Farelerde Böbrek Nakli için Modifiye Bir Cerrahi Teknik

Özet

Bu protokol, modifiye arteriyel anastomoz stratejisine odaklanan fare böbrek transplantasyonunun yeni bir cerrahi tekniğini sunmaktadır. Basit ve daha güvenli bir üreter-mesane anastomoz yöntemini içeren bir vasküler sütür tekniği de sunulmaktadır. Bu modifikasyonlar ameliyat süresini kısaltır ve fare böbrek nakli işleminin başarı oranını artırır.

Özet

Farelerde böbrek nakli karmaşık ve zorlu bir cerrahi prosedürdür. Bu operasyonun temel adımlarını gösteren çok az yayın var. Bu nedenle, bu makale tekniği tanıtmakta ve bu operasyonla ilişkili cerrahi uyarılara işaret etmektedir. Ek olarak, geleneksel prosedüre kıyasla önemli değişiklikler gösterilmiştir. İlk olarak, abdominal aortun bir yaması kesilir ve hazırlanır, böylece üreter arteri de dahil olmak üzere renal arterin proksimal bifurkasyonları donör böbrek en blok ile birlikte transekte edilir. Bu, üreter nekrozu riskini azaltır ve idrar yolu tıkanıklığının gelişmesini önler. İkincisi, böbrek nakli reperfüzyonu başlatıldıktan sonra operatörün anastomozun boyutunu esnek bir şekilde artırmasına veya azaltmasına izin veren yeni bir vasküler anastomoz yöntemi gösterilmiştir. Bu, damar darlıklarının ve intraabdominal kanamanın gelişmesini önler. Üçüncü olarak, hassas donör üreterin ve alıcı mesanesinin travmaya neden olmayan anastomozunu sağlayan bir teknik gösterilmiştir. Bu protokolün benimsenmesi operasyon süresini kısaltabilir ve alıcının mesanesine verilen hasarı azaltabilir, böylece alıcı fareler için operasyon başarı oranını önemli ölçüde artırabilir.

Giriş

Sakowitz ve ark. 1973 yılında ilk kez böbrek transplantasyonunun fare modellerini geliştirdiğinden beri¹, transplant iskemik hasarı ve alloimmün rejeksiyon mekanizmalarını incelemek ve allogreft sağkalımını uzatmak ve muhtemelen immünolojik toleransı sağlamak için yeni tedaviler geliştirmek için önemli bir deneysel araç olarak kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, cerrahi tekniğin karmaşık ve çok zorlu olduğu kanıtlanmıştır, bazen prerenal immünolojik olmayan böbrek nakli yetmezliğine yol açan vasküler anastomoz darlıkları², iskeminin neden olduğu postrenal yetmezlik ve nakledilen üreterin müteakip nekrozu, nakledilen üreterin anastomozunun darlıkları ve / veya alıcının idrar mesanesinin darlıkları idrar çıkışının bozulmasına neden olan komplikasyonlara neden olmuştur. Bunların hepsi, farelerde böbrek transplantasyonunun daha da gelişmemesinin ve bu nedenle yaygın olarak kullanılmamasının nedenleridir. Vasküler ve üriner sistem komplikasyonları olmadan etkili ve uzun süreli stabil bir fare böbrek nakli modeli oluşturmak, böbrek immün aracılı ve aynı zamanda bulaşıcı hastalıklara odaklanarak nakil alanındaki birçok çalışma için hala yeri doldurulamaz bir öneme sahiptir³. Ek olarak, akciğer, kalp ve bağırsak nakli ^4,5 gibi murin modellerindeki diğer organ nakilleriyle karşılaştırıldığında, fare böbrek nakli modeli, majör histokompatibilite antijen eşitsizliği ^3,6 ortamında bile uzun süreli sağkalımı incelemek için bir şans sunmaktadır. Ayrıca, donör-alıcı suş kombinasyonlarının aynı ortamında, kalp veya böbrek gibi farklı organ nakillerinin, allogreft reddinin farklı dinamikleri ve başlangıçları ile karakterize olduğu gösterilmiştir³. Ayrıca, nefrolojik açıdan bakıldığında, akut ve kronik rejeksiyon olayları bağlamında parankimal aracılı immün düzenleyici mekanizmaları incelemek için basit cilt nakli deneylerinden daha uygun bir modeldir.

Farelerde böbrek nakli cerrahi tekniği ile ilgili önceki raporlara dayanarak ^3,7,8,9, grubumuzda son 10 yılda başarıyla uygulanan aşağıdaki güvenilir gelişmeleri gösteriyoruz^10,11,12: İlk olarak^, renal arter en blok rezeke edildiğinden üreter arteri güvenli bir şekilde korunmaktadır. abdominal aortun ilgili kısmı ile birlikte. İkincisi, anastomozun son dikişinin geleneksel yaklaşım gibi üst bağın ucuna bağlanmadığı, ancak serbest kaldığı düğümsüz bir vasküler anastomozun yeni, basit ve hızlı bir tekniğidir. Bu teknik, damar darlığını ve intraabdominal kanamayı önlemek için renal reperfüzyon sonrası anastomozun boyutunun arttırılmasını veya azaltılmasını sağlar. Üçüncü olarak, 21 G ve 30 G şırınga iğneleri, donör üreterin alıcının mesane duvarına implante edilmesi için yardımcı bir delinme kılavuz aracı olarak kullanıldı ve alıcının mesanesindeki hasarı azalttı ve darlık içermeyen anastomoz oluşumunu kolaylaştırdı.

Bu yazıda ayrıca geleneksel, yaygın olarak kullanılan tekniği laboratuvarımızda kurulan modifiye teknikle karşılaştırdık ve renal tübüler atrofi ve böbrek nakli interstisyel doku fibrozisi derecelerinde anlamlı bir fark bulamadık. Önceki çalışmalarda lokal kanama, tromboz, damar anastomozu yapılma süresi ve sağkalım oranı açısından bu yeni tekniğin sonuçlarını konvansiyonel yöntemle karşılaştırdık. Lokal tromboz olaylarında önemli azalmalar (%1.1'e karşı %6.6), anastomoz prosedürü için daha kısa bir süre ve yüksek oranda tekrarlanabilir böbrek sinjenik greft uzun süreli sağkalım (klasik yaklaşımla %95'e karşı %84) gibi iyileşmeler ^bulduk10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Avrupa Parlamentosu'nun bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı direktifindeki yönergelere göre yürütülmüştür (Hayvan etik kartı: Aşağı Saksonya Gıda ve İlaç Güvenliği Bakanlığı, #33.9-42502-04-11/0492). Steril cerrahi aletler ve sarf malzemeleri (otoklavlanmış) kullanarak prosedürler uygulayın ve çalışma alanını mümkün olduğunca steril tutmaya çalışın.

NOT: C57BL / 6J erkek fareler donör ve alıcı olarak görev yaparken (sinjenik nakil modeli), Balb / c fareleri böbrek allogreft alıcıları olarak görev yaptı (akut allogreft reddi modelini incelemek için model⁹). Fareler 8-12 hafta arasında yaşlandı, transplantasyonda ~ 25-30 g ağırlığındaydı ve standart koşullar altında barındırıldı. Bu makalede bildirilen veriler, fare cerrahisinde deneyimli dört cerrah tarafından oluşturulmuştur.

1. Hazırlık adımları

1. Ameliyat için, bir mikro makas, mikro forseps, bir iğne tutucu, mikro hemostatik kelepçeler ve bir elektrocerrahi kalem dahil olmak üzere bir dizi mikroskobik alet kullanın. 7/0er, 10/0er veya 4/0er naylon monofilament kullanarak dikiş yapın.
2. Anestezi için, bilinç kaybına neden olmak için fareyi izofluranı (% 2) yaklaşık 40-60 s solumak için kutuya yerleştirin.
3. Fare anestezi uygulandıktan sonra fareyi tartın.
4. Farenin ağırlığına göre, fareyi uyuşturmak için intraperitoneal ketamin (100 mg / kg) + ksilazin (10 mg / kg) + asepromazin (2 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın¹³. Bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediğini gözlemleyerek farenin anestezi uygulandığını doğrulayın.
5. Anestezi etkili olduğunda, karın kürkünü klipsleyin. Ardından, uzuvları steril bir maskeleme bandı ile gevşek bir şekilde hareketsiz hale getirerek fareyi ameliyat masasına sabitleyin.
6. Fareyi ameliyat masasına yerleştirdikten sonra farenin karnını dezenfekte edin. Povidon iyodür (iyodofor) ve alkolün alternatif ovma işlemini kullanarak üç kez (konsantrik desen kullanın, karın ortasından ovalamaya başlayın ve dışarı doğru hareket edin) dezenfeksiyon yapın ve ardından federe bir cerrahi havlu kullanarak fareyi düzgün bir şekilde örtün.
7. Göz merhemi uygulayın ve prosedür boyunca steriliteyi koruyun.
   NOT: Bu maddeler immünolojik yanıtları etkileyebileceğinden prosedür boyunca antibiyotikler önerilmez.

2. Donör operasyon prosedürü

1. Cildi kesmek ve yaklaşık 3-4 cm'lik çapraz karın kesisi yapmak için makas kullanın. Karın duvarının kaslarını kesin. İç organları tuzlu bir emilimli gazlı bezle örtün ve dikkatli bir şekilde uzaklaştırın.
2. Bağırsakları, mideyi ve dalağı sağ tarafa doğru (farenin bakış açısından) nazikçe çıkarmak için pamuklu çubukla kullanın, örtün ve visserayı tuzlu bir gazlı bezle dikkatlice uzaklaştırın.
3. Sol böbrek, aort ve inferior vena kavayı (IVC) ortaya çıkarmak için mikro forseps kullanın.
4. Sol lomber damarları, altta yatan dalları ve sol adrenal damarla birlikte diğer küçük damarları dikkatlice koterize etmek için elektrocerrahi bir kalem kullanın.
5. Sol üreteri diseke etmek ve onu çevreleyen dokudan dikkatli bir şekilde harekete geçirmek için mikro makas ve forseps kullanın. Temiz idrar kesesine yakın kesin. Sol ve sağ renal arterler arasındaki aort bölgesini yaklaşık 2 mm uzunluğunda mobilize edin.
6. İnfrarenal inferior vena kava (IVC) ve aortu ayırmak için mikro forseps kullanın ve daha sonra bu damarın etrafına 7-0 ipek sütür gevşek bir bağ yerleştirmek için aortun altından geçmek için kavisli forseps kullanın.
7. İki adet 5 mm mikrovasküler kelepçe kullanarak aortun sağ renal arterin altındaki alanı ve inferior vena kavayı (IVC) çapraz kelepçeleyin.
8. Sol böbrek damarını vena kavadan transekte edin.
9. Aortu 1 mL heparin salin çözeltisi (60 U / mL) ile yıkamak için bir şırınga kullanın.
10. Adım 2.5'te uygulanan bağı sıkmak için mikro forseps kullanın. Daha sonra, aortu ligatürün altında ve proksimal kelepçenin altında kesin. Bununla birlikte, renal arterin proksimal bifurkasyonları (arteriyel açıklığın düzgün bir şekilde kesilmesi gerektiğini lütfen unutmayın, aksi takdirde anastomozu etkiler) ve üreter arteri dahil edilir ve en blok halinde transekte edilir. Hassas üreter arterinin tamamen korunması için dikkatlice hazırlanın.
11. Sol böbreği ve ilişkili damarları tamamen serbest bırakmak için elektrocerrahi kalem ve forseps kullanın, böylece tüm damar çevresindeki dokuyu dikkatli bir şekilde koterize edin. Böbreği çıkarın ve 4 ° C'de tuzlu su çözeltisinde saklayın.
12. Anestezi uygulanan donör fareyi dekapitasyon yoluyla ötenazileştirin.

3. Alıcı operasyon prosedürü

1. Donör fare için tarif edildiği gibi ilk cerrahi adımları (anestezi ve sterilizasyon dahil, bkz. adım 1.1 ila 1.7) gerçekleştirin.
2. Karnı medyan bir kesi (yaklaşık 2,5 cm uzunluğunda) ile açmak için makas kullanın ve ardından karın organlarını tuzlu su çözeltisi kullanarak ıslak bir gazlı bezle örtün.
3. İnfrarenal aort ve inferior vena kavayı (IVC) dikkatlice koruyun ve her büyük damar dalının koterize edildiğinden emin olun. Sol üreteri böbrek pelvisine yakın bir pozisyonda dikkatlice diseke etmek için elektrikli koteri de kullanın. Ardından, sol böbreği çıkarın.
4. Abdominal aort ve inferior vena kavayı açığa çıkarmak için mikro forseps ve pamuk tomurcukları kullanın ve bunları çevreleyen yağ dokusundan ayırın (yaklaşık 4 mm'den uzun boyu).
5. İki mikrovasküler kelepçe kullanın ve bunları aynı anda hem inferior vena kava hem de abdominal aort üzerine proksimal ve distal olarak yerleştirin.
6. Aort duvarından distal bir şekilde proksimal bir şekilde yerleştirilen 10/0 monofilament (pürüzsüz bir yüzeye sahip sentetik elyaftan yapılmış) sütür iğnesini yönlendirmek için bir mikro iğne tutucu kullanın.
7. İptürün hafifçe yukarı doğru çekilmesiyle yaklaşık 1 mm'lik bir eliptik arteriyotomi elde edin, iğnenin alt yüzünün hemen altını ince, kavisli makasla kesin.
8. İnferior vena kavayı (IVC) uzunlamasına yaklaşık 1,5 mm yeterli uzunlukta kesmek için mikro makas kullanın. Bu insizyonu aort muadilinin biraz altına yerleştirin.
9. Donör ve alıcı aort anastomozunu uçtan yana uygulayın. Donör böbreğini, alıcının abdominal aortunun manşetini alıcının abdominal aortunun anastomozu ile hizalayan alıcının inferior vena kavasının sağ tarafına yerleştirin.
10. Anastomozun proksimal ve distal uçlarını dikmek için bir mikro iğne tutucu ve iki ayrı 10-0 dikiş kullanın.
11. Bağladıktan sonra, iğne de dahil olmak üzere iki uzun dikişi yerinde bırakın. Anastomozun aort duvarının sol tarafını distal-proksimal yönde eşit aralıklı iki dikişle sürekli dikin.
12. Son dikişten sonra, sütürü, üst kalış dikiş bağının üzerindeki damar duvarının kısmi kalınlığından geçirin.
13. Alt dikiş bağının kısa ucuna aynı anda nazik bir çekiş uygulamak için mikro forseps kullanın.
    NOT: Bu yeni düğümsüz teknikte, son dikiş üst bağın kısa ucuna bağlı değildir.
14. Nakledilen böbreği normal konumuna getirmek için mikro forseps kullanın. Şimdi sürekli olarak aort anastomozunun sağ duvarını distal bir şekilde proksimal ila distal bir şekilde üç dikiş kullanarak dikin.
    NOT: Konvansiyonel cerrahi teknik^7,8 ile karşılaştırıldığında^, son dikiş yakındaki distal bağ ile birleştirilmiştir. Alt dikişin ucuna bağlamayın, bunun yerine 2-3 mm'lik serbest bir uzunluk bırakmak için kesin.
15. Venöz anastomozu, anastomozun her iki tarafı için dört ila beş dikişin gerekli olduğu farkıyla, daha önce tarif edildiği gibi aynı dikiş prosedürünü kullanarak gerçekleştirin. Son dikiş, yukarıda tarif edilen aort anastomozuna benzer uzunlukta serbest bir uç olarak bırakılır.
16. Her iki anastomozu da tamamladıktan sonra, dikişli bölgeye yaklaşık 10-20 s boyunca hafif bir basınç uygulamak için kuru bir çubuk kullanın.
17. Her iki kelepçeyi de çıkarmak için bir klips aplikatör forseps kullanın, önce alt, sonra üst. Karın boşluğunu 38.0 ° C sıcaklıkta% 0.9 sodyum klorür ile durulayın.
18. Nakledilen böbreğin reperfüzyonunu gözlemleyin.

4. Üreter implantasyonu

1. Alıcının idrar kesesine 10/0 dikişle (düz iğne) nüfuz etmek için bir mikro iğne tutucu kullanın ve rehberlik için 21 G'lik bir iğne lümenine yerleştirin (Ek Şekil 1a'ya bakınız).
2. Şimdi 21 G iğneyi önceki iğne uygulamasının yerine bir delik açmak için yönlendirin (Ek Şekil 1b).
3. 21 G iğneyi dışarı çekin (Ek Şekil 1c).
4. Kesilmiş üreter ucunu dikmek (bağ olmadan) için bir mikro iğne tutucu ve 10/0 dikiş kullanın ve mesaneyi giriş yerinde tekrar bu 10/0 sütür ile delin (Ek Şekil 1d).
5. 10/0 filamenti ve üreteri inşa edilen delikten idrar kesesine çekmek için bir mikro iğne tutucu kullanın (Ek Şekil 1e).
6. Donörün üreterini alıcının idrar kesesine anastomoz etmek için bir mikro iğne tutucu ve başka bir 10/0 dikiş kullanın. Burada, üreterin dış zarını mesane duvarının dış zarına bağlayın ve 3 ila 4 dikişle aralıklı dikişler yapın. Son olarak, çekiş sütürünü çıkarın (Ek Şekil 1f).
7. Bağırsakları karın boşluğuna geri yerleştirmek için forseps kullanın. 4/0 filament kullanarak karın yarasını kapatmak için iki katmanlı dikişler (önce karın kasları ve ardından cilt) uygulayın.
8. Nakledilen fareleri ameliyattan sonra iyileşmek için oksijen ve sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirin.
9. Postoperatif analjezi için, operasyondan sonra os başına doğrudan Metamizol 200 mg / kg verin.
   Ameliyattan dört ve 16 saat sonra Metamizol'e os başına 200 mg / kg artı Carprofen (5mg / kg) sc verir. Daha sonraki takipte, nakledilen farelere her 24 saatte bir, operasyondan sonraki üç gün boyunca Carprofen (5 mg / kg) sc'yi uygulayın¹³. Yetersiz analjezi belirtileri varsa, buprenorfin 0.05 mg / kg ayrıca her 8 saatte bir s.c.

5. Kontralateral nefrektomi ve alıcı farenin kurban edilmesi

NOT: Transplantasyondan 5 gün sonra alıcı farenin kontralateral nefrektomisini yapın.

1. Transplantasyondan 5 gün sonra nakledilen farenin kontralateral nefrektomisini anestezi altında gerçekleştirin. Alıcının otolog sağ renal arterlerini ve damarlarını bağlayın ve kesin, sağ böbreği çıkarın ve karın boşluğunu kapatın. Postoperatif bakım ve analjezi daha önce tarif edilenle aynıdır (bkz. adım 4.7).
2. Farenin durumunu kaldırın ve kaydedin. Nakledilen fareye ameliyat sonrası analjezi, yiyecek ve su temini sağlayın.
3. Transplantasyondan dört hafta sonra, nakledilen farelerin yarısını feda edin ve böbrek nakilleri için H & E boyama yapın.
4. Transplantasyondan 12 hafta sonra, kalan fareleri kurban edin ve bu böbrek nakillerinin Masson Gold boyamasını gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Transplantasyondan dört hafta sonra, hem modifiye teknik hem de konvansiyonel teknik, doğal alıcı kontralateral böbreklere kıyasla 14,15 oranında renal tübüler atrofi^14,15 orta derecede bulgular göstermiştir (Şekil 1). Renal tübül atrofisinin derecesi, iki farklı teknik arasında anlamlı bir fark göstermedi. Masson Goldner'ın transplantasyondan 12 hafta sonra böbreklerin^14,15'ini trikrom boy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Farelerde deri nakli modeli, alloimmün rejeksiyon olaylarını incelemek için basit ve kolay bir şekilde gerçekleştirilirken, kalp¹⁶ ve böbrek nakli¹⁰ sonrası alloimmün ilişkili inflamatuar değişiklikleri daha spesifik olarak araştırmak için cerrahi tekniklerin karmaşık ve çok zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Transplant nefrologunun bakış açısına göre, etkili ve uzun vadeli stabil bir fare böbrek nakli modelinin kurulması, birçok fonksiyonel ve im...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300	-
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P	-
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675	-
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07	-
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV	-
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number	-
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml	-
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W	-
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14	-
Curved forceps	WPI	14114-G	-
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365	-
Dehydrator	DIAPATH	Donatello	-
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP	-
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5	-
Ethanol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	100092683	-
Frozen platform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5	-
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353	-
Glass slide	Servicebio	G6004	-
HE dye solution set	Servicebio	G1003	-
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30	-
hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A	-
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820	-
ice box	PETZ	No Catalog Number available	-
Imaging system	Nikon	Nikon DS-U3	-
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616	-
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml	-
ketamine	Zoetis	no catalog numer	-
Masson dye solution set	Servicebio	G1006	-
metamizole	WDT	no catalog numer	-
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10	-
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06	-
Microscope	Leica	LEICAMZ6	-
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED	-
Neutral gum	SCRC	10004160	-
Oven	Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd	GFL-230	-
Pathology slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016	-
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Haus-Apotheke	PZN 06178437	-
scissors	Peha Instruments	991083/4	-
Slides	Servicebio		-
small Petri dish	Sarstedt	8,33,900	-
straight forceps	WPI	14113-G	-
surgical tape	BSN	4120	-
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10	-
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540	-
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H	-
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H	-
Syringe (0,3 mL)	BD	324826	-
Syringe (1 mL)	BD	320801	-
Tissue spreader	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P	-
Upright optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse E100	-
xylazine	Bayer	Rompun	-
Xylene	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD	10023418	-