JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב היד מציג פרוטוקולי ספקטרומטריית מסה מגוונים, חזקים ורגישים לזיהוי וכימות מספר סוגים של ליפידים מקולטני האור של דרוזופילה .

Abstract

הפעלת פוספוליפאז Cβ (PLCβ) היא שלב חיוני במהלך התמרה חושית בקולטני אור דרוזופילה . פעילות PLCβ מביאה להידרוליזה של שומן הממברנה פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט [PI(4,5)P2] המובילה בסופו של דבר להפעלת תעלות פוטנציאל קולטן חולף (TRP) ותעלות דמויות TRP (TRPL). הפעילות של PLCβ מובילה לאחר מכן גם ליצירת מיני ליפידים רבים, שחלקם הוצעו כממלאים תפקיד בהפעלת TRP ו-TRPL. בנוסף, הוצעו מספר סוגים של ליפידים כדי למלא תפקידי מפתח בארגון הביולוגיה התאית של קולטני אור כדי לייעל את תגובות האיתות להעברה חושית אופטימלית. מבחינה היסטורית, תגליות אלה הונעו על ידי היכולת לבודד מוטציות של דרוזופילה עבור אנזימים השולטים ברמות של שומנים ספציפיים ולבצע ניתוח של פיזיולוגיה של קולטני אור במוטציות אלה. לאחרונה פותחו שיטות ספקטרומטריית מסה חזקות לבידוד וניתוח כמותי של שומנים בעלי רגישות וספציפיות גבוהות. אלה מתאימים במיוחד לשימוש בדרוזופילה שבה ניתוח שומנים אפשרי כעת מקולטני אור ללא צורך בתיוג רדיונוקלידים. במאמר זה מכוסים השיקולים המושגיים והמעשיים בשימוש בספקטרומטריית מסה ליפידים להערכה כמותית חזקה, רגישה ומדויקת של שומני איתות שונים בקולטני האור של דרוזופילה . יחד עם השיטות הקיימות בגנטיקה מולקולרית וניתוח פיזיולוגי, שומנים כאלה עשויים לשפר את כוחם של קולטני האור כמערכת מודל לתגליות בביולוגיה.

Introduction

פוטוטרנסדוקציה בדרוזופילה מתווכת על ידי מפל PLCβ מצומד לחלבון G המוביל להפעלת התעלות המופעלות באור TRP ו-TRPL1. PLCβ מבצע הידרוליזה של הפוספוליפיד הקשור לממברנה, פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט [PI(4,5)P2] ומייצר דיאצילגליצרול (DAG), ואינוזיטול 1,4,5 טריפוספט (IP3). לאחר מכן DAG עובר זרחן על ידי DAG-קינאז ליצירת חומצה פוספטית (PA). לאחר מכן, באמצעות סדרה של תגובות הכוללות יצירת חומרי ביניים של שומנים, PI(4,5)P2 מתחדש2. למספר מרכיבים של מחזור PI(4,5)P2 זה יש פונקציות בקולטני האור של דרוזופילה . המנגנון שבאמצעותו הפעלת PLC מובילה לשער ערוץ TRP ו-TRPL נותר לא פתור. עם זאת, מספר קווי ראיות מצביעים על כך שחומרי ביניים ליפידים הנוצרים על ידי הידרוליזה PI(4,5)P2 עשויים לתווך תהליך זה3. לפיכך, חשוב מאוד לזהות ולכמת את תוצרי הביניים השומניים הללו כדי לשפוך אור על מנגנון ההפעלה של TRP ו-TRPL בפוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה . בנוסף לתפקידם בפוטו-טרנסדוקציה כשלעצמה, ליפידים ממלאים גם כמה תפקידים חשובים בארגון התאי של קולטני אור (נסקרב-3). הבנת התפקידים הפונקציונליים הללו של שומנים נעזרת ביכולת לזהות ולכמת את רמותיהם in vivo. מאמר זה מספק סקירה כללית וכן פרוטוקולים לבחירה ויישום של שיטות לכימות שומנים מקולטני אור דרוזופילה .

מבחינה היסטורית, ניתוח שומנים כלל פיצול לפי מחלקות כימיות ואחריו ניתוח של מחלקות בודדות. כדי לזהות ולכמת בהצלחה שומנים, פותחו שיטות אנליטיות רבות שהן ניתוחי שומנים ממוקדים או לא ממוקדים 4,5,6,7,8,9,10. הניתוח הממוקד מתמקד בשומנים ידועים ומשתמש בשיטה ספציפית עם רגישות גבוהה לניתוח כמותי של ליפידים ספציפיים אלה. ניתוח שומנים לא ממוקד נועד לזהות מיני שומנים רבים בדגימה בו זמנית. שיטות אנליטיות אלו כוללות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC)4, כרומטוגרפיה של גז (GC)5, כרומטוגרפיה נוזלית (LC)6, מבחני אימונוסורבנט מקושרים לאנזים (ELISA)7, תהודה מגנטית גרעינית (NMR)8, תיוג רדיונוקלידים וספקטרומטריית מסה (MS)9,10. למרות שתיוג רדיואקטיבי הוא שיטה רגישה לזיהוי שומנים וניתן להשתמש בה בהקשר של תאים מתורבתים, השימוש בו בניתוח שומנים באורגניזמים שלמים כמו דרוזופילה מאתגר בשל שיקולי בטיחות של תיוג רדיו של בעלי חיים מעופפים. האתגר הנוסף עם תיוג רדיואקטיבי הוא שהוא תלוי בתיוג כל מאגרי הפרקורסורים לכמעט שיווי משקל וזה יכול להיות קשה בהקשר של מודלים in vivo.

