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摘要

该手稿提出了多功能、稳健且灵敏的质谱方案，用于鉴定和定量果 蝇 光感受器中的几类脂质。

摘要

磷脂酶 Cβ （PLCβ） 的激活是 果蝇 光感受器感觉转导过程中必不可少的步骤。PLCβ 活性导致膜脂质磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸 [PI（4,5）P2] 的水解，最终导致瞬时受体电位 （TRP） 和 TRP 样 （TRPL） 通道的激活。PLCβ 的活性还随后导致许多脂质种类的产生，其中几种被认为在 TRP 和 TRPL 激活中发挥作用。此外，已经提出了几类脂质在组织光感受器的细胞生物学中发挥关键作用，以优化信号反应以实现最佳感觉转导。从历史上看，这些发现是由分离果 蝇 突变体控制特定脂质水平的酶的能力驱动的，这些酶可以控制特定脂质的水平并对这些突变体中的光感受器生理学进行分析。最近，已经开发出了用于分离和定量分析脂质的强大质谱方法，具有高灵敏度和特异性。这些特别适合在 果蝇 中使用，现在无需放射性核素标记即可从光感受器进行脂质分析。本文介绍了使用脂质质谱法对 果蝇 光感受器中各种信号脂质进行稳健、灵敏和准确的定量评估的概念和实际考虑。与分子遗传学和生理学分析的现有方法一起，这种脂质可能会增强光感受器作为生物学发现模型系统的能力。

引言

果蝇中的光转导是由 G 蛋白偶联的 PLCβ 级联反应介导的，导致光激活通道 TRP 和 TRPL1 的激活。PLCβ 水解膜结合的磷脂、磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸 [PI（4,5）P2] 并生成甘油二酯 （DAG） 和肌醇 1,4,5 三磷酸 （IP3）。然后 DAG 被 DAG 激酶磷酸化生成磷脂酸 （PA）。随后，通过涉及脂质中间体生成的一系列反应，PI（4,5）P2 再生2。该 PI（4,5）P2 循环的几个组分在果蝇光感受器中具有功能。PLC 激活导致 TRP 和 TRPL 通道门控的机制仍未解决。然而，几条证据表明，PI（4,5）P2 水解产生的脂质中间体可能介导这一过程3。因此，鉴定和量化这些脂质中间体以阐明果蝇光转导中 TRP 和 TRPL 激活的机制非常重要。除了在光转导本身中的作用外，脂质在光感受器的细胞组织中也起着几个重要作用（在3 中已论述）。了解脂质的这些功能作用有助于检测和量化其体内水平的能力。本文提供了选择和实施果蝇光感受器脂质的方法的概述和方案。

从历史上看，脂质分析包括按化学类别分馏，然后对单个类别进行分析。为了成功鉴定和定量脂质，已经开发了许多分析方法，这些方法要么是靶向的，要么是非靶向的脂质分析 4,5,6,7,8,9,10。靶向分析侧重于已知的脂质，并利用具有高灵敏度的特定方法对这些特定脂质进行定量分析。非靶向脂质分析旨在同时检测样品中的多种脂质。这些分析方法包括薄层色谱法 （TLC）4、气相色谱法 （GC）5、液相色谱法 （LC）6、酶联免疫吸附测定法 （ELISA）7、核磁共振 （NMR）8、放射性核素标记法和质谱法 （MS）9,10。尽管放射性标记是一种检测脂质的敏感方法，并且可以在培养细胞的环境中使用，但由于放射性标记活体飞行动物的安全考虑，它在完整生物体（如果蝇）中的脂质分析中的应用具有挑战性。放射性标记的另一个挑战是，它依赖于将所有前体池标记为接近平衡，这在体内模型的背景下可能很困难。

使用 MS 进行全面的血脂分析是现代 MS 技术发展使最新进步成为可能11。基于 MS 的脂质分析具有多种优势，包括样品量小、适用于动物模型样品、高灵敏度、特异性以及高通量。特别是，电喷雾电离的广泛使用提高了 MS 的脂质分析性能。质谱仪中质量分析仪的改进，包括不同质量分析仪的组合，增加了额外的优势，高分辨率质量分析仪的发展使脂质研究重新焕发活力11。基于 MS 的分析以两种主要方式表征脂质分子：（1） 自上而下的脂质组学，其中 MS 实验旨在快速定量表征脂质组内的整体变化，并且仅依赖于完整脂质前体的精确质量数12;（2） 自下而上的脂质组学，通过使用串联 MS13,14 检测特征结构碎片离子来定量单个分子种类。

