Una tecnica chirurgica modificata per il trapianto di rene nei topi

Riepilogo

Questo protocollo presenta una nuova tecnica chirurgica di trapianto di rene di topo incentrata su una strategia di anastomosi arteriosa modificata. Viene anche presentata una tecnica di sutura vascolare che include un metodo di anastomosi uretere-vescica semplice e più sicuro. Queste modifiche riducono i tempi di operazione e migliorano il tasso di successo della procedura di trapianto di rene di topo.

Abstract

Il trapianto di rene nei topi è una procedura chirurgica complicata e impegnativa. Ci sono pochissime pubblicazioni che dimostrano i passaggi chiave di questa operazione. Pertanto, questo articolo introduce la tecnica e sottolinea gli avvertimenti chirurgici associati a questa operazione. Inoltre, vengono dimostrate importanti modifiche rispetto alla procedura convenzionale. In primo luogo, una patch dell'aorta addominale viene tagliata e preparata in modo che le biforcazioni prossimali dell'arteria renale, compresa l'arteria ureterale, vengano transettate insieme al rene donatore in blocco. Ciò riduce il rischio di necrosi dell'uretere ed evita lo sviluppo di un'occlusione delle vie urinarie. In secondo luogo, viene dimostrato un nuovo metodo di anastomosi vascolare che consente all'operatore di aumentare o diminuire in modo flessibile le dimensioni dell'anastomosi dopo che la riperfusione del trapianto renale è già stata avviata. Ciò evita lo sviluppo di stenosi dei vasi e sanguinamento intraaddominale. In terzo luogo, viene mostrata una tecnica che consente l'anastomosi del delicato uretere donatore e della vescica ricevente che non causa un trauma. L'adozione di questo protocollo può ridurre i tempi di operazione e ridurre il danno alla vescica del ricevente, aumentando così significativamente il tasso di successo dell'operazione per i topi riceventi.

Introduzione

Da quando Sakowitz et al. hanno sviluppato modelli murini di trapianto di rene nel 1973 per la prima volta¹, si è dimostrato un importante strumento sperimentale per studiare i meccanismi del danno ischemico da trapianto e del rigetto alloimmune, nonché per lo sviluppo di nuovi trattamenti volti a prolungare la sopravvivenza dell'allotrapianto e possibilmente a raggiungere la tolleranza immunologica. Tuttavia, la tecnica chirurgica si è dimostrata complessa e molto impegnativa, a volte con complicazioni come stenosi anastomotiche vascolari che portano a fallimento del trapianto di rene prerenale non immunologico², insufficienza postrenale causata da ischemia e successiva necrosi dell'uretere trapiantato, stenosi dell'anastomosi dell'uretere trapiantato e / o della vescica urinaria del ricevente che porta a un'interruzione del deflusso urinario. Tutti questi sono i motivi per cui il trapianto renale nei topi non è stato ulteriormente sviluppato e quindi non è ampiamente utilizzato. Stabilire un modello di trapianto di rene di topo efficace e stabile a lungo termine senza complicazioni del tratto vascolare e urinario ha ancora un significato insostituibile per molti studi nel campo dei trapianti con particolare attenzione alle malattie immunitarie renali mediate ma anche infettive³. Inoltre, rispetto ad altri trapianti di organi in modelli murini come il trapianto di polmone, cuore e intestino ^4,5, il modello di trapianto di rene di topo offre la possibilità di studiare la sopravvivenza a lungo termine anche nel contesto della maggiore disparità antigenica di istocompatibilità ^3,6. È stato anche dimostrato che nello stesso contesto di combinazioni di ceppi donatore-ricevente diversi trapianti di organi come cuore o rene sono caratterizzati da diverse dinamiche e insorgenze di rigetto dell'allotrapianto³. Inoltre, dal punto di vista nefrologico, è un modello più adatto per lo studio dei meccanismi di immunoregolazione mediata parenchimale nel contesto di eventi di rigetto acuto e cronico rispetto ai semplici esperimenti di trapianto cutaneo.