ניתוח מקיף של שומנים באמצעות טרשת נפוצה הוא התקדמות עדכנית שהתאפשרה הודות לפיתוח טכנולוגיות מודרניות של טרשת נפוצה11. ניתוח מבוסס MS של שומנים מציע מספר יתרונות, אלה כוללים גדלי מדגם קטנים, ישימות לדגימות ממודלים של בעלי חיים, רגישות גבוהה, ספציפיות כמו גם תפוקה גבוהה. בפרט, השימוש הנרחב ביינון אלקטרו-ספריי הוביל לשיפור בביצועים של MS לניתוח שומנים. השיפור של מנתחי מסה בספקטרומטרי מסה, כולל שילוב של מנתחי מסה שונים, הוסיף יתרונות נוספים ופיתוח מנתח מסה ברזולוציה גבוהה החיה את מחקרי השומנים11. ניתוח מבוסס MS מאפיין מולקולות ליפידים בשתי דרכים עיקריות: (1) ליפידומיקה מלמעלה למטה שבה ניסויי טרשת נפוצה מכוונים לאפיון כמותי מהיר של שינויים גלובליים בתוך הליפידום ומסתמכים אך ורק על מסות מדויקות של קודמני ליפידים שלמים12; (2) ליפידומיקה מלמטה למעלה המכמתת מינים מולקולריים בודדים על ידי זיהוי יוני שבר מבניים אופייניים באמצעות טנדם MS13,14.

בסך הכל, ניתוח השומנים בקולטני האור של דרוזופילה מורכב משני שלבים: ראשית, מיצוי שומנים מרקמת העין/ראש ושנית, ניתוח שומנים שחולצו על ידי טרשת נפוצה. ניתן לבצע זאת באחת מהשיטות הבאות: הפרדת שומנים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) בשילוב עם טרשת נפוצה או ללא הפרדה כרומטוגרפית באמצעות ליפידומיקה של רובה ציד/טרשת נפוצה ישירה (DIMS). שתי גישות פרופיל השומנים מבוססות על שימוש ב-ELECTROSPRAY IONIZATION MS (ESI-MS) והוכחו כרגישות, כמותיות ויעילות10,15. בניתוח DIMS, זיהוי השומנים מבוסס על מסת יונים מבשר, סריקות אובדן ניטרלי וחתימות ספציפיות למחלקת השומנים 14,16,17,18. בעוד שגישה זו משלבת את מהירות הניתוח והחוסן, לא ניתן להימנע מדיכוי יונים של שומנים בשפע נמוך עקב נוכחות של שפע גבוה ושומנים מקוטבים מאוד בדגימה. לפיכך, ליפידים בשפע נמוך כגון פוספואינוזיטידים ו-PA לרוב אינם מזוהים או מזוהים בצורה גרועה על ידי פלטפורמות DIMS סטנדרטיות, בין היתר בגלל דיכוי יונים19,20. הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית לפני MS (LC-MS) יכולה לעזור להתגבר על דיכוי יונים וכן למקד את הניתוח של מחלקות או מינים ספציפיים של שומנים מעניינים21.

במאמר זה מתוארים השלבים הכרוכים בכימות השומנים העיקריים המעניינים בקולטני האור של דרוזופילה. בהקשר זה, שלוש גישות MS שונות עברו אופטימיזציה: (1) DIMS באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, (2) כרומטוגרפיה נוזלית לאחר נגזרת פאזה הפוכה-MS (RPLC-MS) באמצעות ספקטרומטר מסה משולש מרובע, ו-(3) כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל - ניטור תגובות מרובות - סריקת יונים משופרת של מוצר MS (NPLC-MRM-EPI-MS) באמצעות ספקטרומטר מסה משולש מרובע עם פונקציית סריקת יונים משופרת. הבחירה בין שיטות אלה מוכתבת על ידי שאלות המחקר הספציפיות הנחקרות. לתיאור וניתוח גלובלי של כל מיני גליצרופוספוליפידים המעורבים בפוטו-טרנסדוקציה, יש להשתמש ב-DIMS. עם זאת, יש לציין כי בגישה זו לא סביר שיתגלו גליצרופוספוליפידים בעלי קיטוב נמוך ושפע נמוך כגון פוספואינוזיטידים22. כדי לזהות שומנים בשפע נמוך אלה, יש לבצע RPLC-MS לאחר נגזרת. באמצעות גישה זו, זיהינו וכימתנו בהצלחה חומצה פוספטית (PA)23,24,25, פוספטידילינוזיטול (PI), פוספטידילינוזיטול 5 פוספט (PI5P)26, פוספטידילינוזיטול 4 פוספט (PI4P) ו-PI(4,5)P 2 27. שיטות DIMS ופוסט נגזרת RPLC-MS מייצרות מידע ברמת מחלקת השומנים. לדוגמה, באמצעות שתי שיטות אלה ניתן לכמת PA (34:2) שה-m/z שלו תואם למספר מינים מולקולריים, כולל: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0), ו-(viii) PA (20:0/14:2). באמצעות שיטות אלה, לא ניתן לקבל מידע על הרכב שרשרת האציל השומני של ה-PA (34:2) הקיים בדגימה. ניתן להתגבר על אתגר זה על ידי שיטת טרשת נפוצה היברידית המשלבת הפרדת LC, ניטור תגובות מרובות (MRM) וסריקת יונים משופרת (EPI). שיטה זו רגישה וכמותית כאחד ומאפשרת: מדידה ישירה, כלומר ללא כל תיוג מוקדם או עיבוד לאחר הדגימה, ומבססת את המין המולקולרי עם מידע מדויק על שרשרת אציל שומנית25. באמצעות שיטה זו, זיהינו מספר רב של מינים מולקולריים של PA וקבענו את ההרכב המדויק של שרשראות אציל שומניות ב-SN1 ו-SN2 של עמוד השדרה של הגליצרול. גישה זו תהיה שימושית בעת ניתוח התפקוד של מינים מולקולריים ספציפיים של כל סוג של שומנים בקולטני האור. ניתן להתאים פרוטוקולים מפורטים המוצגים כאן עבור כל אחד מסוגי הניתוחים הללו לשומני איתות אחרים הרלוונטיים לתפקוד קולטני האור של דרוזופילה (לסכמות ראו איור 1). יש לציין כי שיטות מפורטות לניתוח ליפידומיקה של מספר סוגים אחרים של ליפידים (לא מכוסים במאמר זה), תוארו במקום אחר. אלה כוללים סרמידים28,29, ספינגוליפידים30,31, ליפידים ניטרליים כגון דיגליצרידים וטריגליצרידים32,33 וסטרולים15,33. במקרים מסוימים, תוארו שיטות לניתוח שומנים אלה עבור רקמות זחל דרוזופילה וניתן להתאים אותן לשימוש בקולטני אור.