总体而言，果蝇光感受器中脂质的分析包括两个步骤：首先，从眼睛/头部组织中提取脂质，其次，通过 MS 分析提取的脂质。这可以使用以下方法之一进行：通过液相色谱 （LC） 与 MS 联用分离脂质，或者使用鸟枪法脂质组学/直接灌注 MS （DIMS） 进行色谱分离，无需色谱分离。两种脂质分析方法均基于电喷雾电离 MS （ESI-MS） 的使用，并已被证明具有灵敏、定量和高效的优点10,15。在 DIMS 分析中，脂质的鉴定基于母离子质量、中性丢失扫描和脂质类别特异性特征14、16、17、18。虽然这种方法结合了分析速度和稳定性，但由于样品中存在高丰度和高极化脂质，无法避免对低丰度脂质的离子抑制。因此，由于离子抑制等原因，标准 DIMS 平台通常无法检测到或检测不佳，例如磷酸肌醇和 PA 等低丰度脂质19,20。MS 前的液相色谱分离 （LC-MS） 有助于克服离子抑制，并集中分析特定类别或种类的目标脂质21。

在本文中，描述了量化果蝇光感受器中感兴趣的主要脂质所涉及的步骤。在这方面，已经优化了三种不同的 MS 方法：（1） 使用高分辨率质谱仪的 DIMS，（2） 使用三重四重质谱仪的衍生化后反相液相色谱-MS （RPLC-MS），以及 （3） 使用具有增强子离子扫描功能的三重四重质谱仪的正相液相色谱-多反应监测-增强子离子扫描-MS （NPLC-MRM-EPI-MS）。这些方法之间的选择取决于正在研究的具体研究问题。对于参与光转导的所有种类甘油磷脂的整体描述和分析，应使用 DIMS。然而，应该注意的是，在这种方法中，不太可能检测到低极化和低丰度的甘油磷脂，例如磷酸肌醇22。为了检测这些低丰度脂质，应进行衍生化后 RPLC-MS。使用这种方法，我们成功检测和定量了磷脂酸 （PA）23,24,25、磷脂酰肌醇 （PI）、磷脂酰肌醇 5 磷酸酯 （PI5P）26、磷脂酰肌醇 4 磷酸酯 （PI4P） 和 PI（4,5）P 2 27。DIMS 和衍生化后 RPLC-MS 方法可生成脂质类别水平信息。例如，使用这两种方法可以量化 m/z 与多种分子种类一致的 PA （34：2），包括：（i） PA （16：0/18：2），（ii） PA （18：2/16：0），（iii） PA （16：2/18：0），（iv） PA （18：0/16：2），（v） PA （16：1/18：1），（vi） PA （18：1/16：1），（vii） PA （14：2/20：0） 和 （viii） PA （20：0/14：2）。使用这些方法，无法获得有关样品中存在的 PA （34：2） 的脂肪酰基链组成的信息。这一挑战可以通过耦合液相色谱分离、多反应监测 （MRM） 和增强子离子扫描 （EPI） 的混合 MS 方法来克服。该方法既灵敏又定量，允许：直接测量，即无需对样品进行任何预标记或后处理，并使用精确的脂肪酰基链信息确定分子种类25。使用这种方法，我们鉴定了大量 PA 的分子种类，并确定了甘油骨架 SN1 和 SN2 处脂肪酰基链的确切组成。在分析光感受器中任何类别脂质的特定分子种类的功能时，这种方法将很有用。此处介绍的每种类型分析的详细方案可以适用于与果蝇光感受器功能相关的其他信号脂质（示意图见图 1）。应该注意的是，其他几类脂质的脂质组学分析的详细方法（本文未涵盖）已在其他地方描述。这些包括神经酰胺28,29、鞘脂30,31、甘油二酯和甘油三酯等中性脂质 32,33 和甾醇15,33。在某些情况下，已经描述了果蝇幼虫组织的这些脂质分析方法，并且可以适用于光感受器。

