JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم المخطوطة بروتوكولات قياس الطيف الكتلي متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة لتحديد وتحديد عدة فئات من الدهون من ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية.

Abstract

يعد تنشيط phospholipase Cβ (PLCβ) خطوة أساسية أثناء النقل الحسي في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية. ينتج عن نشاط PLCβ التحلل المائي للدهون الغشائية فوسفاتيديلينوسيتول 4،5 ثنائي الفوسفات [PI (4،5) P2] مما يؤدي في النهاية إلى تنشيط إمكانات المستقبل العابرة (TRP) و TRP مثل القنوات (TRPL). يؤدي نشاط PLCβ أيضا لاحقا إلى توليد العديد من أنواع الدهون التي تم اقتراح أن يلعب العديد منها دورا في تنشيط TRP و TRPL. بالإضافة إلى ذلك ، تم اقتراح عدة فئات من الدهون للعب أدوار رئيسية في تنظيم بيولوجيا الخلية للمستقبلات الضوئية لتحسين تفاعلات الإشارات من أجل النقل الحسي الأمثل. تاريخيا ، كانت هذه الاكتشافات مدفوعة بالقدرة على عزل ذبابة الفاكهة الطفرات للإنزيمات التي تتحكم في مستويات الدهون المحددة وإجراء تحليل لفسيولوجيا المستقبلات الضوئية في هذه الطفرات. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق قياس الطيف الكتلي القوية للعزل والتحليل الكمي للدهون ذات الحساسية والخصوصية العالية. هذه مناسبة بشكل خاص للاستخدام في ذبابة الفاكهة حيث يمكن الآن تحليل الدهون من المستقبلات الضوئية دون الحاجة إلى وضع العلامات على النويدات المشعة. في هذه المقالة ، يتم تغطية الاعتبارات المفاهيمية والعملية في استخدام قياس الطيف الكتلي الدهني من أجل التقييم الكمي القوي والحساس والدقيق لدهون الإشارات المختلفة في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية. إلى جانب الأساليب الحالية في علم الوراثة الجزيئي والتحليل الفسيولوجي ، من المرجح أن تعزز هذه الدهون قوة المستقبلات الضوئية كنظام نموذجي للاكتشافات في علم الأحياء.

Introduction

يتم التوسط في النقل الضوئي في ذبابة الفاكهة بواسطة سلسلة PLCβ مقترنة ببروتين G مما يؤدي إلى تنشيط القنوات التي يتم تنشيطها بالضوء TRP و TRPL1. PLCβ يحلل الفوسفوليبيد المرتبط بالغشاء ، فوسفاتيديلينوسيتول 4،5 ثنائي الفوسفات [PI (4،5) P2] ويولد ثنائي الجلسرين (DAG) ، والإينوزيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات (IP3). ثم يتم فسفرة DAG بواسطة DAG-kinase لتوليد حمض الفوسفاتيديك (PA). بعد ذلك ، من خلال سلسلة من التفاعلات التي تنطوي على توليد المواد الوسيطة الدهنية ، يتم تجديد PI (4،5) P2 2. العديد من مكونات دورة PI (4،5) P2 لها وظائف في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية. لا تزال الآلية التي يؤدي بها تنشيط PLC إلى بوابات قناة TRP و TRPL دون حل. ومع ذلك ، تشير عدة خطوط من الأدلة إلى أن المواد الوسيطة الدهنية الناتجة عن التحلل المائي PI (4،5) P2 قد تتوسط في هذه العملية3. وبالتالي ، من المهم جدا تحديد هذه المواد الوسيطة الدهنية وتحديدها كميا لإلقاء الضوء على آلية تنشيط TRP و TRPL في ذبابة الفاكهة النقل الضوئي. بالإضافة إلى دورها في النقل الضوئي في حد ذاته ، تلعب الدهون أيضا العديد من الأدوار المهمة في التنظيم الخلوي للمستقبلات الضوئية (تمت مراجعتها في3). يساعد فهم هذه الأدوار الوظيفية للدهون من خلال القدرة على اكتشاف مستوياتها في الجسم الحي وتحديدها. تقدم هذه المقالة نظرة عامة بالإضافة إلى بروتوكولات لاختيار وتنفيذ طرق قياس الدهون من ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية.

تاريخيا ، كان تحليل الدهون يتألف من التجزئة بواسطة الفئات الكيميائية متبوعا بتحليل الفئات الفردية. لتحديد الدهون وتحديدها بنجاح ، تم تطوير العديد من الطرق التحليلية التي تكون إما تحليلات دهون مستهدفة أو غير مستهدفة4،5،6،7،8،9،10. يركز التحليل المستهدف على الدهون المعروفة ويستخدم طريقة محددة ذات حساسية عالية للتحليل الكمي لهذه الدهون المحددة. يهدف تحليل الدهون غير المستهدف إلى اكتشاف العديد من أنواع الدهون في عينة في وقت واحد. تشمل هذه الطرق التحليلية كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) 4 ، وكروماتوغرافيا الغاز (GC) 5 ، والكروماتوغرافيا السائلة (LC) 6 ، وفحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) 7 ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) 8 ، ووضع العلامات على النويدات المشعة ، وقياس الطيف الكتلي (MS) 9،10. على الرغم من أن وضع العلامات المشعة هو طريقة حساسة للكشف عن الدهون ويمكن استخدامه في سياق الخلايا المستنبتة ، إلا أن استخدامه في تحليل الدهون في الكائنات الحية السليمة مثل ذبابة الفاكهة يمثل تحديا بسبب اعتبارات السلامة الخاصة بوضع العلامات الإشعاعية على الطائرة الحية. التحدي الآخر مع وضع العلامات المشعة هو أنه يعتمد على تسمية جميع تجمعات السلائف إلى شبه التوازن وقد يكون هذا صعبا في سياق النماذج في الجسم الحي .

