي ، فقد ثبت أن التقنيات الجراحية للتحقيق بشكل أكثر تحديدا في التغيرات الالتهابية المرتبطة بالمناعة بعد القلب¹⁶ وزرع الكلى¹⁰ معقدة ومتطلبة للغاية. من وجهة نظر أخصائي أمراض الكلى المزر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-