研究方案

1. 饲养苍蝇和制备化学品

  1. 后蝇（黑腹果蝇）在相对湿度为 50% 的培养箱中，在 25 °C 无内部照明的培养箱中食用标准果蝇食物。添加 80 g/L 玉米粉、20 g/L D-葡萄糖、40 g/L 蔗糖、8 g/L 琼脂、15 g/L 酵母提取物、4 mL 丙酸、0.7 g/L TEGO（对羟基苯甲酸甲酯）和 0.6 mL 正磷酸，如34 中所述制备苍蝇食品，也可在 https:// 获得bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation。在羽化后，在保持 25 °C 的冷却培养箱中培养一组果蝇，连续白光照明为 ~2,000 lux。
  2. 通过以 250：500：200（体积/体积/体积）的比例加入氯仿：甲醇：2.4 M 盐酸来制备磷酸肌醇洗脱缓冲液 （PEB）。通过以 235：245：15 （vol/vol/vol） 的比例加入甲醇：1 M 盐酸：氯仿来制备低相洗涤缓冲液 （LPWS）。通过以 8：4：3 （vol/vol/vol/vol） 的比例加入氯仿：甲醇：水来制备衍生化后洗涤液。
    注：使用 MS 级溶剂和化学品。PEB 和 LPWS 缓冲液的储存时间不要超过 3 个月。
  3. 使用 C4 （1.7 μm x 1 mm x 100 mm） 色谱柱检测磷酸肌醇、PI4P 和 PI（4,5）P2 ，使用 C18 色谱柱 （1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm） 检测 PA、磷脂酰胆碱 （PC） 和磷脂酰肌醇 （PI）。对于 NPLC-MRM-EPI 方法，使用硅胶柱 （1 mm x 150 mm x 3 μm）。
  4. 通过加入己烷：异丙醇：100 mM 乙酸铵水溶液以 68：30：2（体积/体积/体积）的比例制备洗脱液 A，通过加入己烷：异丙醇：100 mM 乙酸铵水溶液以 70：20：10（体积/体积/体积）的比例制备洗脱液 B，用于 PA、PC 和 PI。通过在水中加入 0.1% 甲酸来制备磷酸肌醇的溶剂 A，通过在乙腈中加入 0.1% 甲酸来制备溶剂 B。

2. 组织分离

  1. 使用二氧化碳 （CO2） 麻醉（苍蝇在几秒钟内固定）每个样品收集 10 只果蝇，并使用 CO2 麻醉板上的锋利刀片将果蝇斩首。
  2. 在 1.5 mL 试管中收集规定年龄（12-24 小时龄）的深色或光照适应的果蝇，并在液氮中快速冷冻。将果蝇在 -80 °C 的丙酮中脱水，在玻璃瓶35 中脱水 48 小时。对于视网膜组织，从冻干果蝇中收集 100 个视网膜。使用手术刀从头部其他部分取出眼睛并挖出视网膜。
  3. 对于磷酸肌醇 PI4P 和 PI（4,5）P2 分析，当使用新鲜视网膜时，在适当照明条件下生长的果蝇每个样品使用 25 个视网膜来测量照明期间的脂质水平，以及来自无光生长的果蝇在黑暗中测量脂质水平。在干冰上的均质器管中储存在 50 μL 1x PBS 中，直至准备好提取。