Sulla base di precedenti rapporti sulla tecnica chirurgica del trapianto di rene nei topi 3,7,8,9, dimostriamo qui i seguenti miglioramenti affidabili che sono stati applicati con successo negli ultimi 10 anni all'interno del nostro gruppo 10,11,12: In primo luogo, l'arteria ureterale è conservata in modo sicuro poiché l'arteria renale viene resecata in blocco insieme alla rispettiva parte dell'aorta addominale. In secondo luogo, una nuova, semplice e rapida tecnica di un'anastomosi vascolare senza nodi in cui il punto finale dell'anastomosi non è legato alla fine della cravatta superiore come l'approccio tradizionale, ma rimane libero. Questa tecnica consente di aumentare o diminuire le dimensioni dell'anastomosi dopo riperfusione renale per evitare la stenosi vascolare e il sanguinamento intraaddominale. In terzo luogo, gli aghi per siringhe da 21 G e 30 G sono stati utilizzati come strumento ausiliario di guida della puntura al fine di impiantare l'uretere donatore nella parete della vescica del ricevente riducendo il danno alla vescica del ricevente e facilitando la formazione di anastomosi libera da stenosi.

In questo rapporto, abbiamo anche confrontato la tecnica tradizionale ampiamente utilizzata con quella modificata che è stabilita nel nostro laboratorio e non abbiamo trovato differenze significative nel grado di atrofia tubulare renale e fibrosi del tessuto interstiziale del trapianto di rene. In studi precedenti, abbiamo inoltre confrontato i risultati di questa nuova tecnica con il metodo convenzionale in termini di sanguinamento locale, trombosi, tempo per l'esecuzione dell'anastomosi vascolare e tasso di sopravvivenza. Abbiamo riscontrato miglioramenti come riduzioni significative degli eventi di trombosi locale (1,1% contro 6,6%), un tempo ridotto per la procedura di anastomosi e una sopravvivenza a lungo termine dell'innesto singenico renale altamente riproducibile (95% contro 84% con l'approccio classico)¹⁰.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (Carta etica degli animali: Ministero della sicurezza alimentare e farmaceutica della Bassa Sassonia, #33.9-42502-04-11/0492). Eseguire procedure utilizzando strumenti chirurgici sterili e materiali di consumo (autoclavati) e cercare di mantenere l'area operatoria il più sterile possibile.

NOTA: I topi maschi C57BL/6J sono stati donatori e riceventi (modello di trapianto sinergico) mentre i topi Balb/c sono stati riceventi di allotrapianto renale (modello per lo studio del rigetto acuto dell'allotrapianto modello⁹). I topi avevano un'età compresa tra 8-12 settimane, pesavano ~ 25-30 g al momento del trapianto e sono stati alloggiati in condizioni standard. I dati riportati in questo manoscritto sono stati generati da quattro chirurghi esperti in chirurgia dei topi.

1. Fasi preparatorie

1. Per la chirurgia, utilizzare una serie di strumenti microscopici, tra cui un micro-forbice, micro-pinze, un portaago, micro morsetti emostatici e una penna elettrochirurgica. Eseguire suture utilizzando monofilamento in nylon 7/0er, 10/0er o 4/0er.
2. Per l'anestesia, posizionare il mouse nella scatola per inalazione di isoflurano (2%) per circa 40-60 s al fine di indurre perdita di coscienza.
3. Una volta che il mouse è anestetizzato, pesare il mouse.
4. In base al peso del topo, applicare un'iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) per anestetizzare il topo¹³. Confermare che il mouse è anestetizzato osservando una mancanza di risposta a un pizzico di punta.
5. Quando l'anestesia ha avuto effetto, tagliare la pelliccia addominale. Quindi, fissare il mouse sul tavolo operatorio immobilizzando liberamente gli arti con un nastro adesivo sterile.
6. Disinfettare l'addome del mouse dopo aver posizionato il mouse sul tavolo operatorio. Eseguire la disinfezione utilizzando uno scrub alternato di ioduro di povidone (iodoforo) e alcol, tre volte (utilizzare un modello concentrico, iniziare lo scrub nel mezzo dell'addome e spostarsi verso l'esterno), quindi drappeggiare correttamente il mouse usando un asciugamano chirurgico fenestrato.
7. Applicare unguento per gli occhi e mantenere la sterilità durante tutta la procedura.
   NOTA: Gli antibiotici non sono raccomandati durante tutta la procedura in quanto queste sostanze possono influenzare le risposte immunologiche.

2. Procedura di intervento del donatore

1. Utilizzare le forbici per tagliare la pelle ed eseguire un'incisione addominale incrociata di circa 3-4 cm. Tagliare i muscoli della parete addominale. Coprire e allontanare con cautela i visceri con una garza salina assorbita.
2. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere delicatamente l'intestino, lo stomaco e la milza verso il lato destro (dal punto di vista del topo), coprire e allontanare con cautela i visceri con una garza salina assorbita.
3. Utilizzare micro pinze per esporre il rene sinistro, l'aorta e la vena cava inferiore (IVC).
4. Utilizzare una matita elettrochirurgica per cauterizzare le vene lombari sinistre, compresi i rami sottostanti e altri piccoli vasi insieme al vaso surrenale sinistro, con attenzione.
5. Utilizzare micro forbici e pinze per sezionare l'uretere sinistro e mobilitarlo con cautela dal tessuto circostante. Tagliarlo pulito vicino alla vescica urinaria. Mobilitare la regione aortica tra le arterie renali sinistra e destra di circa 2 mm di lunghezza.
6. Utilizzare micro pinze per separare la vena cava inferiore infrarenale (IVC) e l'aorta, quindi utilizzare pinze curve per passare sotto l'aorta per posizionare una cravatta sciolta di sutura di seta 7-0 attorno a questo vaso.
7. Cross clamp l'area dell'aorta sotto l'arteria renale destra e la vena cava inferiore (IVC) utilizzando due morsetti microvascolari da 5 mm.
8. Trasmettere la vena renale sinistra dalla vena cava.
9. Utilizzare una siringa per lavare l'aorta con 1 mL di soluzione salina di eparina (60 U/mL).
10. Utilizzare micro pinze per stringere la legatura applicata al passaggio 2.5. Quindi, tagliare l'aorta sotto la legatura e sotto il morsetto prossimale. Con questo, le biforcazioni prossimali dell'arteria renale (si prega di notare che l'apertura arteriosa deve essere tagliata ordinatamente, altrimenti influenzerà l'anastomosi) e l'arteria ureterale sono incluse e transettate in blocco. Preparare con cura, in modo che la delicata arteria ureterale sia completamente conservata.
11. Utilizzare la matita elettrochirurgica e la pinza per liberare completamente il rene sinistro e i vasi associati cauterizzando con cautela tutti i vasi circostanti il tessuto. Rimuovere il rene e conservarlo in soluzione salina a 4 °C.
12. Eutanasia del topo donatore anestetizzato mediante decapitazione.

3. Procedura di funzionamento del destinatario

1. Eseguire le fasi chirurgiche iniziali (tra cui anestesia e sterilizzazione, vedere i passaggi da 1.1 a 1.7) come descritto per il topo donatore.
2. Utilizzare le forbici per aprire l'addome tramite un'incisione mediana (circa 2,5 cm di lunghezza), quindi coprire gli organi addominali con una garza bagnata usando una soluzione salina.
3. Conservare con cura l'aorta infrarenale e la vena cava inferiore (IVC) e assicurarsi che ogni ramo di vaso di grandi dimensioni sia cauterizzato. Utilizzare anche la cauterizzazione elettrica per sezionare attentamente l'uretere sinistro in una posizione prossimale alla pelvi renale. Quindi, rimuovere il rene sinistro.
4. Utilizzare micro pinze e cotton fioc per esporre l'aorta addominale e la vena cava inferiore e staccarle dal tessuto adiposo circostante (circa oltre 4 mm di lunghezza).
5. Utilizzare due morsetti microvascolari e posizionarli prossimalmente e distalmente sia sulla vena cava inferiore che sull'aorta addominale contemporaneamente.
6. Utilizzare un supporto per micro ago per guidare un ago di sutura monofilamento 10/0 (realizzato in fibra sintetica con una superficie liscia), che viene posizionato attraverso la parete dell'aorta in modo prossimale o distale.
7. Ottenere un'arteriotomia ellittica di circa 1 mm con una leggera trazione verso l'alto della sutura, mentre si taglia direttamente sotto la faccia inferiore dell'ago con forbici sottili e curve.
8. Utilizzare micro forbici per tagliare longitudinalmente la vena cava inferiore (IVC) con una lunghezza sufficiente di circa 1,5 mm. Posizionare questa incisione leggermente al di sotto della sua controparte aortica.
9. Eseguire l'anastomosi dell'aorta donatrice e ricevente in modo end-to-side. Posizionare il rene donatore sul lato destro della vena cava inferiore del ricevente allineando il bracciale dell'aorta addominale del donatore con l'anastomosi dell'aorta addominale del ricevente.
10. Utilizzare un supporto per micro aghi e due suture separate 10-0 per cucire le estremità prossimale e distale dell'anastomosi.
11. Dopo aver legato, lasciare le due lunghe suture, compreso l'ago, in posizione. Cucire continuamente il lato sinistro della parete aortale dell'anastomosi con due punti uniformemente distanziati in direzione distale-prossimale.
12. Dopo l'ultimo punto, guidare la sutura attraverso uno spessore parziale della parete del vaso sopra la cravatta di sutura del soggiorno superiore.
13. Utilizzare micro pinze per esercitare contemporaneamente una trazione delicata fino all'estremità corta della cravatta di sutura inferiore.
    NOTA: In questa nuova tecnica senza nodi, l'ultimo punto non è legato all'estremità corta della cravatta superiore.
14. Utilizzare micro pinze per capovolgere il rene trapiantato nella sua posizione normale. Ora cuci continuamente la parete destra dell'anastomosi aortale usando tre punti in modo prossimale a distale.
    NOTA: Rispetto alla tecnica chirurgica convenzionale ^7,8 l'ultima sutura viene fusa con la cravatta distale nelle vicinanze. Non legarlo all'estremità della sutura inferiore, tagliarlo per lasciare invece una lunghezza libera di 2-3 mm.
15. Eseguire l'anastomosi venosa utilizzando la stessa procedura di sutura precedentemente descritta con la differenza che sono necessari da quattro a cinque punti per ciascun lato dell'anastomosi. Il punto finale viene lasciato come un'estremità libera di lunghezza simile all'anastomosi aortale sopra descritta.
16. Dopo aver completato entrambe le anastomosi, utilizzare un tampone asciutto per esercitare una leggera pressione verso l'area suturata per circa 10-20 s.
17. Utilizzare una pinza applicatore a clip per rimuovere entrambi i morsetti, prima quello inferiore e quello superiore. Risciacquare la cavità addominale con lo 0,9% di cloruro di sodio ad una temperatura di 38,0 °C.
18. Osservare la riperfusione del rene trapiantato.

4. Impianto ureterale

1. Utilizzare un supporto per micro ago per penetrare attraverso la vescica urinaria del ricevente con una sutura 10/0 (ago dritto) e inserirlo in un lume dell'ago da 21 G per una guida (vedere figura 1a supplementare).
2. Ora guida l'ago da 21 G per cucire un foro nel punto della precedente applicazione dell'ago (Figura supplementare 1b).
3. Estrarre l'ago da 21 G (Figura supplementare 1c).
4. Utilizzare un supporto per micro ago e una sutura 10/0 per cucire (senza cravatta) l'estremità dell'uretere tagliato e perforare nuovamente la vescica con questa sutura 10/0 nel punto di ingresso (Figura supplementare 1d).
5. Utilizzare un supporto per micro aghi per trainare il filamento 10/0 e l'uretere nella vescica urinaria attraverso il foro costruito (Figura supplementare 1e).
6. Utilizzare un supporto per micro aghi e un'altra sutura 10/0 per anastomosi l'uretere del donatore nella vescica urinaria del ricevente. Qui, collegare la membrana esterna dell'uretere alla membrana esterna della parete della vescica ed eseguire suture intermittenti con 3 o 4 punti. Infine, estrarre la sutura di trazione (Figura supplementare 1f).
7. Utilizzare una pinza per riposizionare l'intestino nella cavità addominale. Eseguire suture a due strati (prima i muscoli addominali seguiti dalla pelle) per chiudere la ferita addominale utilizzando un filamento 4/0.
8. Posizionare i topi trapiantati in una camera a ossigeno e temperatura controllata per il recupero dopo l'intervento chirurgico.
9. Per l'analgesia postoperatoria, somministrare direttamente Metamizol 200 mg/kg per os dopo l'operazione.
   Quattro e 16 ore dopo l'operazione somministrare Metamizol 200 mg/kg per os più Carprofene (5mg/kg) s.c. Nell'ulteriore follow-up, applicare Carprofen (5 mg/kg) s.c. ai topi trapiantati ogni 24 ore per tre giorni consecutivi dopo l'operazione¹³. Se vi sono segni di un'analgesia insufficiente, la buprenorfina viene somministrata inoltre 0,05 mg/kg ogni 8 ore s.c.

5. Nefrectomia controlaterale e sacrificio del topo ricevente

NOTA: Eseguire la nefrectomia controlaterale del topo ricevente 5 giorni dopo il trapianto.

1. Eseguire la nefrectomia controlaterale del topo trapiantato 5 giorni dopo il trapianto in anestesia. Ligate e tagliare le arterie e le vene renali destri autologhe del ricevente, rimuovere il rene destro e chiudere la cavità addominale. La cura postoperatoria e l'analgesia sono le stesse descritte in precedenza (vedere il passo 4.7).
2. Aumentare e registrare lo stato del mouse. Fornire al topo trapiantato analgesia postoperatoria, cibo e approvvigionamento idrico.
3. Quattro settimane dopo il trapianto, sacrificare metà dei topi trapiantati ed eseguire la colorazione H & E per i loro trapianti di rene.
4. 12 settimane dopo il trapianto, sacrificare i topi rimanenti ed eseguire la colorazione Masson Gold di questi trapianti di rene.

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Risultati

Quattro settimane dopo il trapianto, sia la tecnica modificata che la tecnica convenzionale hanno mostrato segni moderati di atrofia tubulare renale^14,15 rispetto ai reni controlaterali riceventi nativi (Figura 1). Il grado di atrofia dei tubuli renali non ha dimostrato alcuna differenza significativa tra le due diverse tecniche. La colorazione tricroma di Masson Goldner^{in 14,15}

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Discussione

Mentre il modello di trapianto di pelle nei topi è semplice e facile da eseguire per studiare gli eventi di rigetto alloimmune, le tecniche chirurgiche per indagare più specificamente le alterazioni infiammatorie correlate all'alloimmune dopo il cuore¹⁶ e il trapianto di rene¹⁰ si sono dimostrate complesse e molto impegnative. Dal punto di vista del nefrologo dei trapianti, l'istituzione di un modello di trapianto renale di topo efficace e stabile a lungo termine ha ancor...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-