يعد تحليل الدهون الشامل باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد تقدما حديثا أصبح ممكنا بفضل تطوير تقنيات التصلب العصبي المتعددالحديثة 11. يوفر تحليل الدهون القائم على MS العديد من المزايا ، بما في ذلك أحجام العينات الصغيرة ، وقابلية التطبيق على عينات من النماذج الحيوانية ، والحساسية العالية ، والخصوصية ، فضلا عن الإنتاجية العالية. على وجه الخصوص ، أدى الاستخدام المكثف لتأين الرش الكهربائي إلى تحسين أداء MS لتحليل الدهون. أضاف تحسين أجهزة تحليل الكتلة في مطياف الكتلة ، بما في ذلك الجمع بين أجهزة تحليل الكتلة المختلفة ، مزايا إضافية وأدى تطوير محلل كتلة عالي الدقة إلى إحياء دراسات الدهون11. يميز التحليل القائم على التصلب العصبي المتعدد جزيئات الدهون بطريقتين رئيسيتين: (1) الدهون من أعلى إلى أسفل حيث تهدف تجارب التصلب العصبي المتعدد إلى التوصيف الكمي السريع للتغيرات العالمية داخل القبة الدهنية والاعتماد فقط على كتل دقيقة من السلائف الدهنية السليمة12. (2) الدهون من أسفل إلى أعلى والتي تحدد الأنواع الجزيئية الفردية عن طريق الكشف عن أيونات الشظايا الهيكلية المميزة باستخدام ترادفي MS13،14.

بشكل عام ، يتكون تحليل الدهون في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية من خطوتين: أولا ، استخراج الدهون من أنسجة العين / الرأس وثانيا ، تحليل الدهون المستخرجة بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد. يمكن إجراء ذلك باستخدام إحدى الطرق التالية: فصل الدهون عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة (LC) المقترنة بمرض التصلب العصبي المتعدد أو بدون فصل كروماتوجرافي باستخدام دهون البندقية / التسريب المباشر MS (DIMS). يعتمد كلا نهجي التنميط الدهني على استخدام تأين الرش الكهربائي MS (ESI-MS) وقد أثبتوا أنهما حساسان وكميانوفعالان 10،15. في تحليل DIMS ، يعتمد تحديد الدهون على كتلة الأيونات السليفة ، وعمليات مسح الخسارة المحايدة ، والتوقيعات الخاصة بفئةالدهون 14،16،17،18. في حين أن هذا النهج يجمع بين سرعة التحليل والمتانة ، لا يمكن تجنب قمع الأيونات للدهون منخفضة الوفرة بسبب وجود وفرة عالية ودهون شديدة الاستقطاب في العينة. وبالتالي ، غالبا ما لا يتم اكتشاف الدهون المنخفضة الوفرة مثل الفوسفينوسيتيدات و PA أو يتم اكتشافها بشكل سيئ بواسطة منصات DIMS القياسية ، بسبب قمع الأيونات من بين أسباب أخرى19،20. يمكن أن يساعد فصل الكروماتوغرافيا السائلة قبل MS (LC-MS) في التغلب على قمع الأيونات بالإضافة إلى التركيز على تحليل فئات أو أنواع معينة من الدهون ذات الأهمية21.

في هذه المقالة ، يتم وصف الخطوات المتبعة في تحديد الدهون الرئيسية ذات الأهمية في ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية. في هذا الصدد ، تم تحسين ثلاثة مناهج مختلفة للتصلب العصبي المتعدد: (1) DIMS باستخدام مطياف كتلة عالي الدقة ، (2) كروماتوغرافيا سائل ما بعد الاشتقاق - MS (RPLC-MS) باستخدام مطياف كتلة رباعي ثلاثي ، و (3) الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور الطبيعي - مراقبة تفاعلات متعددة - المسح الأيوني المعزز للمنتج - MS (NPLC-MRM-EPI-MS) باستخدام مطياف كتلة رباعي ثلاثي مع وظيفة مسح أيوني محسنة للمنتج. يتم تحديد الاختيار بين هذه الأساليب من خلال أسئلة البحث المحددة قيد التحقيق. للحصول على وصف وتحليل عالمي لجميع أنواع الدهون الجليسروفوسفورية المشاركة في التنبيغ الضوئي ، يجب استخدام DIMS. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه في هذا النهج ، من غير المحتمل أن يتم اكتشاف الجليسيروفوسفوليبيدات منخفضة الاستقطاب ومنخفضة الوفرة مثل الفوسفوينوسيتيدات22. للكشف عن هذه الدهون منخفضة الوفرة ، يجب إجراء RPLC-MS بعد الاشتقاق. باستخدام هذا النهج ، نجحنا في اكتشاف وقياس حمض الفوسفاتيديك (PA) 23،24،25 ، فوسفاتيديلينوسيتول (PI) ، فوسفاتيديلينوسيتول 5 فوسفات (PI5P) 26 ، فوسفاتيديلينوسيتول 4 فوسفات (PI4P) ، و PI (4،5) P227. تقوم طرق DIMS وما بعد الاشتقاق RPLC-MS بإنشاء معلومات على مستوى فئة الدهون. على سبيل المثال ، باستخدام هاتين الطريقتين ، يمكن للمرء تحديد كمية PA (34: 2) التي يتوافق m / z مع الأنواع الجزيئية المتعددة بما في ذلك: (أنا) PA (16: 0 / 18: 2) ، (ii) PA (18: 2 / 16: 0) ، (iii) PA (16: 2 / 18: 0) ، (iv) PA (18: 0 / 16: 2) ، (v) PA (16: 1 / 18: 1) ، (vi) PA (18: 1 / 16: 1) ، (vii) PA (14: 2 / 20: 0) ، و (viii) PA (20: 0 / 14: 2). باستخدام هذه الطرق ، لا يمكن للمرء الحصول على معلومات حول تكوين سلسلة الأسيل الدهنية ل PA (34: 2) الموجودة في العينة. يمكن التغلب على هذا التحدي من خلال طريقة MS الهجينة التي تجمع بين فصل LC ومراقبة التفاعلات المتعددة (MRM) والمسح الأيوني المحسن للمنتج (EPI). هذه الطريقة حساسة وكمية على حد سواء وتسمح بما يلي: القياس المباشر ، أي دون أي وضع علامات مسبقة أو معالجة لاحقة للعينة ، وتؤسس الأنواع الجزيئية بمعلومات سلسلة الأسيل الدهنيةالدقيقة 25. باستخدام هذه الطريقة ، حددنا عددا كبيرا من الأنواع الجزيئية من PA وحددنا التركيب الدقيق لسلاسل الأسيل الدهنية في SN1 و SN2 من العمود الفقري للجلسرين. سيكون هذا النهج مفيدا عند تحليل وظيفة أنواع جزيئية معينة من أي فئة من الدهون في المستقبلات الضوئية. يمكن تكييف البروتوكولات التفصيلية المقدمة هنا لكل نوع من هذه الأنواع من التحليلات مع دهون الإشارات الأخرى ذات الصلة بوظيفة مستقبلات الضوء ذبابة الفاكهة (للمخططات انظر الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أن الطرق التفصيلية لتحليل الدهون لعدة فئات أخرى من الدهون (لم يتم تناولها في هذه المقالة) ، قد تم وصفها في مكان آخر. وتشمل هذه السيراميد28،29 ، والسفينجوليبيدات30،31 ، والدهون المحايدة مثل ثنائي الجليسريد والدهونالثلاثية 32،33 ، والستيرولات15،33. في بعض الحالات ، تم وصف طرق تحليل هذه الدهون لأنسجة يرقات ذبابة الفاكهة ويمكن تكييفها للاستخدام في المستقبلات الضوئية.