Protocol

1. גידול זבובים והכנת כימיקלים

  1. זבובים אחוריים (Drosophila melanogaster) על מזון זבובים רגיל באינקובטור עם 50% לחות יחסית ב-25 מעלות צלזיוס ללא תאורה פנימית. הכינו מזון זבובים על ידי הוספת 80 גרם/ליטר קמח תירס, 20 גרם/ליטר D-גלוקוז, 40 גרם/ליטר סוכרוז, 8 גרם/ליטר אגר, 15 גרם/ליטר תמצית שמרים, 4 מ"ל חומצה פרופיונית, 0.7 גרם/ליטר TEGO (מתיל פרה הידרוקסיבנזואט), ו-0.6 מ"ל חומצה אורתופוספורית כמתוארב-34 וזמינים גם ב-https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. גדל סט אחד של זבובים, לאחר אקלוזיות, באינקובטור מקורר הנשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם תאורת אור לבן רציפה של ~2,000 לוקס.
  2. הכן מאגר פליטת פוספואינוזיטיד (PEB) על ידי הוספת כלורופורם: מתנול: 2.4 M חומצה הידרוכלורית ביחס של 250: 500: 200 (נפח/נפח/נפח). הכן מאגר שטיפה בשלב נמוך יותר (LPWS) על ידי הוספת מתנול: 1 M חומצה הידרוכלורית: כלורופורם ביחס של 235: 245: 15 (נפח/נפח/נפח). הכן תמיסת שטיפה לאחר נגזרת על ידי הוספת כלורופורם: מתנול: מים ביחס של 8: 4: 3 (נפח/נפח/נפח).
    הערה: השתמש בממיסים וכימיקלים בדרגת MS. אין לאחסן את מאגר ה-PEB וה-LPWS במשך יותר מ-3 חודשים.
  3. השתמש בעמודת C4 (1.7 μm x 1 מ"מ x 100 מ"מ) עבור הפוספואינוזיטידים, PI4P ו- PI(4,5)P2 ובעמודת C18 (1.0 מ"מ x 100 מ"מ x 1.7 מ"מ) עבור PA, פוספטידילכולין (PC) ופוספטידילינוזיטול (PI). לשיטת NPLC-MRM-EPI, השתמש בעמוד הסיליקה (1 מ"מ x 150 מ"מ x 3 מיקרומטר).
  4. הכן נוזל A על ידי הוספת הקסאן: אלכוהול איזופרופיל: 100 מ"מ אמוניום אצטט מימי ביחס של 68:30:2 (נפח/נפח/נפח) ונוזל B על ידי הוספת הקסאן: אלכוהול איזופרופיל: 100 מ"מ אמוניום אצטט מימי ביחס של 70:20:10 (נפח/נפח/נפח) עבור PA, PC ו-PI. הכן ממס A לפוספואינוזיטידים על ידי הוספת 0.1% חומצה פורמית במים וממס B על ידי הוספת 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל.

2. בידוד רקמות

  1. אסוף 10 זבובים לדגימה באמצעות הרדמת פחמן דו חמצני (CO2) (זבובים משתקים תוך שניות) וערוף את ראשי הזבובים באמצעות להב חד על צלחת הרדמה CO2 .
  2. אסוף זבובים כהים או מותאמים לאור בגיל מוגדר (12-24 שעות) בצינורות של 1.5 מ"ל והקפיא בחנקן נוזלי. ייבשו את הזבובים באצטון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בבקבוקון זכוכית35. לרקמת רשתית, יש לאסוף 100 רשתית מזבובים מיובשים בהקפאה. בעזרת אזמל, הסר את העיניים משאר הראש והוציא את הרשתית.
  3. לניתוח פוספואינוזיטידים PI4P ו-PI(4,5)P2 , בעת עבודה עם רשתית טרייה, השתמש ב-25 רשתית לדגימה מזבובים הגדלים בתנאים של תאורה מתאימה למדידת רמות השומנים במהלך התאורה ומזבובים הגדלים ללא אור למדידת רמות השומנים בחושך. יש לאחסן ב-50 מיקרוליטר של 1x PBS בצינורות הומוגנייזר על קרח יבש עד שמוכן למיצוי.

3. מיצוי שומנים

זהירות: כלורופורם הוא ממס רעיל והוא מסרטן באופיו. זה משפיע על מערכת הרבייה ומהווה מגרה בעור ובעיניים. יש לנקוט באמצעי זהירות בטיפול בכימיקל זה. יש לבצע את כל השלבים הכרוכים בכלורופורם במכסה מנוע כימי מאוורר היטב.

  1. עבור כל הגליצרופוספוליפידים מלבד PI4P ו-PI(4,5)P2
    1. עבור כל דגימה, הומוגניזציה של 10 ראשי זבובים או 100 רשתית (שנאספו כמתואר בשלב 2.2) ב-0.1 מ"ל של 0.1 N HCl מתנולי קר כקרח ו-30 מיקרוליטר של תערובת סטנדרטית פנימית (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), חומצה ליזופוספטית (LPA; 13:0), ליזופוספטידילכולין (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0), ו-PC (12:0/13:0)). הכן תקנים כך שהכמות הסופית של כל תקן ליפידים תיפול בתוך עקומת התגובה הליניארית של ספקטרומטר המסה.
    2. הומוגניזציה של רקמות באמצעות הומוגנייזר אוטומטי המאפשר טיפול מהיר וסימולטני בכל הדגימות. סובב בקצרה צינורות בצנטריפוגה שולחנית וודא שלא נוצרת גלולה - זה מעיד על הומוגניזציה מלאה. העבירו את ההומוגנאט המתנולי לצינור מיקרו-צנטריפוגה מכוסה של 2 מ"ל.
    3. הוסף 0.2 מ"ל של 0.1 N HCl מתנולי קר כקרח לשחזור כל חומר שיורי בצינור ושלב בצינור 2 מ"ל. מוסיפים 0.1 מ"ל של 0.1 N HCl מתנולי קר כקרח ואחריו 0.8 מ"ל כלורופורם ומערבבים היטב. הניחו לתערובת, המכילה רקמה הומוגנית, לעמוד על קרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 0.4 מ"ל של 0.88% KCl ומערבולת למשך 30 שניות.
    4. צנטריפוגה את התערובת ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להפריד בין השלבים המימיים והאורגניים. מוציאים את השלב האורגני התחתון המכיל ליפידים בזהירות רבה מבלי לערבב עם השלב המימי ומעבירים לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 2 מ"ל.
      הערה: במהלך מיצוי השומנים, העבירו את השלב האורגני התחתון בזהירות מירבית כדי למנוע ערבוב עם פאזה מימית, מה שעלול לפגוע בניתוח השומנים במורד הזרם.
    5. יבש את תמיסת השומנים הזו במאייד ואקום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, בדוק ויזואלית את הדגימה כדי להבטיח ייבוש מלא. השעו מחדש ב-420 מיקרוליטר של תערובת מתנול 2:1: כלורופורם לניתוח. נתח את הדגימות מיד ללא אחסון.
  2. עבור פוספואינוזיטידים PI4P ו-PI(4,5)P2
    1. הומוגניזציה של 25 רשתית ב-950 מיקרוליטר של מאגר פליטה פוספואינוזיטיד (PEB; 250 מ"ל של CHCl3, 500 מ"ל של מתנול ו-200 מ"ל של 2.4 M HCl) והוספת תקנים פנימיים (פוספטידיל-אתנולמין (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); ותערובת PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) המכילה 50 ננוגרם של PI, 25 ננוגרם של PI4P, 50 ננוגרם של PI(4,5)P2 ו-0.2 ננוגרם של PE לדגימה.
    2. הוסף 250 מיקרוליטר כל אחד של כלורופורם ו-2.4 M HCl, ולאחר מכן סוניקציה למשך 2 דקות וצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להפרדת פאזות. הוציאו את השלב האורגני התחתון לתוך צינור טרי, שטפו עם 900 מיקרוליטר LPWS וצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. חלץ שומנים מהפאזה המימית שנותרה על ידי ביצוע שוב הפרדת פאזה כמו בשלב 3.2.2. יבש את השלבים האורגניים שנאספו בצנטריפוגת ואקום המוגדרת ב-4 מעלות צלזיוס, בדוק ויזואלית את הדגימות כדי להבטיח ייבוש מלא.

4. בדיקת פוספט אורגנית

  1. הכינו תמיסת מלאי של 7.34 מ"מ KH2PO4. בצע את הדילולים הסטנדרטיים, באמצעות מים מזוקקים, בצינורות מיקרו-צנטריפוגה לפי טבלה 1. מערבל קלות את הצינורות והעביר את הדילולים הסטנדרטיים לצינורות זכוכית נטולי פוספט.
  2. הכן סט נפרד של צינורות זכוכית המכילים את דגימות השומנים. בצע אופטימיזציה של נפח דגימות השומנים כך שהספיגה ב-630 ננומטר (לאחר השלמת פרוטוקול זה) תיפול בטווח הסטנדרטי של KH2PO4 (שהוא 0 עד פי 20).
  3. מחממים את צינורות הזכוכית המכילים דילולים סטנדרטיים ב-120 מעלות צלזיוס ליובש מלא. מחממים את צינורות הזכוכית המכילים את דגימות השומנים (קח 1/8 מנפח הדגימה הכולל הנדרש כדי לקבל ספיגה בטווח של KH2PO4 סטנדרטי) ב-90 מעלות צלזיוס כדי להשלים את היובש.
  4. מוסיפים 50 מיקרוליטר של 70% חומצה פרכלורית לכל הצינורות ומחממים ב-180 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מצננים את הצינורות לטמפרטורת החדר. הוסף 250 מיקרוליטר מים, 50 מיקרוליטר של 2.5% אמוניום מוליבדט ו-50 מיקרוליטר של 10% חומצה אסקורבית לכל צינור.
    הערה: 2.5% אמוניום מוליבדט ו-10% חומצה אסקורבית הם ריכוזי משקל/נפח. הם צריכים להיות טריים וניתן לאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע.
  5. שמור את הצינורות באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. יש לצרוך 130 מיקרוליטר של דגימה לתוך צלחת של 96 בארות ולמדוד את הספיגה ב-630 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

5. נגזרת

זהירות: דווח כי לטרימתיל-סילילדיאזומתאן (TMSD) יש השפעות טוקסיקולוגיות רבות בבני אדם. TMSD בתמיסה מכוונת לכליות, כבד, מערכת העיכול, שרירי השלד, מערכת העצבים המרכזית ומערכות הנשימה והרבייה. יש לנקוט באמצעי זהירות קיצוניים בעת הטיפול בכימיקל זה. יש לבצע את התהליך כולו במכסה מנוע כימי מאוורר היטב.

  1. לשלב האורגני התחתון של הדגימות שהתקבלו מסוף שלב 3.2.3., הוסף 50 מיקרוליטר של 2 M TMSD. אפשר לתגובה להמשיך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם טלטול מתמיד ב -250 סל"ד. לאחר 10 דקות, הוסף 10 מיקרוליטר של חומצה אצטית קרחונית כדי להרוות את התגובה, המסומנת על ידי היעלמות הצבע הצהוב בתמיסה.
  2. הקש על הצינורות ופתח אותם בזהירות כדי להסיר את ה-N2 שנוצר בתגובת המרווה. לאחר שגז N2 נמלט, סגור את הצינורות וסובב אותם כלפי מטה. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לאחר נגזרת ומערבולת למשך 2 דקות במיקסר ב-250 סל"ד.
  3. השלך ~400 מיקרוליטר מהשלב העליון שייווצר. חזור על שלב 5.2. השליכו את כל השלב העליון והוסיפו 50 מיקרוליטר של 90% מתנול לשלב התחתון וערבבו אותו.
  4. יבש את הדגימות למשך שעתיים ברכז צנטריפוגלי בטמפרטורה של 800 x גרם הפועל בוואקום. לאחר הייבוש, הצינורות צריכים להכיל ~20 מיקרוליטר מהדגימה שנותרה. הוסף 180 מיקרוליטר של 100% מתנול, ערבב אותו היטב ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 2-3 ימים לפני LC-MS/MS.

6. איסוף וניתוח נתונים

  1. קליטת נתונים בעירוי ישיר MS (DIMS)
    הערה: ניתן לבצע טרשת נפוצה בשיטת עירוי ישיר או כרומטוגרפיה נוזלית MS (LC-MS). בחלק זה, אנו מתארים טרשת נפוצה מבוססת עירוי ישיר.
    1. לפני תחילת הניסוי, כייל את ספקטרומטר המסה לפי הוראות היצרן.
    2. צור עקומת תגובה ליניארית עבור סדרת הדילול של תקנים סינתטיים ובהתבסס על התגובה הליניארית של המכשיר, דלל את הדגימה כך שעוצמת אנליט השומנים תיפול בתוך הליניאריות של המכשיר. יש לדלל את סך תמציות השומנים או תקני השומנים בתערובת של 2:1 מתנול: כלורופורם (נפח/נפח). בחר דילול של סך תמציות השומנים והסטנדרטים הסינתטיים בנפרד עבור כל ניסוי.
    3. העבירו את התמציות והתקנים לבקבוקונים בודדים. הימנע מבועות אוויר במהלך העברת דגימות לבקבוקוני דגימה של MS. בועות אוויר ייצרו לחץ גבוה בעמודה ויעכבו את ניתוח השומנים.
    4. לפני הניתוח, צנטריפוגה את הדגימות למשך 9 דקות ב-6,440 x g והעמיסו לתוך צלחת של 96 בארות ואוטמים בנייר אלומיניום.
    5. לבצע ניתוחי MS על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה בשיטת עירוי ישיר. השג יינון יציב מבוסס ESI של גליצרופוספוליפידים באמצעות מקור יונים ננו-זרימה רובוטי באמצעות שבבים עם חרירי ריסוס בקוטר 4.1 מיקרומטר.
    6. שלוט במקור היונים באמצעות תוכנת ספקטרומטר מסה מותאמת אישית והגדר מתחי יינון ב-+1.2 קילו וולט ו-1 קילו וולט במצבים חיוביים ושליליים, בהתאמה; לחץ אחורי ב-1 psi בשני המצבים; וטמפרטורת נימי העברת יונים ב-180 מעלות צלזיוס. בצע רכישה ברזולוציית מסה, Rm/z400 = 100,000. ראה איור 2A לממשק התוכנה להגדרת פרמטרים של ספקטרומטר מסה.
    7. יש להמיס מחדש תמציות שומנים מיובשות ב-400 מיקרוליטר של כלורופורם: מתנול (1:2). לצורך הניתוח, טען 60 מיקרוליטר של דגימות על מקור יונים של צלחת 96 בארות ואטום בנייר אלומיניום. נתח כל דגימה במשך 20 דקות במצב יונים חיובי כדי לזהות PC, פוספטידילסרין (PS), פוספטידיל-אתנולמין (PE), PE-O (פוספטידיל-אתנולמין מקושר לאתר), סרמיד (Cer) וסרמיד פוספט (Cer-P).
    8. בצע רכישה עצמאית במצב יונים שליליים למשך 20 דקות בהן זוהו PA ו-PI. ראה איור 2B לפרטים ספציפיים על הגדרת מכשירים לרכישת נתונים עבור MS ברזולוציה גבוהה ורשימה ממוקדת של מיני PA שנכללו ברכישה תלויה בנתונים (DDA) שהוגדרו.
      הערה: ממשק התוכנה להגדרת שיטת DDA מוצג באיור 2C. רשימת מולקולות ה-PA הממוקדות בגישה זו מפורטת בטבלה 2. צילום מסך של תוצאת הניסוי בגישת DDA מוצג באיור 2D.
  2. ניתוח נתונים בעירוי ישיר של טרשת נפוצה (DIMS)
    הערה: ניתוח נתוני מסה שנוצרו על ידי כל סוגי ספקטרומטרי המסה דורש פלטפורמה אוטומטית לניתוח שומנים. LipidXplorer36 היא תוכנה לא מסחרית התומכת בכל סוגי ניסויי השומנים ב-DIMS. ניתן למצוא תוכנה זו כאן: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. לאחר רכישת הנתונים באמצעות השיטות המתוארות בשלב 6.1, זהה מיני שומנים באמצעות פלטפורמת ניתוח ליפידים על ידי התאמת m/z של הפסגות המונואיזוטופיות שלהם לאילוצי הרכב היסודות המתאימים. הדוגמה לייבוא נתונים מוצגת באיור 3A. הגדר את סובלנות המסה ל-10 עמודים לדקה וסף העוצמה בהתאם לרמת הרעש המדווחת על ידי תוכנת ספקטרומטר המסה.
    2. לאחר הייבוא, הידור שאילתות שפת שאילתות פיצול מולקולרי (MFQL) עבור PA בהתבסס על המבנה הכימי של PA, המוצג באיור 3B. ראה איור 3C עבור ה-MFQL שהוגדר בפלטפורמת ניתוח השומנים.
    3. באמצעות גישה דומה, הידור MFQL עבור גליצרופוספוליפידים אחרים בתוכנת פלטפורמת ניתוח השומנים. כל שאילתה מכוונת למחלקת ליפידים אחת וניתן להשתמש בשאילתות רבות בביצוע יחיד.
    4. הפעל את כל ה-MFQL על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה . כל מיני השומנים שזוהו מדווחים בקובץ תוצאות יחיד בפורמט קובץ .csv עם שפע של יונים קודמים ו/או שברים מתאימים לכימות השומנים לאחר מכן. דוגמה לפלט ניתנת בטבלה 3.

7. כרומטוגרפיה נוזלית וטנדם MS של דגימות נגזרות

  1. הפרד את הדגימות שהתקבלו משלב 5.4 על ידי כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. בעת בחירת מערכת זו, ודא שהתוכנה שלה יכולה להשתלב עם זו של ספקטרומטר המסה המשמש לניתוח.
  2. חבר את המערכת לספקטרומטר מסה משולש מרובע. בחר עמודת הפרדה. להפרדת שומנים שאינם PI4P ו-PI(4,5)P2 בחר עמודת C18 (1.0 מ"מ x 100 מ"מ x 1.7 מ"מ). עבור PI4P ו-PI(4,5)P2, בחר עמודת C4 במידות 300 Å (1.0 מ"מ x 100 מ"מ x 1.7 מיקרומטר).
  3. הכן את השלב הנייד המכיל פורמט אמוניום על ידי המסת פורמט אמוניום במים בדרגת מפרט המוני תחילה, ולאחר מכן בממיסים אורגניים. סוניקציה של כל הממיסים המשמשים בספקטרומטריית מסה למשך 20 דקות להסרת בועות אוויר.
  4. אזנו את העמודה על ידי החדרת תמיסה A המכילה מים + 0.1% חומצה פורמית ותמיסה B המכילה אצטוניטריל + 0.1% חומצה פורמית.
  5. הזרקת הפליטה ממערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית (נפח הזרקה בטווח של 1-20 מיקרוליטר) לספקטרומטר המסה לצורך ניתוח. הגדר את קצב הזרימה על 0.1 מ"ל/דקה ואת טמפרטורת העמודה בטמפרטורת החדר. הזרקו את כל נפח ה-elute היוצא מהעמודה לתוך ספקטרומטר מסה.
  6. ברצף הזרקת הדגימה, התחל תמיד בהזרקת ממס ריק (מתנול) ושמור דגימות סטנדרטיות מסודרות לסירוגין בין דגימות ביולוגיות לבדיקות בקרת איכות של ספקטרומטריית מסה (כל ריצה שישית).
  7. עבור מערך הניסוי ההיברידי של ספקטרומטר מסה משולש מרובע מלכודת יונים, לפני תחילת הניסוי, כייל את ספקטרומטר המסה לפי הוראות היצרן. עבור PA, PC ו-PI, השתמש ביינון אלקטרו-ספריי (ESI) כדי ליצור את היונים ולפעול במצב חיובי כדי לזהות את מיני השומנים הטעונים חיובית. רכוש את הנתונים ונתח אותם באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים המותקנת במערכת.
  8. בצע אופטימיזציה של הפרמטרים לניתוח בהתאם לתקן הפנימי המתאים בו נעשה שימוש. הפרמטרים של ספקטרומטר מסה הם כדלקמן: זמן שהייה = 30 אלפיות השנייה; CAD (דיסוציאציה מופעלת על ידי התנגשות) = 3 psi; GS1 (גז מקור 1) = 24 psi ו-GS2 (גז מקור 2) = 21 psi; CUR (גז וילון) = 30 psi; IS (מתח ESI) = 4.5 קילו וולט; ו-TEM (טמפרטורת מקור) = 450 מעלות צלזיוס.
  9. עבור PI4P ו-PI(4,5)P2, השתמש בספקטרומטר מסה במצב חיובי. הפרמטרים של ספקטרומטר מסה הם כדלקמן: זמן שהייה = 65 אלפיות השנייה; CAD (דיסוציאציה מופעלת על ידי התנגשות) = 2 psi; GS1 (גז מקור 1) ו-GS2 (גז מקור 2) = 20 psi; CUR (גז וילון) = 37 psi; IS (מתח ESI) = 5.2 קילו וולט; ו-TEM (טמפרטורת מקור) = 350 מעלות צלזיוס.

8. כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל - ניטור תגובות מרובות - סריקת יונים משופרת של מוצר MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. תנאים כרומטוגרפיים
    1. השתמש בשיטת LC פאזה רגילה באמצעות עמודת סיליקה, המסוגלת להפריד PA מפוספוליפידים אחרים. השתמש בהקסאן: אלכוהול איזופרופיל: 100 מ"מ NH4COOH מימי ביחס 68:30:2 כשלב A נייד ואלכוהול איזופרופיל: הקסאן: 100 מ"מ NH4COOH מימי ביחס של 70:20:10 כשלב B נייד.
      הערה: שילוב זה סיפק את ההפרדה הטובה ביותר ואת שיא הסלקטיביות של מינים מולקולריים שונים של PA.
    2. השתמש בהתנהגות הכרומטוגרפית של תרכובות ייחוס (תקנים פנימיים), מבחינת רזולוציה וצורת שיא, כדי לבחור את התנאים האופטימליים.
    3. בצע הפרדה כרומטוגרפית על עמוד סיליקה פאזה רגילה (1 מ"מ x 150 מ"מ x 3 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר על עמודת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ביצועים. הגדר את נפח הזרקת הדגימה האוטומטית ל-6 μL ואת קצב זרימת הנוזל ל-210 μL/min.
    4. לאחר 5 דקות של שיווי משקל עם 100% משלב A הנייד, הגדל באופן ליניארי את שלב B הנייד ל-30% במשך 5 דקות, המשך ל-80% במשך 5 דקות, ואז ל-100% במשך 5 דקות, והשאר אותו קבוע ב-100% למשך 5 דקות. לבסוף, אזנו מחדש את העמודה למשך 9 דקות.
  2. ספקטרומטריית מסה
    1. השתמש בספקטרומטר מסה היברידי משולש מרובע מלכודת יונים הפועל במצב ESI שלילי. שלוט בפעולת המערכת ובאיסוף הנתונים באמצעות תוכנת הניתוח המצורפת. לפני תחילת הניסוי, כייל את ספקטרומטר המסה לפי הוראות היצרן.
    2. בצע אופטימיזציה של פרמטרי המקור באמצעות ניתוח הזרקת זרימה של התערובת הסטנדרטית הפנימית. בהתאם לכך, הגדר את מתח ריסוס היונים = -4.5 קילו וולט, טמפרטורת המקור (TEM) = 450 מעלות צלזיוס, גז דיסוציאציה מופעל התנגשות (CAD) = 3 psi. השתמש בגז חנקן כגז ההתנגשות והגדר גז נבולייזר (GS1) = 24 psi, גז העזר (GS2) = 21 psi, וגז הווילון (CUR) = 30 psi.
    3. הגדר את פרמטרי נתיב היונים התלויים בתרכובת כפוטנציאל פירוק אשכולות (DP) = -42 V, פוטנציאל כניסה (EP) = -6 V ופוטנציאל יציאת תא התנגשות (CXP) = -12 V, ממוטב באמצעות עירוי רציף של תמיסת תערובת סטנדרטית פנימית. הקלט ספקטרום מוצר מלא יחד עם מעברי MRM קודמים למוצר עם אנרגיית התנגשות משתנה (CE) החל מ-12 eV עד 40 eV לניתוח פיצול באמצעות פונקציית סריקת EPI הזמינה בספקטרומטר המסה.
      הערה: ה-MRM המופעל על ידי IDA EPI מתעד בו-זמנית תוצר-יונים קודם, סריקת יונים ורכישת MS/MS תוך כדי תנועה. ה-MRM צמצם את טווח סריקת היונים ב-quadrupole 1 (Q1) ומלכודת היונים שיפרה את שברי היונים העוברים דרך Q2 ובכך שיפרה מאוד את היכולת האיכותית של MS/MS מרובע, במיוחד ללכידת כל השברים הנובעים מיון המבשר. במצב EPI, יוני שבר מרובים הנובעים מיוני המבשר מתגלים ב-Q3 עם יחס אות לרעש טוב יותר.
    4. בצע ניסויי MRM עם CE של 39 eV כדי להשיג רגישות גבוהה. הגבל את המספר המרבי של MRM ל-75 וזמן השהייה ל-30 אלפיות השנייה כדי לזהות ולתעד את ה-MRM של כל מולקולה ספציפית היוצאת מהעמודה הכרומטוגרפית בכל עת במהלך הריצה. זה מגדיל את מחזור העבודה של המכונה.
    5. בצע כוונון ניסיוני כדי להחליט על פרמטרי היינון הטובים ביותר עבור PA, כמתואר לעיל. עבור ניסוי זה, הגדר את מתח ריסוס היונים = -4.5 קילו וולט, טמפרטורת מקור (TEM) = 450 מעלות צלזיוס, גז דיסוציאציה מופעל התנגשות (CAD) = 3 psi. השתמש בגז חנקן כגז ההתנגשות. הגדר גז נבולייזר (GS1) = 24 psi, גז העזר (GS2) = 21 psi, וגז הווילון (CUR) = 30 psi.
    6. בדוק ידנית את כל נתוני הכוונון כדי להבטיח בחירה נכונה של פרמטרי יינון ויוני מוצר. קח בחשבון את מזעור ההפרעות הפוטנציאליות בין ערוצי MRM בעת בחירת יון המוצר. הפרמטרים הניסיוניים המשמשים לניתוח כל המינים המולקולריים של PA מוצגים בטבלה 4.
      הערה: ספקטרומטר המסה הליניארי ההיברידי המשולש מאפשר לנו לשלב מצב סריקת MRM עם פונקציית סריקת מלכודת היונים, ובכך לאפשר סריקה מהירה וגבוהה על ידי שימוש בשיטות כגון סריקת EPI להקלטת ספקטרום מסה טנדם שימושי של כל מבשר שזוהה. במחקר זה, כדי לזהות מינים מולקולריים מובהקים של PA, ניצלנו את גישת MS/MS מבוססת MRM-EPI המבוססת על נתיב היונים המרובע המשולש הקונבנציונלי עם תכונת סריקת ה-EPI של מלכודת היונים, הנשלטת על ידי תוכנת הניתוח.

תוצאות

קביעת ליניאריות של מדידה ב-MS. לינאריות היא היכולת של שיטת MS לספק תוצאות העומדות ביחס ישר לריכוז אנליט השומנים. הליניאריות תלויה ב-(א) יעילות היינון של אנליט השומנים ו-(ב) התנהגות היינון של אנליט השומנים בריכוזים שונים תלויה במקור היונים המשומש. ביינון אלקטרו-ספרי...

Discussion

מספר קווי ראיות מתכנסים לתפקידים מרובים של שומני איתות בוויסות הארגון והתפקוד של קולטני האור של דרוזופילה. בנוסף לתפקיד הנחקר היטב של שומנים בוויסות פוטוטרנסדוקציה3, שומני איתות היו מעורבים גם בסחר בחלבונים ובארגון תת-תאי 23,30,39,40,41.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי המחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו (Project Identification No. RTI 4006), המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו (BT/PR4833/MED/30/744/2012) ומלגה בכירה של India Alliance (IA/S/14/2/501540) ליחסי ציבור. אנו מודים למתקן ספקטרומטריית המסה של NCBS, במיוחד לד"ר Dhananjay Shinde ולחברי מעבדת יחסי הציבור על תרומתם לפיתוח שיטות אלה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 N methanolic HCLFor total lipid isolation
0.88% KClSigma AldrichP9541For total lipid isolation
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tubesEppendorf,022431081/022431102For total lipid isolation
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polar lipids999974Lipid Internal Standard
37% pure HClSigma Aldrich320331For total lipid isolation
96-well plateTotal Organic Phosphate assay
AcetoneFisher Scientific32005For dissections
Ammonium molybdateTotal Organic Phosphate assay
Ascorbic AcidTotal Organic Phosphate assay
Bath sonicator
BEH300 C18 column [1.0 mm x 100mm x 1.7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Blade holderFine Scientific Tools10052-11For dissections
BOD incubatorTotal Organic Phosphate assay
Breakable bladesFine Scientific tools10050-00For dissections
Butter paperGE healthcare10347671For dissections
C4, 300 A0, [1.7 μm x1 mm x 100 mm] columnWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Chromatography amber color glass vials with insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polar lipids860517Lipid Internal Standard
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polar lipids850172Lipid Internal Standard
Dissecting microscopesOlympusSZ51For dissections
Dry heat bath.
Eluent AHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (68:30:2) , for LC
Eluent BHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (70:20:10), for LC
Filter paperIndica-HM274039For dissections
FlasksBorosilFor dissections
FliesNANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab kitchen, composition: corn flour 80 g/L, D-glucose 20 g/L, sucrose 40 g/L, agar 8 g/L, yeast extract 15 g/L, propionic acid 4 mL, TEGO (methyl para hydroxybenzoate) 0.7 g/L, orthophosphoric acid 0.6 mL)
ForcepsFine Scientific Tools11254-20For dissections
Fume hood
FunnelBorosilFor dissections
Glacial acetic acidFisher ScientificA35-500For derivatization
Glass bottles: transparent and amber colorFor total lipid isolation
High-temperature-resistant phosphate-free glass tubes.Total Organic Phosphate assay
Homogenization tubes with zirconium oxide beadsFor total lipid isolation
Homogenizer instrumentPrecellys
Humidified CO2 connected to fly padsFor fly pushing
Illumination controlled incubatorsPanasonic SanyoMIR-553For fly rearing
Initial organic mixturemethanol:chloroform (2:1), For total lipid isolation
LC-MS grade ChloroformSigma Aldrich650498For total lipid isolation
LC-MS grade MethanolSigma Aldrich34860For total lipid isolation
LC-MS grade waterSigma Aldrich34877For total lipid isolation
Light meterHTC instrumentsLX-103
Low retention tipsEppendorf0030072006/72014/72022/72030For total lipid isolation
LTQ Orbitrap XL instrumentThermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
Lysophosphatidic acid (LPA)- 13:0Avanti polar lipidsLM-1700Lipid Internal Standard
Lysophosphatidic acid (LPA)- 17:1Avanti polar lipidsLM 1701Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -13:0Avanti polar lipidsLM-1600Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -17:1Avanti polar lipids855677Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC)- 19:0Avanti polar lipids855776Lipid Internal Standard
Perchloric acid.Total Organic Phosphate assay
Phosphate standard potassium dihydrogen phosphateTotal Organic Phosphate assay
Phosphate-buffered saline (PBS)NANAComposition: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Phosphatidic acid (PA)- 12:0/13:0Avanti polar lipids, LM-1400 Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1404Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-(17:0/17:0)Avanti polar lipids830856Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-16:0-D31/18:1Avanti polar lipids860453Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC) -12:0/13:0Avanti polar lipidsLM-1000Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1004Lipid Internal Standard
Phosphatidylethanolamine (PE) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-110Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol (PI) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1504Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1904Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1901Lipid Internal Standard
Robotic nanoflow ion sourceTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
Silicone padsFor dissections
solvent A0.1% formic acid in water, for LC
solvent B0.1% formic acid in acetonitrile, for LC
Table-top centrifuge
Thermo-mixer
TMS-diazomethaneAcrosAC385330050For derivatization
Triple quadrupole mass spectrometerAB SciexQTRAP 6500
UPLC systemWaters Acquity
Vacuum centrifugal concentratorScanvac , Labogene
Vortex machine

References

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157 (2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515 (2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756 (2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851 (2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -. H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

C45

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved