טכניקה כירורגית מותאמת להשתלת כליה בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מציג טכניקה כירורגית חדשה של השתלת כליה של עכברים המתמקדת באסטרטגיית אנסטומוזיס עורקית שונה. כמו כן מוצגת טכניקת תפר כלי דם הכוללת שיטת אנסטומוזה פשוטה ובטוחה יותר של השופכן-שלפוחית השתן. שינויים אלה מקצרים את זמן הניתוח ומשפרים את שיעור ההצלחה של הליך השתלת הכליה של העכבר.

Abstract

השתלת כליה בעכברים היא הליך ניתוח מסובך ומאתגר. יש מעט מאוד פרסומים המדגימים את השלבים המרכזיים של פעולה זו. לכן, מאמר זה מציג את הטכניקה ומצביע על האזהרות הכירורגיות הקשורות לניתוח זה. בנוסף, מודגמים שינויים חשובים בהשוואה להליך הקונבנציונלי. ראשית, טלאי של אבי העורקים הבטני נחתך ומוכן כך שהביפורקטיונים הפרוקסימליים של עורק הכליה, כולל עורק השופכה עוברים יחד עם הכליה התורמת en bloc. זה מקטין את הסיכון לנמק השופכן ומונע התפתחות של חסימת דרכי השתן. שנית, שיטה חדשה של anastomosis כלי הדם הוא הוכיח המאפשר המפעיל להגדיל באופן גמיש או להקטין את גודל של anastomosis לאחר השתלת הכליה reperfusion כבר יזם. זה מונע את הפיתוח של היצרות כלי הדם ודימום intraabdominal. שלישית, מוצגת טכניקה המאפשרת את הרסטומוזה של השופכן התורם העדין ושל שלפוחית השתן המקבלת שאינה גורמת לטראומה. אימוץ פרוטוקול זה יכול לקצר את זמן הפעולה ולצמצם את הנזק לשלפוחית השתן של הנמען, ובכך להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של הניתוח עבור העכברים המקבלים.

Introduction

מאז שסקוביץ ואחרים פיתחו מודלים של השתלת כליה בעכברים בשנת 1973 בפעם הראשונה¹, הוא הוכיח את עצמו ככלי ניסיוני חשוב לחקר המנגנונים של פגיעה איסכמית בהשתלה ודחייה אלואימונית, כמו גם לפיתוח טיפולים חדשים שמטרתם להאריך את הישרדות האלוגרפט ואולי להשיג סבילות אימונולוגית. עם זאת, הטכניקה הכירורגית הוכחה כמורכבת ותובענית מאוד, לעיתים עם סיבוכים כגון היצרויות אנסטומוטיות של כלי הדם המובילות לאי ספיקת כליה טרום-רנלית שאינה אימונולוגית², כשל פוסט-פרנאלי הנגרם על ידי איסכמיה ונמק לאחר מכן של השופכן המושתל, היצרויות של האנסטומוזה של השופכן המושתל ו /או שלפוחית השתן של המושתל המובילות להפרעה בזרימת השתן. כל אלה הן סיבות מדוע השתלת כליה בעכברים לא פותחה עוד יותר ולכן אינה בשימוש נרחב. לביסוס מודל השתלת כליה יעיל ויציב לטווח ארוך של עכברים ללא סיבוכים וסקולריים ודרכי שתן עדיין יש משמעות שאין לה תחליף עבור מחקרים רבים בתחום ההשתלות תוך התמקדות במחלות כלייתיות בתיווך חיסוני אך גם זיהומיות³. בנוסף, בהשוואה להשתלות איברים אחרות במודלים של מורין כגון השתלת ריאות, לב ומעיים ^4,5, מודל השתלת הכליה של העכבר מציע סיכוי לחקר הישרדות ארוכת טווח גם במסגרת פער אנטיגן היסטו-קומפטבילי גדול ^3,6. כמו כן הוכח כי באותה סביבה של שילובי זן תורם-מושתל השתלות איברים שונות כגון לב או כליה מאופיינות בדינמיקה שונה ובהתחלות של דחיית allograft³. יתר על כן, מנקודת מבט נפרולוגית, זהו מודל מתאים יותר לחקר מנגנוני ויסות חיסוני בתיווך פרנכימלי בהקשר של אירועי דחייה חריפים וכרוניים מאשר ניסויים פשוטים בהשתלת עור.

על בסיס דיווחים קודמים על הטכניקה הניתוחית של השתלת כליה בעכברים ^3,7,8,9, אנו מדגימים כאן את השיפורים המהימנים הבאים שיושמו בהצלחה במהלך 10 השנים האחרונות בתוך הקבוצה שלנו ^10,11,12: ראשית, עורק השופכה נשמר בבטחה כאשר עורק הכליה נחתך באופן גושני יחד עם החלק המתאים של אבי העורקים הבטני. שנית, טכניקה חדשה, פשוטה ומהירה של אנסטומוזה וסקולרית ללא קשרים, שבה התפר הסופי של האנסטומוזיס אינו קשור לקצה העניבה העליונה כמו הגישה המסורתית אלא נשאר חופשי. טכניקה זו מאפשרת להגדיל או להקטין את גודל האנסטומוזיס לאחר ריפרפוזיה כלייתית כדי למנוע היצרות כלי דם ודימום תוך-אבדומינלי. שלישית, מחטי מזרק 21 G ו-30 G שימשו ככלי עזר מנחה לניקוב על מנת להשתיל את השופכן התורם בדופן שלפוחית השתן של המקבל, ובכך להפחית את הנזק לשלפוחית השתן של המקבל ולהקל על היווצרות של אנסטומוזיס ללא היצרות.

בדו"ח זה, השווינו גם את הטכניקה המסורתית, הנמצאת בשימוש נרחב, עם הטכניקה המתוקנת שהוקמה במעבדה שלנו ולא מצאנו הבדל משמעותי במידת ניוון צינוריות הכליה ופיברוזיס של השתלת כליה. במחקרים קודמים, השווינו בנוסף את התוצאות של טכניקה חדשה זו עם השיטה המקובלת במונחים של דימום מקומי, פקקת, זמן לביצוע אנסטומוזיס כלי הדם ושיעור ההישרדות. מצאנו שיפורים כגון הפחתה משמעותית של אירועי פקקת מקומיים (1.1% לעומת 6.6%), זמן מופחת להליך הרסטומוזה, והישרדות ארוכת טווח של השתלת כליות סינגנית הניתנת לשחזור (95% לעומת 84% בגישה הקלאסית)¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיות ההנחיה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות (כרטיס אתיקה לבעלי חיים: המשרד לבטיחות מזון ותרופות בסקסוניה התחתונה, #33.9-42502-04-11/0492). בצע הליכים באמצעות כלי ניתוח סטריליים וחומרים מתכלים (autoclaved) ונסה לשמור על אזור הניתוח סטרילי ככל האפשר.

הערה: עכברים זכרים C57BL/6J שימשו כתורמים ומושתלים (מודל השתלה סינגנית) בעוד שעכברי Balb/c שימשו כמושתלי אלוגרפט בכליות (מודל לחקר מודל דחייה אקוטי של אלוגרפט^{מודל 9}). העכברים היו בני 8-12 שבועות, שקלו כ-25-30 גרם בעת ההשתלה ושוכנו בתנאים סטנדרטיים. הנתונים המדווחים בכתב יד זה נוצרו על ידי ארבעה מנתחים המנוסים בניתוח עכברים.

1. שלבי הכנה

1. לצורך ניתוח, השתמש במערך של מכשירים מיקרוסקופיים, כולל מיקרו-מספריים, מיקרו-מלקחיים, מחזיק מחט, מלחציים מיקרו-המוסטטיים ועט אלקטרוכירורגי. בצעו תפרים באמצעות מונופילמנט ניילון 7/0er, 10/0er או 4/0er.
2. להרדמה, הכניסו את העכבר לתוך הקופסה לצורך שאיפת איזופלורן (2%) במשך כ-40-60 שניות על מנת לגרום לחוסר הכרה.
3. לאחר שהעכבר מורדם, שקלו את העכבר.
4. על פי משקל העכבר, יש למרוח הזרקה תוך-צפקית של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) + קסילאזין (10 מ"ג/ק"ג) + אצפרומאזין (2 מ"ג/ק"ג) כדי להרדים את העכבר¹³. אשר כי העכבר מורדם על ידי התבוננות בחוסר תגובה לצביטת בוהן.
5. כאשר ההרדמה נכנסה לתוקף, קוצצים את פרוות הבטן. לאחר מכן, לתקן את העכבר על שולחן הניתוח על ידי שיתוק רופף של הגפיים עם סרט מיסוך סטרילי.
6. יש לחטא את בטנו של העכבר לאחר הנחת העכבר על שולחן הניתוחים. בצע חיטוי באמצעות קרצוף לסירוגין של יודיד פובידון (יודופור) ואלכוהול, שלוש פעמים (השתמש בתבנית קונצנטרית, התחל לשפשף באמצע הבטן וזז החוצה), ולאחר מכן עטף כראוי את העכבר באמצעות מגבת כירורגית מגוננת.
7. החל משחת עיניים ולשמור על סטריליות לאורך כל ההליך.
   הערה: אנטיביוטיקה אינה מומלצת לאורך כל ההליך מכיוון שחומרים אלה עשויים להשפיע על תגובות אימונולוגיות.

2. הליך הפעולה של התורם

1. השתמש במספריים כדי לחתוך את העור ולבצע חתך בטן צולבת של כ 3-4 ס"מ. לחתוך את השרירים של דופן הבטן. מכסים ומזיזים בזהירות את הקרביים עם גזה טבולה מלוחה.
2. השתמשו במטוש צמר גפן כדי להסיר בעדינות את המעיים, הקיבה והטחול לכיוון צד ימין (מנקודת המבט של העכבר), מכסים ומזיזים בזהירות את הקרביים עם גזה מלוחה.
3. השתמש במלקחיים זעירים כדי לחשוף את הכליה השמאלית, אבי העורקים והווריד הנבוב התחתון (IVC).
4. השתמש בעיפרון אלקטרוכירורגי כדי לצרוב את הוורידים המותניים השמאליים, כולל הענפים שמתחתיהם וכלי דם קטנים אחרים יחד עם כלי יותרת הכליה השמאלי, בזהירות.
5. השתמש במיקרו מספריים ומלקחיים כדי לנתח את השופכן השמאלי ולגייס אותו בזהירות מהרקמה הסובבת אותו. נקי לחתוך אותו קרוב לשלפוחית השתן. גייסו את אזור אבי העורקים בין עורקי הכליה השמאליים והימניים באורך של כ-2 מ"מ.
6. השתמש במלקחיים זעירים כדי להפריד בין הווריד התחתון האינפרא-רנלי קאווה (IVC) ואבי העורקים, ולאחר מכן השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לעבור מתחת לאבי העורקים כדי להניח עניבה רופפת של תפר משי 7-0 סביב כלי זה.
7. לחצות את האזור של אבי העורקים מתחת לעורק הכליה הימני ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC) באמצעות שני מלחציים מיקרו-וסקולריים בקוטר 5 מ"מ.
8. העבר את הווריד הכליתי השמאלי מהווריד קאווה.
9. השתמש במזרק כדי לשטוף את אבי העורקים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח הפרין (60 U / mL).
10. השתמש במלקחיים זעירים כדי להדק את הליגטורה המופעלת בשלב 2.5. לאחר מכן, חותכים את אבי העורקים מתחת לליגטורה, כמו גם מתחת למהדק הפרוקסימלי. עם זאת, bifurcations proximal של עורק הכליה (שים לב כי פתח העורק חייב להיות חתוך בצורה מסודרת, אחרת זה ישפיע על anastomosis) ואת עורק השופכה כלולים ו transected en bloc. הכן בזהירות, כך עורק השופכה העדין נשמר לחלוטין.
11. השתמש בעיפרון האלקטרוכירורגי ובמלקחיים כדי לשחרר את הכליה השמאלית ואת כלי הדם הקשורים אליו לחלוטין על ידי זהירות זהירה בכל הרקמות המקיפות את כלי הדם שמסביב. הסר את הכליה ואחסן אותה בתמיסה מלוחה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
12. המתת חסד את העכבר התורם המרדים על ידי עריפת ראשים.

3. הליך פעולת הנמען

1. בצע את השלבים הניתוחיים הראשוניים (כולל הרדמה ועיקור, ראה שלבים 1.1 עד 1.7) כמתואר עבור העכבר התורם.
2. השתמש במספריים כדי לפתוח את הבטן באמצעות חתך חציוני (באורך של כ -2.5 ס"מ), ולאחר מכן לכסות את איברי הבטן עם גזה רטובה באמצעות תמיסת מלח.
3. שמרו בזהירות על אבי העורקים האינפרא-רנלי ועל הווריד הנבוב התחתון קאווה (IVC) וודאו שכל ענף כלי גדול מצומק. השתמש גם בצריבה החשמלית כדי לנתח את השופכן השמאלי בזהירות בתנוחה קרובה לאגן הכליות. לאחר מכן, הסר את הכליה השמאלית.
4. השתמשו במלקחיים זעירים ובניצני כותנה כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני ואת הווריד הנבוב התחתון ולנתק אותם מרקמת השומן שמסביב (באורך של כ-4 מ"מ).
5. השתמשו בשני מלחציים מיקרו-וסקולריים והניחו אותם באופן פרוקסימלי ודיסטלי הן על הווריד הנבוב התחתון והן על אבי העורקים הבטני בו זמנית.
6. השתמש במחזיק מחט מיקרו כדי להנחות מחט מונופילמנט 10/0 (עשוי מסיבים סינתטיים עם משטח חלק) מחט תפר, אשר מונחת דרך דופן אבי העורקים באופן פרוקסימלי עד דיסטלי.
7. להשיג טרשת עורקים אליפטית של כ -1 מ"מ עם אחיזה עדינה כלפי מעלה של התפר, תוך חיתוך ישירות מתחת לפנים התחתונות של המחט עם מספריים עדינים ומעוקלים.
8. השתמש במיקרו מספריים כדי לחתוך את הווריד הנחות קאווה (IVC) לאורך עם אורך מספיק של כ -1.5 מ"מ. מקם חתך זה מעט מתחת למקבילו אבי העורקים.
9. בצעו את האנסטומוזיס של אבי העורקים התורם והמקבל באופן מקצה לקצה. מניחים את הכליה התורמת בצד ימין של הווריד הנבוב התחתון של המקבל ומיישרים את השרוול של אבי העורקים הבטני של התורם עם האנסטומוזוזיס של אבי העורקים הבטני של המקבל.
10. השתמש במחזיק מחט מיקרו ושני תפרים נפרדים של 10-0 כדי לתפור את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של האנסטומוזה.
11. לאחר הקשירה, השאירו את שני התפרים הארוכים, כולל המחט, במקומם. לתפור את הצד השמאלי של דופן אבי העורקים של האנסטומוזיס ברציפות עם שני תפרים במרווחים שווים בכיוון דיסטלי-פרוקסימלי.
12. לאחר התפר האחרון, הנחה את התפר דרך עובי חלקי של דופן הכלי מעל עניבת תפר השהייה העליונה.
13. השתמשו במיקרו מלקחיים כדי להפעיל בו-זמנית אחיזה עדינה לקצה הקצר של עניבת התפר התחתונה.
    הערה: בטכניקה חדשה זו ללא קשר, התפר האחרון אינו קשור לקצה הקצר של העניבה העליונה.
14. השתמש במלקחיים זעירים כדי להפוך את הכליה המושתלת למקומה הרגיל. כעת לתפור ברציפות את הקיר הימני של האנסטומוזה אבי העורקים באמצעות שלושה תפרים באופן פרוקסימלי עד דיסטלי.
    הערה: בהשוואה לטכניקה הכירורגית הקונבנציונלית ^7,8 התפר האחרון מתמזג עם העניבה הדיסטלית הסמוכה. אין לקשור אותו לקצה התפר התחתון, לחתוך אותו כדי להשאיר אורך חופשי של 2-3 מ"מ במקום.
15. בצע את האנסטומוזה הוורידית באמצעות אותו הליך תפירה כפי שתואר קודם לכן עם ההבדל כי ארבעה עד חמישה תפרים נדרשים עבור כל צד של anastomosis. התפר הסופי נותר כקצה חופשי באורך דומה בדומה לאנסטומוזיס אבי העורקים שתואר לעיל.
16. לאחר השלמת שני האנסטומוזות, השתמשו במטוש יבש כדי להפעיל לחץ עדין לכיוון אזור התפירה במשך כ-10-20 שניות.
17. השתמש במלקחיים אפליקטור קליפס כדי להסיר את שני המהדקים, תחילה התחתון ואז העליון. לשטוף את חלל הבטן עם 0.9% נתרן כלורי בטמפרטורה של 38 °C (76 °F).
18. שימו לב לרפרפוזיה של הכליה המושתלת.

4. השתלת שופכן

1. השתמשו במחזיק מחט זעיר כדי לחדור דרך שלפוחית השתן של הנמען באמצעות תפר 10/0 (מחט ישרה) והכנסו אותו ללומן מחט 21 גרם להדרכה (ראו איור משלים 1a).
2. כעת הנחה את מחט 21 G לתפירת חור במקום היישום הקודם של המחט (איור משלים 1b).
3. שלפו את מחט ה-21 גרם (איור משלים 1c).
4. השתמשו במחזיק מחט זעירה ותפר 10/0 כדי לתפור (ללא קשירה) את קצה השופכן הגזום ולנקב את שלפוחית השתן עם תפר 10/0 זה שוב במקום כניסתו (איור משלים 1d).
5. השתמשו במחזיק מחט זעיר כדי לגרור את חוט ה-10/0 ואת השופכן לשלפוחית השתן דרך החור הבנוי (איור משלים 1e).
6. השתמשו במחזיק מחט זעיר ובעוד תפר של 10/0 כדי להצמיד את השופכן של התורם לשלפוחית השתן של המקבל. כאן, חברו את הקרום החיצוני של השופכן לממברנה החיצונית של דופן שלפוחית השתן, ובצעו תפרים לסירוגין עם 3 עד 4 תפרים. לבסוף, שלפו את תפר המתיחה (איור משלים 1f).
7. השתמש במלקחיים כדי להחזיר את המעיים לחלל הבטן. בצעו תפרים דו-שכבתיים (תחילה שרירי הבטן ואחריהם העור) כדי לסגור את פצע הבטן באמצעות נימה של 4/0.
8. מכניסים את העכברים המושתלים לחדר מבוקר חמצן וטמפרטורה לצורך התאוששות לאחר הניתוח.
9. עבור משכך כאבים לאחר הניתוח, תן ישירות Metamizol 200 מ"ג / ק"ג לכל מערכת הפעלה לאחר הניתוח.
   ארבע ו-16 שעות לאחר הניתוח נותנות ל-Metamizol 200 מ"ג/ק"ג לכל מערכת הפעלה בתוספת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) s.c. במעקב הנוסף, יש למרוח קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) s.c. על העכברים המושתלים כל 24 שעות במשך שלושה ימים רצופים לאחר הניתוח¹³. אם יש סימנים של משכך כאבים לא מספיק buprenorphine 0.05 מ"ג / ק"ג ניתן בנוסף כל 8 שעות s.c.

5. כריתת נפש והקרבה של העכבר המקבל

הערה: בצעו כריתת נפרקציה של העכבר המושתל 5 ימים לאחר ההשתלה.

1. בצע את כריתת הנפרקציה של העכבר המושתל 5 ימים לאחר ההשתלה בהרדמה. מלטפים וחותכים את עורקי הכליה והוורידים הימניים האוטולוגיים של הנמען, מסירים את הכליה הימנית וסוגרים את חלל הבטן. הטיפול לאחר הניתוח ומשככי הכאבים זהים לאלה שתוארו קודם לכן (ראו שלב 4.7).
2. הרם ותעד את מצב העכבר. ספק לעכבר המושתל משככי כאבים, מזון ואספקת מים לאחר הניתוח.
3. ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, להקריב מחצית מהעכברים המושתלים ולבצע צביעת H&E עבור השתלות הכליה שלהם.
4. 12 שבועות לאחר ההשתלה, להקריב את העכברים הנותרים ולבצע צביעת זהב מאסון של השתלות כליה אלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, הן הטכניקה המתוקנת והן הטכניקה הקונבנציונלית הראו סימנים מתונים של ניוון צינורי כלייתי^14,15 בהשוואה לכליות הקונטרה-צדדיות של המושתלים המקומיים (איור 1). מידת ניוון צינוריות הכליה לא הראתה הבדל משמעותי בין שתי הטכניק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעוד שמודל השתלת העור בעכברים הוא פשוט וקל לביצוע כדי לחקור אירועי דחייה אלואימוניים, הטכניקות הכירורגיות לחקר באופן ספציפי יותר את השינויים הדלקתיים הקשורים לאלואימוניות לאחר לב¹⁶ והשתלת כליה¹⁰ הוכחו כמורכבת ותובענית מאוד. מנקודת מבטו של הנפרולוג המושתל, להקמת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-