Protocol

1. تربية الذباب وتحضير المواد الكيميائية

  1. الذباب الخلفي (ذبابة الفاكهة السوداء) على طعام ذباب قياسي في حاضنة برطوبة نسبية 50٪ عند 25 درجة مئوية بدون إضاءة داخلية. قم بإعداد طعام الذباب بإضافة 80 جم / لتر من دقيق الذرة ، و 20 جم / لتر من D-glucose ، و 40 جم / لتر من السكروز ، و 8 جم / لتر من أجار ، و 15 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 4 مل من حمض البروبيونيك ، و 0.7 جم / لتر من TEGO (ميثيل بارا هيدروكسي بنزوات) ، و 0.6 مل من حمض الفوسفوريك كما هو موضح في34 وهي متوفرة أيضا في https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. قم بزراعة مجموعة واحدة من الذباب ، بعد الإغلاق ، في حاضنة مبردة يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية مع إضاءة مستمرة للضوء الأبيض ~ 2,000 لوكس.
  2. قم بإعداد مخزن شطف الفوسفوينوزيتيد (PEB) عن طريق إضافة الكلوروفورم: الميثانول: 2.4 م حمض الهيدروكلوريك بنسبة 250: 500: 200 (vol / vol / vol). قم بإعداد مخزن مؤقت للغسيل منخفض الطور (LPWS) بإضافة الميثانول: 1 M حمض الهيدروكلوريك: الكلوروفورم بنسبة 235: 245: 15 (vol / vol / vol). قم بإعداد محلول غسيل ما بعد الاشتقاق عن طريق إضافة الكلوروفورم: الميثانول: الماء بنسبة 8: 4: 3 (الحجم / الحجم / المجلد).
    ملاحظة: استخدم المذيبات والمواد الكيميائية من الدرجة MS. لا تقم بتخزين المخزن المؤقت PEB و LPWS لأكثر من 3 أشهر.
  3. استخدم عمود C4 (1.7 ميكرومتر × 1 مم × 100 مم) للفوسفوينوسيتيدات و PI4P و PI (4،5) P2 وعمود C18 (1.0 مم × 100 مم × 1.7 مم) ل PA و phosphatidylcholine (PC) و phosphatidylinositol (PI). بالنسبة لطريقة NPLC-MRM-EPI ، استخدم عمود السيليكا (1 مم × 150 مم × 3 ميكرومتر).
  4. قم بإعداد المادة المسيلة A بإضافة الهكسان: كحول الأيزوبروبيل: 100 ملي مولار أسيتات الأمونيوم المائي بنسبة 68:30: 2 (حجم / حجم / حجم) والشطف B بإضافة الهكسان: كحول الأيزوبروبيل: 100 ملي مولار أسيتات الأمونيوم المائي بنسبة 70:20:10 (حجم / حجم / حجم) لنسبة PA و PC و PI. تحضير المذيب A للفوسفوينوسيتيدات عن طريق إضافة 0.1٪ حمض الفورميك في الماء والمذيب B عن طريق إضافة 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل.

2. عزل الأنسجة

  1. اجمع 10 ذباب لكل عينة باستخدام تخدير ثاني أكسيد الكربون (CO2) (يشل الذباب في غضون ثوان) وقطع رأس الذباب باستخدام شفرة حادة علىلوحة تخدير ثاني أكسيد الكربون.
  2. اجمع الذباب الداكن أو الفاتح المتكيف مع العمر المحدد (12-24 ساعة) في أنابيب 1.5 مل وقم بالتجميد في النيتروجين السائل. تجفيف الذباب في الأسيتون عند -80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في قارورة زجاجية35. بالنسبة لأنسجة الشبكية ، اجمع 100 شبكية العين من الذباب المجفف بالتجميد. باستخدام مشرط ، قم بإزالة العينين من باقي الرأس واستخرج شبكية العين.
  3. بالنسبة لتحليل الفوسفينوزيتيدات PI4P و PI (4،5) P2 ، عند العمل مع شبكية العين الطازجة ، استخدم 25 شبكية العين لكل عينة من الذباب المزروع في ظل ظروف الإضاءة المناسبة لقياس مستويات الدهون أثناء الإضاءة ومن الذباب المزروع بدون ضوء لقياس مستويات الدهون في الظلام. يخزن في 50 ميكرولتر من 1x PBS في أنابيب الخالط على الثلج الجاف حتى يصبح جاهزا للاستخراج.

3. استخراج الدهون

تنبيه: الكلوروفورم مذيب سام ومسرطن بطبيعته. يؤثر على الجهاز التناسلي وهو مهيج للجلد والعين. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة في التعامل مع هذه المادة الكيميائية. يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على الكلوروفورم في غطاء كيميائي جيد التهوية.