3. 脂质提取

注意：氯仿是一种有毒溶剂，具有致癌性。它影响生殖系统，对皮肤和眼睛有刺激性。处理此化学品时应采取预防措施。所有涉及氯仿的步骤都应在通风良好的化学罩中进行。

  1. 对于除 PI4P 和 PI（4,5）P 以外的所有甘油磷脂2
    1. 对于每个样品，在 0.1 mL 0.1 N 冰冷的甲醇盐酸盐和 30 μL 内标混合物（PA （17：0/14：1）、PC （17：0/14：1）、溶血磷脂酸 （LPA;13：0）、溶血磷脂酰胆碱 （LPC;13：0）、LPC （17：1）、PA （17：0/17：0）、PA （16：0-D31/18：1）、LPA （17：1）、LPC （19：0）、PI （12：0/13：0）、LPC （17：0/17：0）、PA （16：0-D31/18：1）、LPA （17：1）、LPC （19：0）、PI （12：0/13：0）、 PA （12：0/13：0） 和 PC （12：0/13：0））。制备标准品，使任何脂质标准品的最终量落在质谱仪的线性响应曲线内。
    2. 使用自动匀浆机对组织进行匀浆，可快速、同时处理所有样品。在台式离心机中短暂离心试管，确保没有形成沉淀 - 这表明完全均质化。将甲醇匀浆转移到 2 mL 加盖微量离心管中。
    3. 加入 0.2 mL 冰冷的 0.1 N 甲醇盐酸盐以回收管中的任何残留物质，并在 2 mL 管中混合。加入 0.1 mL 0.1 N 冰冷的甲醇盐酸盐，然后加入 0.8 mL 氯仿并充分混合。让含有组织匀浆的混合物在冰上静置 10 分钟，然后加入 0.4 mL 的 0.88% KCl 并涡旋 30 秒。
    4. 将混合物在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 10 分钟以分离水相和有机相。非常小心地取出含有脂质的下层有机相，不要与水相混合，然后转移到新的 2 mL 微量离心管中。
      注：在脂质提取过程中，应非常小心地转移下层有机相，以避免与水相混合，这可能会妨碍下游脂质分析。
    5. 在 4 °C 的真空蒸发器中干燥该脂质溶液，目视检查样品以确保完全干燥。重悬于 420 μL 2：1 甲醇：氯仿混合物中进行分析。立即分析样品，无需储存。
  2. 对于磷酸肌醇 PI4P 和 PI（4,5）P2
    1. 在 950 μL 磷酸肌醇洗脱缓冲液 （PEB;250 mL CHCl3、500 mL 甲醇和 200 mL 2.4 M HCl）中匀浆 25 个视网膜，并添加内标（磷脂酰乙醇胺 （PE） 17：0/14：1;PI （17：0/14：1）;PI4P （17：0/20：4）;和 PI（4,5）P2 （16：0/16：0）） 混合物，每个样品含有 50 ng PI、25 ng PI4P、50 ng PI（4,5）P2 和 0.2 ng PE。
    2. 加入 250 μL 氯仿和 2.4 M HCl，然后超声处理 2 分钟，并在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 5 分钟以进行相分离。将下层有机相取出到新管中，用 900 μL LPWS 洗涤，并在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 5 分钟。
    3. 如步骤 3.2.2 所示，再次进行相分离，从剩余的水相中提取脂质。在设定为 4 °C 的真空离心机中干燥收集的有机相，目视检查样品以确保完全干燥。

4. 有机磷酸盐测定

  1. 制备 7.34 mM KH2PO4 的储备液。按照 表 1 在微量离心管中使用蒸馏水进行标准稀释。轻轻涡旋试管，并将标准稀释液转移到不含磷酸盐的玻璃管中。
  2. 准备一组单独的玻璃管，其中包含脂质样品。优化脂质样品的体积，使 630 nm 处的吸光度（完成本协议后）落在标准 KH2PO4 （即 0 至 20 倍）的范围内。
  3. 将含有标准稀释液的玻璃管在 120 °C 下加热至完全干燥。将含有脂质样品的玻璃管（取所需总样品体积的 1 /8 以使其吸光度在标准 KH2PO4 范围内）在 90 °C 下加热至完全干燥。
  4. 向所有试管中加入 50 μL 70% 高氯酸，并在 180 °C 下加热 30 分钟。将试管冷却至室温。向每管中加入 250 μL 水、50 μL 2.5% 钼酸铵和 50 μL 10% 抗坏血酸。
    注：2.5% 钼酸铵和 10% 抗坏血酸是重量/体积浓度。它们需要新鲜制作，并且可以在 4 °C 下储存长达 1 周。
  5. 将试管在 37 °C 的振荡培养箱中保持 1 小时。将 130 μL 样品分装到 96 孔板中，并使用分光光度计测量 630 nm 处的吸光度。

5. 衍生化

注意：据报道，三甲基硅烷基重氮甲烷 （TMSD） 对人类有许多毒理学影响。TMSD 溶液针对肾脏、肝脏、胃肠道、骨骼肌、中枢神经系统以及呼吸和生殖系统。处理此化学品时应采取极端预防措施。整个过程应在通风良好的化学罩中进行。

  1. 向从步骤 3.2.3. 结束时获得的样品的较低有机相中，加入 50 μL 2 M TMSD。让反应在室温下进行 10 分钟，并以 250 rpm 的速度持续振荡。10 分钟后，加入 10 μL 冰醋酸以淬灭反应，溶液中黄色消失。
  2. 轻敲试管并小心地打开它们以去除淬灭反应中形成的 N2 。N2 气体逸出后，关闭管子并使其向下旋转。然后，加入 600 μL 衍生化后洗涤液，并在混合器中以 250 rpm 的速度涡旋 2 分钟。
  3. 丢弃将形成的上层相 ~400 μL。重复步骤 5.2。弃去整个上层固定相，向下固定相中加入 50 μL 90% 甲醇并混合。
  4. 在真空中以 800 x g 的离心浓缩器将样品干燥 2 小时。干燥后，试管中应含有 ~20 μL 的剩余样品。加入 180 μL 100% 甲醇，充分混合，并在 LC-MS/MS 之前在 4 °C 下储存长达 2-3 天。

6. 数据采集和分析

  1. 直接输注 MS （DIMS） 中的数据采集
    注：MS 可以通过直接进样或液相色谱 MS （LC-MS） 方法完成。在本节中，我们描述了基于直接输注的 MS。
    1. 在开始实验之前，请按照制造商的说明校准质谱仪。
    2. 为合成标准品的稀释系列生成线性响应曲线，并根据仪器的线性响应稀释样品，使脂质分析物的强度落在仪器的线性范围内。用 2：1 甲醇：氯仿 （vol/vol） 的混合物稀释总脂质提取物或脂质标准品。为每个实验分别选择总脂质提取物和合成标准品的稀释度。
    3. 将提取物和标准品转移到各个样品瓶中。在将样品转移到 MS 样品瓶中时避免气泡。气泡会在色谱柱中产生高压并妨碍脂质分析。
    4. 分析前，将样品以 6,440 x g 离心 9 分钟，然后加载到 96 孔板中并用铝箔密封。
    5. 使用直接进样法在高分辨率质谱仪上进行 MS 分析。使用机器人纳流离子源，使用带有直径为 4.1 μm 的喷雾喷嘴的芯片，实现基于 ESI 的甘油磷脂稳定电离。
    6. 使用自定义质谱仪软件控制离子源，并在正和负模式下分别将电离电压设置为 +1.2 kV 和 -1 kV;两种模式下的背压为 1 psi;离子转移毛细管的温度为 180 °C。 以质量分辨率 Rm/z400 = 100,000 执行采集。有关设置质谱仪参数的软件界面，请参见 图 2A 。
    7. 将干燥的总脂质提取物重新溶解在 400 μL 氯仿：甲醇 （1：2） 中。分析时，将 60 μL 样品加载到 96 孔板离子源上，并用铝箔密封。在正离子模式下分析每个样品 20 分钟，以检测 PC、磷脂酰丝氨酸 （PS）、磷脂酰乙醇胺 （PE）、PE-O（醚连接的磷脂酰乙醇胺）、神经酰胺 （Cer） 和神经酰胺磷酸酯 （Cer-P）。
    8. 在负离子模式下进行独立采集 20 分钟，同时检测到 PA 和 PI。有关用于高分辨率 MS 数据采集的仪器设置的具体详细信息，以及数据依赖性采集 （DDA） 设置中包含的 PA 物质的目标列表，请参见 图 2B 。
      注意：用于设置 DDA 方法的软件界面如图 2C 所示。该方法靶向的 PA 分子列表列于 表 2 中。DDA 方法的实验结果屏幕截图如图 2D 所示。
  2. 直接输注 MS （DIMS） 数据分析
    注：分析所有类型的质谱仪生成的质量数据都需要一个自动化的脂质分析平台。LipidXplorer36 是一款非商业软件，支持所有类型的 DIMS 脂质实验。该软件可以在这里找到： https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. 使用步骤 6.1 中描述的方法采集数据后，使用脂质分析平台将其单同位素峰的 m/z 与相应的元素组成约束相匹配，从而鉴定脂质种类。数据导入示例如图 3A 所示。根据质谱仪软件报告的噪音水平，将质量容差设置为 10 ppm 和强度阈值。
    2. 导入后，根据 PA 的化学结构编译 PA 的分子碎裂查询语言 （MFQL） 查询，如图 3B 所示。有关脂质分析平台中设置的 MFQL，请参见 图 3C 。
    3. 使用类似的方法，在脂质分析平台软件中为其他甘油磷脂编译 MFQL。每个查询都针对一个脂质类别，并且可以在单个执行中使用多个查询。
    4. 单击 Run 按钮运行所有 MFQL。所有鉴定出的脂质种类都以 .csv 文件格式在单个结果文件中报告，并带有相应的母离子和/或碎片离子的丰度，用于随后的脂质定量。 表 3 中给出了输出的示例。

7. 衍生样品的液相色谱和串联 MS

  1. 使用超高效液相色谱系统通过液相色谱分离从步骤 5.4 获得的样品。选择此系统时，请确保其软件可以与用于分析的质谱仪的软件集成。
  2. 将系统连接到三重四极杆质谱仪。选择分离柱。要分离除 PI4P 和 PI（4,5）P2 以外的脂质，请选择 C18 色谱柱 （1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm）。对于 PI4P 和 PI（4,5）P2，请选择尺寸为 300 Å （1.0 mm x 100 mm x 1.7 μm） 的 C4 色谱柱。
  3. 先将甲酸铵溶解在质谱级水中，然后再溶解在有机溶剂中，制备含有甲酸铵的流动相。对质谱分析中使用的所有溶剂进行超声处理 20 分钟以去除气泡。
  4. 通过注入含水 + 0.1% 甲酸的溶液 A 和含乙腈 + 0.1% 甲酸的溶液 B 来平衡色谱柱。
  5. 将液相色谱系统中的洗脱液（进样体积范围为 1-20 μL）注入质谱仪进行分析。将流速设置为 0.1 mL/min，并将色谱柱温度设置为室温。将从色谱柱流出的整个洗脱液体积注入质谱仪中。
  6. 在样品进样序列中，始终从空白溶剂进样（甲醇）开始，并在生物样品之间间歇性地保持纯标准样品，以进行质谱运行质量控制检查（每六次运行）。
  7. 对于混合型三重四极杆离子阱质谱仪实验装置，在开始实验之前，请按照制造商的说明校准质谱仪。对于 PA、PC 和 PI，使用电喷雾电离 （ESI） 生成离子，并在正离子模式下运行以检测带正电荷的脂质种类。获取数据并使用系统安装的数据分析软件进行分析。
  8. 根据使用的相应内标优化分析参数。质谱仪参数如下：停留时间 = 30 ms;CAD（碰撞激活解离）= 3 psi;GS1（源气 1）= 24 psi 和 GS2（源气 2）= 21 psi;CUR（帘式气体）= 30 psi;IS（ESI 电压）= 4.5 kV;TEM（源温度）= 450 °C。
  9. 对于 PI4P 和 PI（4,5）P2，使用正离子模式的质谱仪。质谱仪参数如下：停留时间 = 65 ms;CAD（碰撞激活解离）= 2 psi;GS1（源气 1）和 GS2（源气 2）=20 psi;CUR（帘式气体）= 37 psi;IS （ESI 电压） = 5.2 kV;TEM（源温度）= 350 °C。

8. 正相液相色谱-多反应监测-增强子离子扫描MS （NPLC-MRM-EPI MS）

  1. 色谱条件
    1. 使用使用硅胶柱的正相液相色谱方法，该方法能够将 PA 与其他磷脂分离。使用己烷：异丙醇：100 mM NH4COOH 水溶液，比例为 68：30：2 作为流动相 A，使用异丙醇：己烷：100 mM NH4COOH 水溶液，比例为 70：20：10 作为流动相 B。
      注：这种组合为不同分子种类的 PA 提供了最佳的分离和峰选择性。
    2. 根据参比化合物（内标）的色谱行为（分离度和峰形）来选择最佳条件。
    3. 在室温下，在超高效液相色谱柱的正相硅胶柱 （1 mm x 150 mm x 3 μm） 上进行色谱分离。将自动进样器进样体积设置为 6 μL，洗脱液流速设置为 210 μL/min。
    4. 用100%的流动相A平衡5 min后，在5 min内线性增加流动相B至30%，在5 min内进一步增加至80%，然后在5 min内增加至100%，并保持100%恒定5 min。最后，重新平衡色谱柱 9 分钟。
  2. 质谱法
    1. 使用在负 ESI 模式下运行的混合型三重四极杆离子阱质谱仪。使用提供的分析软件控制系统作和数据采集。在开始实验之前，请按照制造商的说明校准质谱仪。
    2. 使用内标混合物的流动进样分析来优化源参数。因此，设置离子喷涂电压 = -4.5 kV，源温度 （TEM） = 450 °C，碰撞激活解离气体 （CAD） = 3 psi。使用氮气作为碰撞气体，并设置雾化器气体 （GS1） = 24 psi，辅助气体 （GS2） = 21 psi，帘式气体 （CUR） = 30 psi。
    3. 将化合物相关离子路径参数设置为去聚电位 （DP） = -42 V、入口电位 （EP） = -6 V 和碰撞池出口电位 （CXP） = -12 V，使用连续注入内标混合物溶液进行优化。使用质谱仪中提供的 EPI 扫描功能，以 12 eV 至 40 eV 的不同碰撞能量 （CE） 记录完整的子谱图以及母离子到子 MRM 的离子对，以便进行碎裂分析。
      注：MRM 触发的基于 IDA 的 EPI 可同时记录母离子-产物、离子扫描和动态 MS/MS 采集。MRM 缩小了四极杆 1 （Q1） 的离子扫描范围，离子阱增强了通过 Q2 的离子碎片，从而大大提高了四极杆 MS/MS 的定性能力，特别是捕获母离子产生的所有碎片。在 EPI 模式下，在 Q3 中检测到由母离子产生的多个碎片离子，具有更好的信噪比。
    4. 使用 39 eV 的 CE 进行 MRM 实验以获得高灵敏度。将 MRM 的最大数量限制为 75，将停留时间限制为 30 ms，以检测和记录在运行期间任何时间从色谱柱洗脱的任何特定分子的 MRM。这增加了机器的占空比。
    5. 如上所述，进行实验调谐以确定 PA 的最佳电离参数。对于本实验，设置离子喷涂电压 = -4.5 kV，源温度 （TEM） = 450 °C，碰撞激活解离气体 （CAD） = 3 psi。使用氮气作为碰撞气体。设置雾化器气体 （GS1） = 24 psi，辅助气体 （GS2） = 21 psi，帘式气体 （CUR） = 30 psi。
    6. 手动检查所有调谐数据，以确保正确选择电离参数和子离子。在选择子离子时，请考虑将 MRM 通道之间的潜在干扰降至最低。用于分析所有 PA 分子种类的实验参数如 表 4 所示。
      注：混合型三重四极杆线性离子阱质谱仪使我们能够将 MRM 扫描模式与离子阱扫描功能相结合，从而利用 EPI 扫描等方法记录每个检测到的母离子的有用串联质谱，从而实现快速和高度扫描。在本研究中，为了鉴定 PA 的不同分子种类，我们利用了这种基于 MRM-EPI 的 MS/MS 方法，该方法基于传统的三重四极杆离子路径，具有离子阱的 EPI 扫描特性，由分析软件控制。

结果

在 MS 中测定测量的线性。线性是 MS 方法提供与脂质分析物浓度成正比的结果的能力。线性取决于 （a） 脂质分析物的电离效率，以及 （b） 不同浓度的脂质分析物的电离行为取决于所使用的离子源。在本研究中使用的电喷雾电离 （ESI） 中，线性保持在较低的浓度，具体取决于 （a） 离子从 ESI 源到质量分析器的传输，以及 （b） 质量分析器的设计以及检测?...

讨论

许多证据都集中在信号脂质在调节果蝇光感受器的组织和功能中的多种作用。除了脂质在调节光转导中的作用得到充分研究3 外，信号脂质还与蛋白质运输和亚细胞组织有关 23,30,39,40,41。这些研究是通过果蝇模型系统?...

披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

本手稿中描述的工作得到了印度政府原子能部的支持（项目识别编号。RTI 4006）、印度政府生物技术部 （BT/PR4833/MED/30/744/2012） 和印度联盟高级奖学金 （IA/S/14/2/501540） 到 PR。我们感谢 NCBS 质谱设施，特别是 Dhananjay Shinde 博士和 PR 实验室的成员为开发这些方法做出的贡献。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 N methanolic HCLFor total lipid isolation
0.88% KClSigma AldrichP9541For total lipid isolation
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tubesEppendorf,022431081/022431102For total lipid isolation
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polar lipids999974Lipid Internal Standard
37% pure HClSigma Aldrich320331For total lipid isolation
96-well plateTotal Organic Phosphate assay
AcetoneFisher Scientific32005For dissections
Ammonium molybdateTotal Organic Phosphate assay
Ascorbic AcidTotal Organic Phosphate assay
Bath sonicator
BEH300 C18 column [1.0 mm x 100mm x 1.7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Blade holderFine Scientific Tools10052-11For dissections
BOD incubatorTotal Organic Phosphate assay
Breakable bladesFine Scientific tools10050-00For dissections
Butter paperGE healthcare10347671For dissections
C4, 300 A0, [1.7 μm x1 mm x 100 mm] columnWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Chromatography amber color glass vials with insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polar lipids860517Lipid Internal Standard
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polar lipids850172Lipid Internal Standard
Dissecting microscopesOlympusSZ51For dissections
Dry heat bath.
Eluent AHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (68:30:2) , for LC
Eluent BHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (70:20:10), for LC
Filter paperIndica-HM274039For dissections
FlasksBorosilFor dissections
FliesNANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab kitchen, composition: corn flour 80 g/L, D-glucose 20 g/L, sucrose 40 g/L, agar 8 g/L, yeast extract 15 g/L, propionic acid 4 mL, TEGO (methyl para hydroxybenzoate) 0.7 g/L, orthophosphoric acid 0.6 mL)
ForcepsFine Scientific Tools11254-20For dissections
Fume hood
FunnelBorosilFor dissections
Glacial acetic acidFisher ScientificA35-500For derivatization
Glass bottles: transparent and amber colorFor total lipid isolation
High-temperature-resistant phosphate-free glass tubes.Total Organic Phosphate assay
Homogenization tubes with zirconium oxide beadsFor total lipid isolation
Homogenizer instrumentPrecellys
Humidified CO2 connected to fly padsFor fly pushing
Illumination controlled incubatorsPanasonic SanyoMIR-553For fly rearing
Initial organic mixturemethanol:chloroform (2:1), For total lipid isolation
LC-MS grade ChloroformSigma Aldrich650498For total lipid isolation
LC-MS grade MethanolSigma Aldrich34860For total lipid isolation
LC-MS grade waterSigma Aldrich34877For total lipid isolation
Light meterHTC instrumentsLX-103
Low retention tipsEppendorf0030072006/72014/72022/72030For total lipid isolation
LTQ Orbitrap XL instrumentThermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
Lysophosphatidic acid (LPA)- 13:0Avanti polar lipidsLM-1700Lipid Internal Standard
Lysophosphatidic acid (LPA)- 17:1Avanti polar lipidsLM 1701Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -13:0Avanti polar lipidsLM-1600Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -17:1Avanti polar lipids855677Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC)- 19:0Avanti polar lipids855776Lipid Internal Standard
Perchloric acid.Total Organic Phosphate assay
Phosphate standard potassium dihydrogen phosphateTotal Organic Phosphate assay
Phosphate-buffered saline (PBS)NANAComposition: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Phosphatidic acid (PA)- 12:0/13:0Avanti polar lipids, LM-1400 Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1404Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-(17:0/17:0)Avanti polar lipids830856Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-16:0-D31/18:1Avanti polar lipids860453Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC) -12:0/13:0Avanti polar lipidsLM-1000Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1004Lipid Internal Standard
Phosphatidylethanolamine (PE) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-110Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol (PI) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1504Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1904Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1901Lipid Internal Standard
Robotic nanoflow ion sourceTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
Silicone padsFor dissections
solvent A0.1% formic acid in water, for LC
solvent B0.1% formic acid in acetonitrile, for LC
Table-top centrifuge
Thermo-mixer
TMS-diazomethaneAcrosAC385330050For derivatization
Triple quadrupole mass spectrometerAB SciexQTRAP 6500
UPLC systemWaters Acquity
Vacuum centrifugal concentratorScanvac , Labogene
Vortex machine

参考文献

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