  1. لجميع الجليسيروفوسفوليبيدات بخلاف PI4P و PI (4،5) P2
    1. لكل عينة ، قم بتجانس 10 رؤوس ذبابة أو 100 شبكية العين (تم جمعها كما هو موضح في الخطوة 2.2) في 0.1 مل من 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك المثلج و30 ميكرولتر من الخليط القياسي الداخلي (PA (17: 0 / 14: 1) ، PC (17: 0 / 14: 1) ، حمض الليزوفوسفاتيديك (LPA ؛ 13: 0) ، ليزوفوسفاتيديل كولين (LPC ؛ 13: 0) ، LPC (17: 1) ، PA (17: 0 / 17: 0) ، PA (16: 0-D31 / 18: 1) ، LPA (17: 1) ، LPC (19: 0) ، PI (12: 0 / 13: 0) ، PA (12:0/13:0)، والكمبيوتر الشخصي (12:0/13:0)). قم بإعداد المعايير بحيث تقع الكمية النهائية لأي معيار دهني ضمن منحنى الاستجابة الخطية لمطياف الكتلة.
    2. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الآلي الذي يسمح بالمعالجة السريعة والمتزامنة لجميع العينات. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي منضدي وتأكد من عدم تكوين الحبيبات - وهذا يشير إلى التجانس الكامل. انقل تجانس الميثانول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مغطى بسعة 2 مل.
    3. أضف 0.2 مل من حمض الهيدروكلوريك المثلج 0.1 نيوتن لاستعادة أي مادة متبقية في الأنبوب واخلطها في أنبوب 2 مل. أضف 0.1 مل من 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك المثلج متبوعا ب 0.8 مل من الكلوروفورم واخلطه جيدا. اترك الخليط ، الذي يحتوي على تجانس الأنسجة ، يقف على الجليد لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 0.4 مل من 0.88٪ KCl والدوامة لمدة 30 ثانية.
    4. الطرد المركزي الخليط عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل المرحلتين المائية والعضوية. أخرج المرحلة العضوية السفلية التي تحتوي على الدهون بعناية فائقة دون الاختلاط بالمرحلة المائية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 مل.
      ملاحظة: أثناء استخراج الدهون ، انقل المرحلة العضوية السفلية بعناية فائقة لتجنب الاختلاط بالمرحلة المائية ، مما قد يعيق تحليل الدهون في اتجاه مجرى النهر.
    5. جفف هذا المحلول الدهني في مبخر مفرغ عند 4 درجات مئوية ، وافحص العينة بصريا لضمان التجفيف الكامل. يعاد تعليقه في 420 ميكرولتر من خليط الميثانول 2: 1: الكلوروفورم للتحليل. قم بتحليل العينات على الفور دون تخزين.
  2. بالنسبة للفوسفوينوسيتيدات PI4P و PI (4،5) P2
    1. تجانس 25 شبكية العين في 950 ميكرولتر من محلول شطف الفوسفوينوزيتيد (PEB ؛ 250 مل من CHCl3 ، 500 مل من الميثانول و 200 مل من 2.4 M HCl) وإضافة معايير داخلية (phosphatidylethanolamine (PE) 17: 0 / 14: 1 ؛ PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); و PI (4،5) P2 (16: 0 / 16: 0)) خليط يحتوي على 50 نانوغرام من PI ، 25 نانوغرام من PI4P ، 50 نانوغرام من PI (4،5) P2 ، و 0.2 نانوغرام من PE لكل عينة.
    2. أضف 250 ميكرولتر لكل من الكلوروفورم و 2.4 م حمض الهيدروكلوريك ، متبوعا بالصوتنة لمدة دقيقتين والطرد المركزي عند 1،000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل الطور. أخرج المرحلة العضوية السفلية في أنبوب جديد ، واغسلها ب 900 ميكرولتر من LPWS وأجهزة الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. استخرج الدهون من المرحلة المائية المتبقية عن طريق إجراء فصل الطور مرة أخرى كما في الخطوة 3.2.2. قم بتجفيف المراحل العضوية المجمعة في جهاز طرد مركزي مفرغ عند 4 درجات مئوية ، وفحص العينات بصريا لضمان التجفيف الكامل.

4. فحص الفوسفات العضوي

  1. اصنع محلول مخزون 7.34 ملي مولار KH2PO4. قم بعمل التخفيفات القياسية ، باستخدام الماء المقطر ، في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا للجدول 1. قم بتدوير الأنابيب برفق ونقل التخفيفات القياسية إلى أنابيب زجاجية خالية من الفوسفات.
  2. قم بإعداد مجموعة منفصلة من الأنابيب الزجاجية التي تحتوي على عينات الدهون. قم بتحسين حجم عينات الدهون بحيث يقع الامتصاص عند 630 نانومتر (بعد الانتهاء من هذا البروتوكول) ضمن نطاق معيار KH2PO4 (وهو من 0 إلى 20x).
  3. قم بتسخين الأنابيب الزجاجية التي تحتوي على تخفيفات قياسية عند 120 درجة مئوية لإكمال الجفاف. قم بتسخين الأنابيب الزجاجية التي تحتوي على عينات الدهون (خذ 1/8من إجمالي حجم العينة المطلوب للحصول على امتصاص في نطاق KH2PO4 القياسي) عند 90 درجة مئوية لإكمال الجفاف.
  4. أضف 50 ميكرولتر من حمض البيركلوريك بنسبة 70٪ إلى جميع الأنابيب وقم بتسخينها عند 180 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتبريد الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 250 ميكرولتر من الماء و 50 ميكرولتر من 2.5٪ موليبدات الأمونيوم و 50 ميكرولتر من حمض الأسكوربيك 10٪ لكل أنبوب.
    ملاحظة: 2.5٪ موليبدات الأمونيوم و 10٪ حمض الأسكوربيك هي تركيزات الوزن / الحجم. يجب أن تكون طازجة ويمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  5. احتفظ بالأنابيب في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اقتبس 130 ميكرولتر من العينة في صفيحة ذات 96 بئرا وقياس الامتصاص عند 630 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

5. الاشتقاق

تنبيه: تم الإبلاغ عن أن ثلاثي ميثيل سيليل ديازوميثان (TMSD) له العديد من التأثيرات السمية على البشر. يستهدف TMSD في المحلول الكلى والكبد والجهاز الهضمي وعضلات الهيكل العظمي والجهاز العصبي المركزي والجهاز التنفسي والتناسلي. يجب اتخاذ أقصى درجات الحيطة أثناء التعامل مع هذه المادة الكيميائية. يجب إجراء العملية برمتها في غطاء كيميائي جيد التهوية.

  1. إلى المرحلة العضوية السفلية للعينات التي تم الحصول عليها من نهاية الخطوة 3.2.3.، أضف 50 ميكرولتر من 2 M TMSD. اسمح للتفاعل بالاستمرار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع اهتزاز مستمر عند 250 دورة في الدقيقة. بعد 10 دقائق ، أضف 10 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي لإخماد التفاعل ، والذي يشار إليه باختفاء اللون الأصفر في المحلول.
  2. اضغط على الأنابيب وافتحها بحذر لإزالة N2 المتشكل في تفاعل التبريد. بعد هروب غاز N2 ، أغلق الأنابيب وقم بتدويرها. ثم أضف 600 ميكرولتر من محلول الغسيل بعد الاشتقاق والدوامة لمدة دقيقتين في الخلاط عند 250 دورة في الدقيقة.
  3. تخلص من ~ 400 ميكرولتر من المرحلة العليا التي ستتشكل. كرر الخطوة 5.2. تخلص من المرحلة العلوية بأكملها وأضف 50 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 90٪ إلى المرحلة السفلية واخلطها.
  4. جفف العينات لمدة 2 ساعة في مكثف الطرد المركزي عند 800 × جم يعمل في الفراغ. بعد التجفيف ، يجب أن تحتوي الأنابيب على ~ 20 ميكرولتر من العينة المتبقية. أضف 180 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ ، واخلطه جيدا ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2-3 أيام قبل LC-MS / MS.

6. الحصول على البيانات وتحليلها

  1. الحصول على البيانات في التسريب المباشر للتصلب العصبي المتعدد (DIMS)
    ملاحظة: يمكن إجراء مرض التصلب العصبي المتعدد إما عن طريق التسريب المباشر أو طريقة الكروماتوغرافيا السائلة MS (LC-MS). في هذا القسم ، نصف مرض التصلب العصبي المتعدد القائم على التسريب المباشر.
    1. قبل البدء في التجربة ، قم بمعايرة مطياف الكتلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. قم بإنشاء منحنى استجابة خطي لسلسلة التخفيف من المعايير التركيبية وبناء على الاستجابة الخطية للأداة ، قم بتخفيف العينة بحيث تقع شدة التحليل الدهني ضمن خطية الأداة. تمييع مستخلصات الدهون الكلية أو معايير الدهون بمزيج من الميثانول 2: 1: الكلوروفورم (vol / vol). حدد تخفيف إجمالي مستخلصات الدهون والمعايير الاصطناعية بشكل فردي لكل تجربة.
    3. نقل المستخلصات والمعايير إلى قوارير فردية. تجنب فقاعات الهواء أثناء نقل العينات إلى قوارير عينة من MS. ستخلق فقاعات الهواء ضغطا عاليا في العمود وتعيق تحليل الدهون.
    4. قبل التحليل ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 9 دقائق عند 6,440 × جم وقم بتحميلها في صفيحة مكونة من 96 بئرا وختمها بورق الألمنيوم.
    5. إجراء تحليلات التصلب العصبي المتعدد على مطياف كتلة عالي الدقة باستخدام طريقة التسريب المباشر. تحقيق تأين مستقر قائم على ESI للجلسيروفوسفوليبيدات باستخدام مصدر أيون التدفق النانوي الآلي باستخدام رقائق مع فوهات رش قطرها 4.1 ميكرومتر.
    6. التحكم في مصدر الأيونات باستخدام برنامج مطياف الكتلة المخصص وضبط جهد التأين عند +1.2 كيلو فولت و -1 كيلو فولت في الوضعين الموجب والسالب ، على التوالي ؛ الضغط الخلفي عند 1 رطل لكل بوصة مربعة في كلا الوضعين ؛ ودرجة حرارة الشعيرات الدموية لنقل الأيونات عند 180 درجة مئوية. قم بإجراء الاستحواذ بدقة الكتلة ، R m / z400 = 100,000. انظر الشكل 2 أ للاطلاع على واجهة البرنامج لإعداد معلمات مطياف الكتلة.
    7. أعد إذابة مستخلصات الدهون المجففة في 400 ميكرولتر من الكلوروفورم: الميثانول (1: 2). للتحليل ، قم بتحميل 60 ميكرولتر من العينات على مصدر أيون للوحة 96 جيدا وختمها بورق الألمنيوم. قم بتحليل كل عينة لمدة 20 دقيقة في وضع الأيونات الإيجابية للكشف عن الكمبيوتر الشخصي ، والفوسفاتيديل سيرين (PS) ، والفوسفاتيديل إيلانولامين (PE) ، PE-O (المرتبط بالأثير ، والفوسفاتيدي ، والسيراميد (Cer) ، وفوسفات السيراميد (Cer-P).
    8. قم بإجراء عملية استحواذ مستقلة في وضع الأيونات السالبة لمدة 20 دقيقة حيث تم اكتشاف PA و PI. انظر الشكل 2 ب للحصول على تفاصيل محددة لإعداد الأداة للحصول على البيانات ل MS عالية الدقة وقائمة مستهدفة بأنواع PA التي تم تضمينها في إعداد الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA).
      ملاحظة: تظهر واجهة البرنامج لإعداد طريقة DDA في الشكل 2C. قائمة جزيئات PA المستهدفة في هذا النهج مدرجة في الجدول 2. تظهر لقطة شاشة للنتيجة التجريبية في نهج DDA في الشكل 2D.
  2. تحليل البيانات في التسريب المباشر للتصلب العصبي المتعدد (DIMS)
    ملاحظة: يتطلب تحليل بيانات الكتلة الناتجة عن جميع أنواع مطياف الكتلة نظاما أساسيا آليا لتحليل الدهون. LipidXplorer36 هو برنامج غير تجاري يدعم جميع أنواع تجارب الدهون DIMS. يمكن العثور على هذا البرنامج هنا: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. بمجرد الحصول على البيانات باستخدام الطرق الموضحة في الخطوة 6.1 ، حدد أنواع الدهون باستخدام منصة تحليل الدهون عن طريق مطابقة m / z من قممها أحادية النظير مع قيود تكوين العناصر المقابلة. يظهر مثال استيراد البيانات في الشكل 3 أ. اضبط تحمل الكتلة على 10 جزء في المليون وعتبة الشدة وفقا لمستوى الضوضاء الذي أبلغ عنه برنامج مطياف الكتلة.
    2. بعد الاستيراد ، قم بتجميع استعلامات لغة استعلام التجزئة الجزيئية (MFQL) ل PA بناء على التركيب الكيميائي ل PA ، وهو ما هو موضح في الشكل 3 ب. انظر الشكل 3C للحصول على MFQL الذي تم إعداده في منصة تحليل الدهون.
    3. باستخدام نهج مماثل ، قم بتجميع MFQL لدهون الجلسيروفوسفوليبيدات الأخرى في برنامج منصة تحليل الدهون. يستهدف كل استعلام فئة دهنية واحدة ويمكن استخدام العديد من الاستعلامات في تنفيذ واحد.
    4. قم بتشغيل جميع MFQLs بالنقر فوق الزر "تشغيل ". يتم الإبلاغ عن جميع أنواع الدهون المحددة في ملف نتائج واحد بتنسيق ملف .csv مع وفرة السلائف و / أو أيونات الشظايا المقابلة للقياس الكمي اللاحق للدهون. ويرد مثال على النواتج في الجدول 3.

7. الكروماتوغرافيا السائلة ومرض التصلب العصبي المتعدد الترادفي للعينات المشتقة

  1. افصل العينات التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.4 بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء. أثناء اختيار هذا النظام ، تأكد من أن برنامجه يمكن أن يتكامل مع مطياف الكتلة المستخدم في التحليل.
  2. قم بتوصيل النظام بمطياف كتلة رباعي الأقطاب ثلاثي. اختر عمود فصل. لفصل الدهون بخلاف PI4P و PI (4،5) P2 ، اختر عمود C18 (1.0 مم × 100 مم × 1.7 مم). بالنسبة إلى PI4P و PI (4,5) P2 ، اختر عمود C4 بأبعاد 300 Å (1.0 مم × 100 مم × 1.7 ميكرومتر).
  3. قم بإعداد المرحلة المتنقلة التي تحتوي على فورمات الأمونيوم عن طريق إذابة فورمات الأمونيوم في ماء بدرجة المواصفات الكتلية أولا ، ثم في المذيبات العضوية. قم بتصنيع جميع المذيبات المستخدمة في قياس الطيف الكتلي لمدة 20 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
  4. قم بموازنة العمود عن طريق غرس المحلول A الذي يحتوي على الماء + 0.1٪ حمض الفورميك والمحلول B الذي يحتوي على الأسيتونيتريل + 0.1٪ حمض الفورميك.
  5. حقن المصف من نظام الكروماتوغرافيا السائلة (حجم الحقن في حدود 1-20 ميكرولتر) في مطياف الكتلة للتحليل. اضبط معدل التدفق على 0.1 مل / دقيقة ودرجة حرارة العمود في درجة حرارة الغرفة. قم بحقن حجم الفلوت بالكامل الخارج من العمود في مطياف الكتلة.
  6. في تسلسل حقن العينة ، ابدأ دائما بحقن مذيب فارغ (الميثانول) واحتفظ بالعينات القياسية الأنيقة بشكل متقطع بين العينات البيولوجية لإجراء فحوصات مراقبة الجودة لقياس الطيف الكتلي (كل جولة سادسة).
  7. بالنسبة للإعداد التجريبي لمقياس مطياف الكتلة ثلاثي الأقطاب رباعي الأقطاب الهجين ، قبل بدء التجربة ، قم بمعايرة مطياف الكتلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة إلى PA و PC و PI ، استخدم تأين الرش الكهربائي (ESI) لتوليد الأيونات والعمل في الوضع الموجب للكشف عن أنواع الدهون الموجبة الشحنة. الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام برنامج تحليل البيانات المثبت مع النظام.
  8. تحسين معلمات التحليل وفقا للمعيار الداخلي المقابل المستخدم. معلمات مطياف الكتلة هي كما يلي: وقت السكون = 30 مللي ثانية. CAD (تفكك تنشيط الاصطدام) = 3 رطل لكل بوصة مربعة ؛ GS1 (غاز المصدر 1) = 24 رطل لكل بوصة مربعة و GS2 (غاز المصدر 2) = 21 رطل لكل بوصة مربعة ؛ CUR (غاز الستارة) = 30 رطل لكل بوصة مربعة ؛ IS (جهد ESI) = 4.5 كيلو فولت ؛ و TEM (درجة حرارة المصدر) = 450 درجة مئوية.
  9. بالنسبة إلى PI4P و PI (4،5) P2 ، استخدم مطياف الكتلة في الوضع الموجب. معلمات مطياف الكتلة هي كما يلي: وقت السكون = 65 مللي ثانية. CAD (التفكك المنشط عن طريق الاصطدام) = 2 رطل لكل بوصة مربعة ؛ GS1 (غاز المصدر 1) و GS2 (غاز المصدر 2) = 20 رطل لكل بوصة مربعة ؛ CUR (غاز الستارة) = 37 رطل لكل بوصة مربعة ؛ IS (جهد ESI) = 5.2 كيلو فولت ؛ و TEM (درجة حرارة المصدر) = 350 درجة مئوية.

8. الكروماتوغرافيا السائلة ذات المرحلة العادية - مراقبة التفاعل المتعدد - المسح الضوئي الأيوني المعزز للمنتج MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. الظروف الكروماتوغرافية
    1. استخدم طريقة LC للمرحلة العادية باستخدام عمود السيليكا ، القادر على فصل PA عن الدهون الفوسفورية الأخرى. استخدم الهكسان: كحول الأيزوبروبيل: 100 ملي مولار NH4COOH المائي بنسبة 68:30:2 كمرحلة متنقلة أ وكحول الأيزوبروبيل: الهكسان: 100 ملي مولار NH4COOH المائي بنسبة 70:20:10 كمرحلة ب متنقلة.
      ملاحظة: قدم هذا المزيج أفضل فصل وذروة انتقائية للأنواع الجزيئية المختلفة من PA.
    2. استخدم السلوك الكروماتوغرافي للمركبات المرجعية (المعايير الداخلية) ، من حيث الدقة وشكل الذروة ، لاختيار الظروف المثلى.
    3. قم بإجراء فصل كروماتوغرافي على عمود سيليكا ذو طور عادي (1 مم × 150 مم × 3 ميكرومتر) في درجة حرارة الغرفة على عمود كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء. اضبط حجم حقن جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي على 6 ميكرولتر ومعدل تدفق الشطف على 210 ميكرولتر / دقيقة.
    4. بعد 5 دقائق من التوازن مع 100٪ من المرحلة المتنقلة A ، قم بزيادة المرحلة المتنقلة B خطيا إلى 30٪ خلال 5 دقائق ، ثم إلى 80٪ خلال 5 دقائق ، ثم إلى 100٪ خلال 5 دقائق ، واحتفظ بها ثابتة عند 100٪ لمدة 5 دقائق. أخيرا ، أعد موازنة العمود لمدة 9 دقائق.
  2. قياس الطيف الكتلي
    1. استخدم مطياف كتلة مصيدة أيونية ثلاثي الأقطاب هجين يعمل في وضع ESI السالب. التحكم في تشغيل النظام والحصول على البيانات باستخدام برنامج التحليل المقدم. قبل البدء في التجربة ، قم بمعايرة مطياف الكتلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. تحسين معلمات المصدر باستخدام تحليل حقن التدفق للخليط القياسي الداخلي. وفقا لذلك ، اضبط جهد الرش الأيوني = -4.5 كيلو فولت ، درجة حرارة المصدر (TEM) = 450 درجة مئوية ، غاز التفكك المنشط بالتصادم (CAD) = 3 رطل لكل بوصة مربعة. استخدم غاز النيتروجين كغاز تصادم واضبط غاز البخاخات (GS1) = 24 رطل لكل بوصة مربعة ، والغاز الإضافي (GS2) = 21 رطل لكل بوصة مربعة ، وغاز الستارة (CUR) = 30 رطل لكل بوصة مربعة.
    3. قم بتعيين معلمات مسار الأيونات المعتمدة على المركب على أنها جهد تفكيك التجميع (DP) = -42 فولت ، وإمكانات المدخل (EP) = -6 فولت ، وإمكانية خروج خلية التصادم (CXP) = -12 فولت ، محسنة باستخدام التسريب المستمر لمحلول الخليط القياسي الداخلي. سجل أطياف المنتج الكاملة جنبا إلى جنب مع مقدمة لتحولات MRM للمنتج بطاقة تصادم متفاوتة (CE) بدءا من 12 فولت إلى 40 فولت لتحليل التجزئة باستخدام وظيفة مسح EPI المتوفرة في مطياف الكتلة.
      ملاحظة: يسجل مؤشر التحصين المتكامل المستند إلى IDA الذي تم تشغيله في وقت واحد منتج أيونات، والمسح الأيوني والحصول على MS/MS أثناء التنقل. قام MRM بتضييق نطاق المسح الأيوني في رباعي الأقطاب 1 (Q1) وعزز مصيدة الأيونات شظايا الأيونات التي تمر عبر Q2 وبالتالي تحسين القدرة النوعية ل MS / MS رباعي الأقطاب بشكل كبير ، خاصة لالتقاط جميع الشظايا الناشئة عن أيون السلائف. في أسلوب EPI ، يتم الكشف عن أيونات شظايا متعددة ناشئة عن أيونات السلائف في Q3 مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل.
    4. قم بإجراء تجارب MRM مع CE 39 فولت لاكتساب حساسية عالية. حدد الحد الأقصى لعدد MRM إلى 75 ووقت السكون إلى 30 مللي ثانية لاكتشاف وتسجيل MRM لأي جزيء معين يتدفق من العمود الكروماتوغرافي في أي وقت أثناء التشغيل. هذا يزيد من دورة عمل الماكينة.
    5. قم بإجراء ضبط تجريبي لتحديد أفضل معلمات التأين ل PA ، كما هو موضح أعلاه. في هذه التجربة ، اضبط جهد الرش الأيوني = -4.5 كيلو فولت ، درجة حرارة المصدر (TEM) = 450 درجة مئوية ، غاز التفكك المنشط بالتصادم (CAD) = 3 رطل لكل بوصة مربعة. استخدم غاز النيتروجين كغاز تصادم. اضبط غاز البخاخات (GS1) = 24 رطل لكل بوصة مربعة ، والغاز الإضافي (GS2) = 21 رطل لكل بوصة مربعة ، وغاز الستارة (CUR) = 30 رطل لكل بوصة مربعة.
    6. افحص جميع بيانات الضبط يدويا لضمان الاختيار الصحيح لمعلمات التأين وأيونات المنتجات. ضع في اعتبارك تقليل التداخل المحتمل بين قنوات MRM عند اختيار أيون المنتج. يتم عرض المعلمات التجريبية المستخدمة لتحليل جميع الأنواع الجزيئية PA في الجدول 4.
      ملاحظة: يسمح لنا مطياف كتلة مصيدة الأيونات الخطية ثلاثية الأقطاب الهجين بدمج وضع مسح MRM مع وظيفة مسح مصيدة الأيونات ، وبالتالي ، يتيح المسح السريع والعالي من خلال استخدام طرق مثل مسح EPI لتسجيل أطياف كتلة ترادفية مفيدة لكل سلائف تم اكتشافها. في هذه الدراسة ، لتحديد الأنواع الجزيئية المتميزة من PA ، استغلنا نهج MS / MS القائم على MRM-EPI بناء على مسار الأيون الرباعي الأقطاب التقليدي مع خاصية مسح EPI للمصيدة الأيونية ، التي يتحكم فيها برنامج التحليل.

النتائج

تحديد خطية القياس في مرض التصلب العصبي المتعدد. الخطية هي قدرة طريقة MS على تقديم نتائج تتناسب طرديا مع تركيز المادة التحليلية للدهون. تعتمد الخطية على (أ) كفاءة التأين لتحليل الدهون و (ب) يعتمد سلوك التأين لتحليل الدهون بتركيزات مختلفة على مصدر الأيونات المستخدم...

Discussion

يتقارب عدد من خطوط الأدلة على أدوار متعددة لإشارات الدهون في تنظيم تنظيم ووظيفة ذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى الدور المدروس جيدا للدهون في تنظيم التنبيغ الضوئي3 ، فقد تورطت دهون الإشارات أيضا في تهريب البروتين والتنظيم الخلوي

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة من قبل إدارة الطاقة الذرية ، حكومة الهند (رقم تعريف المشروع. RTI 4006) ، وإدارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند (BT / PR4833 / MED / 30/744/2012) وزمالة التحالف الهندي العليا (IA / S/14/2/501540) إلى العلاقات العامة. نشكر مرفق قياس الطيف الكتلي NCBS ، وخاصة الدكتور دانانجاي شيندي وأعضاء مختبر العلاقات العامة على مساهماتهم في تطوير هذه الأساليب.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 N methanolic HCLFor total lipid isolation
0.88% KClSigma AldrichP9541For total lipid isolation
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tubesEppendorf,022431081/022431102For total lipid isolation
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polar lipids999974Lipid Internal Standard
37% pure HClSigma Aldrich320331For total lipid isolation
96-well plateTotal Organic Phosphate assay
AcetoneFisher Scientific32005For dissections
Ammonium molybdateTotal Organic Phosphate assay
Ascorbic AcidTotal Organic Phosphate assay
Bath sonicator
BEH300 C18 column [1.0 mm x 100mm x 1.7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Blade holderFine Scientific Tools10052-11For dissections
BOD incubatorTotal Organic Phosphate assay
Breakable bladesFine Scientific tools10050-00For dissections
Butter paperGE healthcare10347671For dissections
C4, 300 A0, [1.7 μm x1 mm x 100 mm] columnWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Chromatography amber color glass vials with insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polar lipids860517Lipid Internal Standard
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polar lipids850172Lipid Internal Standard
Dissecting microscopesOlympusSZ51For dissections
Dry heat bath.
Eluent AHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (68:30:2) , for LC
Eluent BHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (70:20:10), for LC
Filter paperIndica-HM274039For dissections
FlasksBorosilFor dissections
FliesNANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab kitchen, composition: corn flour 80 g/L, D-glucose 20 g/L, sucrose 40 g/L, agar 8 g/L, yeast extract 15 g/L, propionic acid 4 mL, TEGO (methyl para hydroxybenzoate) 0.7 g/L, orthophosphoric acid 0.6 mL)
ForcepsFine Scientific Tools11254-20For dissections
Fume hood
FunnelBorosilFor dissections
Glacial acetic acidFisher ScientificA35-500For derivatization
Glass bottles: transparent and amber colorFor total lipid isolation
High-temperature-resistant phosphate-free glass tubes.Total Organic Phosphate assay
Homogenization tubes with zirconium oxide beadsFor total lipid isolation
Homogenizer instrumentPrecellys
Humidified CO2 connected to fly padsFor fly pushing
Illumination controlled incubatorsPanasonic SanyoMIR-553For fly rearing
Initial organic mixturemethanol:chloroform (2:1), For total lipid isolation
LC-MS grade ChloroformSigma Aldrich650498For total lipid isolation
LC-MS grade MethanolSigma Aldrich34860For total lipid isolation
LC-MS grade waterSigma Aldrich34877For total lipid isolation
Light meterHTC instrumentsLX-103
Low retention tipsEppendorf0030072006/72014/72022/72030For total lipid isolation
LTQ Orbitrap XL instrumentThermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
Lysophosphatidic acid (LPA)- 13:0Avanti polar lipidsLM-1700Lipid Internal Standard
Lysophosphatidic acid (LPA)- 17:1Avanti polar lipidsLM 1701Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -13:0Avanti polar lipidsLM-1600Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -17:1Avanti polar lipids855677Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC)- 19:0Avanti polar lipids855776Lipid Internal Standard
Perchloric acid.Total Organic Phosphate assay
Phosphate standard potassium dihydrogen phosphateTotal Organic Phosphate assay
Phosphate-buffered saline (PBS)NANAComposition: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Phosphatidic acid (PA)- 12:0/13:0Avanti polar lipids, LM-1400 Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1404Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-(17:0/17:0)Avanti polar lipids830856Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-16:0-D31/18:1Avanti polar lipids860453Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC) -12:0/13:0Avanti polar lipidsLM-1000Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1004Lipid Internal Standard
Phosphatidylethanolamine (PE) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-110Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol (PI) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1504Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1904Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1901Lipid Internal Standard
Robotic nanoflow ion sourceTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
Silicone padsFor dissections
solvent A0.1% formic acid in water, for LC
solvent B0.1% formic acid in acetonitrile, for LC
Table-top centrifuge
Thermo-mixer
TMS-diazomethaneAcrosAC385330050For derivatization
Triple quadrupole mass spectrometerAB SciexQTRAP 6500
UPLC systemWaters Acquity
Vacuum centrifugal concentratorScanvac , Labogene
Vortex machine

References

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157 (2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515 (2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756 (2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851 (2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

4 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved