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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Manuskript präsentiert vielseitige, robuste und empfindliche Massenspektrometrieprotokolle zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Klassen von Lipiden aus Drosophila-Photorezeptoren .

Zusammenfassung

Die Aktivierung der Phospholipase Cβ (PLCβ) ist ein wesentlicher Schritt während der sensorischen Transduktion in Drosophila-Photorezeptoren . Die PLCβ-Aktivität führt zur Hydrolyse des Membranlipids Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat [PI(4,5)P2], was letztendlich zur Aktivierung von transienten Rezeptorpotential- (TRP) und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanälen führt. Die Aktivität von PLCβ führt in der Folge auch zur Bildung vieler Lipidspezies, von denen mehrere eine Rolle bei der TRP- und TRPL-Aktivierung spielen sollen. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass mehrere Klassen von Lipiden eine Schlüsselrolle bei der Organisation der Zellbiologie von Photorezeptoren spielen, um die Signalreaktionen für eine optimale sensorische Transduktion zu optimieren. In der Vergangenheit wurden diese Entdeckungen durch die Fähigkeit vorangetrieben, Drosophila-Mutanten für Enzyme zu isolieren, die den Gehalt an spezifischen Lipiden kontrollieren, und eine Analyse der Photorezeptorphysiologie in diesen Mutanten durchzuführen. In jüngerer Zeit wurden leistungsfähige massenspektrometrische Methoden zur Isolierung und quantitativen Analyse von Lipiden mit hoher Sensitivität und Spezifität entwickelt. Diese eignen sich besonders für den Einsatz in Drosophila , wo eine Lipidanalyse von Photorezeptoren aus möglich ist, ohne dass eine Radionuklidmarkierung erforderlich ist. In diesem Artikel werden die konzeptionellen und praktischen Überlegungen bei der Verwendung der Lipid-Massenspektrometrie für die robuste, empfindliche und genaue quantitative Bewertung verschiedener Signallipide in Drosophila-Photorezeptoren behandelt. Zusammen mit bestehenden Methoden in der Molekulargenetik und physiologischen Analyse wird ein solches Lipid wahrscheinlich die Leistungsfähigkeit von Photorezeptoren als Modellsystem für Entdeckungen in der Biologie erhöhen.

Einleitung

Die Phototransduktion in Drosophila wird durch eine G-Protein-gekoppelte PLCβ-Kaskade vermittelt, die zur Aktivierung der lichtaktivierten Kanäle TRP und TRPL1 führt. PLCβ hydrolysiert das membrangebundene Phospholipid Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat [PI(4,5)P2] und erzeugt Diacylglycerin (DAG) und Inositol 1,4,5-Trisphosphat (IP3). DAG wird dann durch DAG-Kinase phosphoryliert, um Phosphatidsäure (PA) zu erzeugen. Anschließend wird PI(4,5)P2 durch eine Reihe von Reaktionen, die die Bildung von Lipidzwischenprodukten beinhalten, regeneriert2. Mehrere Komponenten dieses PI(4,5)P2-Zyklus haben Funktionen in Drosophila-Photorezeptoren . Der Mechanismus, durch den die SPS-Aktivierung zu TRP- und TRPL-Kanal-Gating führt, bleibt ungelöst. Mehrere Hinweise deuten jedoch darauf hin, dass Lipidzwischenprodukte, die durch die PI(4,5)P2-Hydrolyse erzeugt werden, diesen Prozess vermitteln können3. Daher ist es sehr wichtig, diese Lipidzwischenprodukte zu identifizieren und zu quantifizieren, um den Mechanismus der Aktivierung von TRP und TRPL bei der Phototransduktion von Drosophila zu beleuchten. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Phototransduktion an sich spielen Lipide auch mehrere wichtige Rollen bei der zellulären Organisation von Photorezeptoren (überprüft in3). Das Verständnis dieser funktionellen Rolle von Lipiden wird durch die Fähigkeit unterstützt, ihre Spiegel in vivo zu erkennen und zu quantifizieren. Dieser Artikel bietet einen Überblick sowie Protokolle für die Auswahl und Implementierung von Methoden zur Quantifizierung von Lipiden aus Drosophila-Photorezeptoren .

Historisch gesehen bestand die Lipidanalytik aus der Fraktionierung nach chemischen Klassen, gefolgt von der Analyse einzelner Klassen. Um Lipide erfolgreich zu identifizieren und zu quantifizieren, wurden viele Analysemethoden entwickelt, bei denen es sich entweder um gezielte oder nicht-zielgerichtete Lipidanalysen handelt 4,5,6,7,8,9,10. Die gezielte Analyse konzentriert sich auf bekannte Lipide und verwendet eine spezielle Methode mit hoher Sensitivität für die quantitative Analyse dieser spezifischen Lipide. Die nicht-zielgerichtete Lipidanalyse zielt darauf ab, viele Lipidspezies in einer Probe gleichzeitig nachzuweisen. Zu diesen Analysemethoden gehören die Dünnschichtchromatographie (DC)4, die Gaschromatographie (GC)5, die Flüssigkeitschromatographie (LC)6, enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISA)7, die Kernspinresonanz (NMR)8, die Radionuklidmarkierung und die Massenspektrometrie (MS)9,10. Obwohl die radioaktive Markierung eine empfindliche Methode zum Nachweis von Lipiden ist und im Zusammenhang mit kultivierten Zellen eingesetzt werden kann, ist ihre Verwendung bei der Analyse von Lipiden in intakten Organismen wie Drosophila aufgrund von Sicherheitsaspekten bei der radioaktiven Markierung lebender fliegender Tiere eine Herausforderung. Die andere Herausforderung bei der radioaktiven Markierung besteht darin, dass sie davon abhängt, dass alle Vorläuferpools nahezu ausgeglichen sind, und dies kann im Zusammenhang mit In-vivo-Modellen schwierig sein.

Die umfassende Lipidanalyse mittels MS ist ein neuer Fortschritt, der durch die Entwicklung moderner MS-Technologien ermöglicht wurde11. Die MS-basierte Analyse von Lipiden bietet mehrere Vorteile, darunter kleine Probengrößen, Anwendbarkeit auf Proben aus Tiermodellen, hohe Sensitivität, Spezifität sowie hoher Durchsatz. Insbesondere der umfangreiche Einsatz der Elektrospray-Ionisation hat zu einer Verbesserung der Leistungsfähigkeit der MS bei der Lipidanalytik geführt. Die Verbesserung der Massenanalysatoren in Massenspektrometern, einschließlich der Kombination verschiedener Massenanalysatoren, hat zusätzliche Vorteile gebracht, und die Entwicklung eines hochauflösenden Massenanalysators hat die Lipidstudien wiederbelebt11. Die MS-basierte Analyse charakterisiert Lipidmoleküle auf zwei Arten: (1) Top-down-Lipidomik, bei der MS-Experimente auf eine schnelle quantitative Charakterisierung globaler Veränderungen innerhalb des Lipidoms abzielen und sich ausschließlich auf genaue Massen intakter Lipidvorläufer stützen12; (2) Bottom-up-Lipidomik, bei der einzelne molekulare Spezies durch den Nachweis charakteristischer Strukturfragmentionen mit Hilfe des Tandems MS13,14 quantifiziert werden.

Insgesamt besteht die Analyse von Lipiden in Drosophila-Photorezeptoren aus zwei Schritten: erstens die Extraktion von Lipiden aus Augen-/Kopfgewebe und zweitens die Analyse der extrahierten Lipide mittels MS. Dies kann mit einer der folgenden Methoden erfolgen: Trennung von Lipiden durch Flüssigchromatographie (LC), gekoppelt an MS oder ohne chromatographische Trennung mittels Shotgun Lipidomics/Direct Infusion MS (DIMS). Beide Ansätze zur Lipidprofilierung basieren auf der Verwendung von Elektrospray-Ionisations-MS (ESI-MS) und haben sich als sensitiv, quantitativ und effizient erwiesen10,15. In der DIMS-Analyse basiert die Identifizierung von Lipiden auf der Vorläufer-Ionenmasse, Neutralverlust-Scans und lipidklassenspezifischen Signaturen 14,16,17,18. Während dieser Ansatz die Geschwindigkeit der Analyse und die Robustheit kombiniert, kann die Ionenunterdrückung von Lipiden mit geringer Abundanz aufgrund des Vorhandenseins von hohen Abundanz und hoch polarisierbaren Lipiden in der Probe nicht vermieden werden. So werden gering vorkommende Lipide wie Phosphoinositide und PA von Standard-DIMS-Plattformen oft nicht oder nur schlecht detektiert, was unter anderem auf die Ionenunterdrückung zurückzuführen ist 19,20. Die Flüssigkeitschromatographie-Trennung vor der MS (LC-MS) kann dazu beitragen, die Ionensuppression zu überwinden und die Analyse bestimmter Klassen oder Spezies von Lipiden von Interesse zu fokussieren21.

In diesem Artikel werden die Schritte zur Quantifizierung der wichtigsten Lipide beschrieben, die in Drosophila-Photorezeptoren von Interesse sind. In diesem Zusammenhang wurden drei verschiedene MS-Ansätze optimiert: (1) DIMS mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, (2) Nachderivatisierung Umkehrphasen-Flüssigchromatographie-MS (RPLC-MS) mit einem Triple-Quadruple-Massenspektrometer und (3) Normalphasen-Flüssigchromatographie-Mehrfachreaktionsüberwachung-Enhanced Product Ion Scan-MS (NPLC-MRM-EPI-MS) mit einem Triple-Quadruple-Massenspektrometer mit erweiterter Produktionenscan-Funktion. Die Wahl zwischen diesen Methoden wird durch die konkreten Forschungsfragen vorgegeben. Für eine globale Beschreibung und Analyse aller Arten von Glycerophospholipiden, die an der Phototransduktion beteiligt sind, sollte DIMS verwendet werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass bei diesem Ansatz niedrig polarisierbare und geringe Abundanz von Glycerophospholipiden wie Phosphoinositiden wahrscheinlich nicht nachgewiesen werdenkönnen 22. Um diese Lipide mit geringer Abundanz nachzuweisen, sollte eine Post-Derivatisierung der RPLC-MS durchgeführt werden. Mit diesem Ansatz haben wir erfolgreich Phosphatidsäure (PA)23,24,25, Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylinositol-5-Phosphat (PI5P)26, Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI4P) und PI(4,5)P 2 27 nachgewiesen und quantifiziert. DIMS und RPLC-MS-Methoden nach der Derivatisierung generieren Informationen auf Lipidklassenebene. Mit diesen beiden Methoden kann man beispielsweise PA (34:2) quantifizieren, dessen m/z mit mehreren molekularen Spezies konsistent ist, darunter: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) und (viii) PA (20:0/14:2). Mit diesen Methoden kann man keine Informationen über die Zusammensetzung der Fettacylkette des in der Probe vorhandenen PA (34:2) erhalten. Diese Herausforderung kann durch eine hybride MS-Methode überwunden werden, die LC-Trennung, Multiple Reactions Monitoring (MRM) und Enhanced Product Ion Scan (EPI) kombiniert. Dieses Verfahren ist sowohl sensitiv als auch quantitativ und ermöglicht eine direkte Messung, d. h. ohne Vormarkierung oder Nachbearbeitung der Probe, und etabliert die molekulare Spezies mit exakten Informationen über die Fettacylkette25. Mit dieser Methode haben wir eine große Anzahl molekularer Spezies von PA identifiziert und die genaue Zusammensetzung der Fettacylketten an SN1 und SN2 des Glycerinrückgrats bestimmt. Dieser Ansatz wird nützlich sein, wenn die Funktion bestimmter molekularer Spezies jeder Klasse von Lipiden in Photorezeptoren analysiert wird. Die hier vorgestellten detaillierten Protokolle für jede dieser Arten von Analysen können an andere Signallipide angepasst werden, die für die Funktion der Drosophila-Photorezeptoren relevant sind (schematische Darstellung siehe Abbildung 1). Es sollte beachtet werden, dass detaillierte Methoden zur Lipidomik-Analyse mehrerer anderer Klassen von Lipiden (die in diesem Artikel nicht behandelt werden) an anderer Stelle beschrieben wurden. Dazu gehören Ceramide28,29, Sphingolipide30,31, neutrale Lipide wie Diglyceride und Triglyceride32,33 und Sterole15,33. In einigen Fällen wurden Methoden zur Analyse dieser Lipide für Drosophila-Larvengewebe beschrieben und könnten für den Einsatz in Photorezeptoren angepasst werden.

Protokoll

1. Aufzucht von Fliegen und Zubereitung von Chemikalien

  1. Hinterfliege (Drosophila melanogaster) auf Standard-Fliegenfutter in einem Brutkasten mit 50 % relativer Luftfeuchtigkeit bei 25 °C ohne Innenbeleuchtung. Bereiten Sie Fliegenfutter zu, indem Sie 80 g/l Maismehl, 20 g/l D-Glukose, 40 g/l Saccharose, 8 g/l Agar, 15 g/l Hefeextrakt, 4 mL Propionsäure, 0,7 g/l TEGO (Methylparahydroxybenzoat) und 0,6 ml Orthophosphorsäure hinzufügen, wie unter34 beschrieben und auch bei https:// erhältlich bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Züchten Sie einen Satz Fliegen nach Eklosionen in einem gekühlten Inkubator, der bei 25 °C mit kontinuierlicher Weißlichtbeleuchtung von ~2.000 Lux gehalten wird.
  2. Bereiten Sie Phosphoinositid-Elutionspuffer (PEB) vor, indem Sie Chloroform:Methanol:2,4 M Salzsäure in einem Verhältnis von 250:500:200 (vol/vol/vol) hinzufügen. Bereiten Sie einen Waschpuffer der unteren Phase (LPWS) vor, indem Sie Methanol:1 M Salzsäure:Chloroform in einem Verhältnis von 235:245:15 (vol/vol/vol) hinzufügen. Bereiten Sie die Waschlösung nach der Derivatisierung vor, indem Sie Chloroform:Methanol:Wasser in einem Verhältnis von 8:4:3 (vol/vol/vol) hinzufügen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Lösungsmittel und Chemikalien in MS-Qualität. Lagern Sie den PEB- und LPWS-Puffer nicht länger als 3 Monate.
  3. Verwenden Sie die C4-Säule (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) für die Phosphoinositide, PI4P und PI(4,5)P2 und die C18-Säule (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) für PA, Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylinositol (PI). Für die NPLC-MRM-EPI-Methode verwenden Sie die Kieselsäuresäule (1 mm x 150 mm x 3 μm).
  4. Bereiten Sie Eluent A durch Zugabe von Hexan:Isopropylalkohol:100 mM wässrigem Ammoniumacetat in einem Verhältnis von 68:30:2 (vol/vol/vol) und Eluent B durch Zugabe von Hexan:Isopropylalkohol:100 mM wässrigem Ammoniumacetat im Verhältnis 70:20:10 (vol/vol/vol) für PA, PC und PI vor. Bereiten Sie Lösungsmittel A für Phosphoinositide vor, indem Sie 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B durch Zugabe von 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril hinzufügen.

2. Isolierung von Gewebe

  1. Sammeln Sie 10 Fliegen pro Probe unter Kohlendioxid (CO2)-Anästhesie (Fliegen immobilisieren sich innerhalb von Sekunden) und enthaupten Sie die Fliegen mit einer scharfen Klinge auf einer CO2 -Betäubungsplatte.
  2. Sammeln Sie dunkle oder lichtangepasste Fliegen eines definierten Alters (12-24 h alt) in 1,5-ml-Röhrchen und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Die Fliegen in Aceton bei -80 °C für 48 h in einem Glasfläschchen35 dehydrieren. Für Netzhautgewebe sammeln Sie 100 Netzhaut von gefriergetrockneten Fliegen. Entfernen Sie mit einem Skalpell die Augen vom Rest des Kopfes und schöpfen Sie die Netzhaut aus.
  3. Für die Analyse der Phosphoinositide PI4P und PI(4,5)P2 sind bei der Arbeit mit frischer Netzhaut 25 Netzhaut pro Probe von Fliegen zu verwenden, die unter geeigneten Beleuchtungsbedingungen zur Messung des Lipidgehalts während der Beleuchtung gezüchtet wurden, und von Fliegen, die ohne Licht gezüchtet wurden, zur Messung des Lipidgehalts im Dunkeln. In 50 μl 1x PBS in Homogenisatorröhrchen auf Trockeneis lagern, bis sie zur Extraktion bereit sind.

3. Lipid-Extraktion

ACHTUNG: Chloroform ist ein giftiges Lösungsmittel und von Natur aus krebserregend. Es wirkt sich auf das Fortpflanzungssystem aus und ist haut- und augenreizend. Beim Umgang mit dieser Chemikalie ist Vorsicht geboten. Alle Schritte, die mit Chloroform zu tun haben, sollten in einer gut belüfteten Chemikalienhaube durchgeführt werden.

  1. Für alle Glycerophospholipide außer PI4P und PI(4,5)P2
    1. Für jede Probe werden 10 Fliegenköpfe oder 100 Retinae (wie in Schritt 2.2 entnommen) in 0,1 ml eiskaltem methanolischem HCl und 30 μl internem Standardgemisch (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), Lysophosphatidsäure (LPA; 13:0), Lysophosphatidylcholin (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) und PC (12:0/13:0)). Bereiten Sie Standards so vor, dass die endgültige Menge eines Lipidstandards innerhalb der linearen Reaktionskurve des Massenspektrometers liegt.
    2. Homogenisieren Sie Gewebe mit einem automatisierten Homogenisator, der eine schnelle und gleichzeitige Behandlung aller Proben ermöglicht. Drehen Sie die Röhrchen kurz in einer Tischzentrifuge und stellen Sie sicher, dass sich kein Granulat bildet – dies deutet auf eine vollständige Homogenisierung hin. Übertragen Sie das methanolische Homogenat in ein 2 mL verdeckeltes Mikrozentrifugenröhrchen.
    3. 0,2 mL eiskaltes 0,1 N methanolisches HCl zur Rückgewinnung von Restmaterial im Röhrchen zugeben und in dem 2 mL Röhrchen mischen. 0,1 mL 0,1 N eiskaltes methanolisches HCl gefolgt von 0,8 mL Chloroform zugeben und gründlich mischen. Lassen Sie die Mischung, die das Gewebehomogenat enthält, 10 Minuten lang auf Eis stehen, und fügen Sie dann 0,4 mL 0,88% KCl hinzu und wirbeln Sie sie 30 s lang.
    4. Das Gemisch bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um die wässrige und die organische Phase zu trennen. Die untere organische Phase, die Lipide enthält, sehr vorsichtig herausnehmen, ohne sich mit der wässrigen Phase zu vermischen, und in ein frisches 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
      HINWEIS: Während der Lipidextraktion ist die untere organische Phase mit größter Sorgfalt zu übertragen, um eine Vermischung mit der wässrigen Phase zu vermeiden, die die nachgelagerte Lipidanalyse behindern könnte.
    5. Trocknen Sie diese Lipidlösung in einem Vakuumverdampfer bei 4 °C und untersuchen Sie die Probe visuell, um eine vollständige Trocknung sicherzustellen. Zur Analyse in 420 μl 2:1 Methanol-Chloroform-Gemisch resuspendieren. Analysieren Sie die Proben sofort ohne Lagerung.
  2. Für die Phosphoinositide PI4P und PI(4,5)P2
    1. Homogenisieren Sie 25 Retina in 950 μl Phosphoinositid-Elutionspuffer (PEB; 250 mL CHCl3, 500 mL Methanol und 200 mL 2,4 M HCl) und fügen Sie interne Standards hinzu (Phosphatidylethanolamin (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); und PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) Gemisch, das 50 ng PI, 25 ng PI4P, 50 ng PI(4,5)P2 und 0,2 ng PE pro Probe enthält.
    2. Jeweils 250 μl Chloroform und 2,4 M HCl zugeben, gefolgt von einer Beschallung für 2 min und einer Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C zur Phasentrennung. Die untere organische Phase in ein frisches Röhrchen geben, mit 900 μL LPWS waschen und bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Extraktion der Lipide aus der verbleibenden wässrigen Phase, indem erneut eine Phasentrennung wie in Schritt 3.2.2 durchgeführt wird. Trocknen Sie die gesammelten organischen Phasen in einer Vakuumzentrifuge bei 4 °C und untersuchen Sie die Proben visuell, um eine vollständige Trocknung sicherzustellen.

4. Assay für organisches Phosphat

  1. Es wird eine Stammlösung von 7,34 mM KH2PO4 hergestellt. Die Standardverdünnungen mit destilliertem Wasser in Mikrozentrifugenröhrchen gemäß Tabelle 1 durchführen. Wirbeln Sie die Röhrchen leicht durch und übertragen Sie die Standardverdünnungen auf phosphatfreie Glasröhrchen.
  2. Bereiten Sie einen separaten Satz Glasröhrchen mit den Lipidproben vor. Optimieren Sie das Volumen der Lipidproben so, dass die Extinktion bei 630 nm (nach Abschluss dieses Protokolls) im Bereich des Standard-KH2PO4 (0 bis 20x) liegt.
  3. Die Glasröhrchen mit den Standardverdünnungen werden bei 120 °C erhitzt, bis sie vollständig trocken sind. Die Glasröhrchen mit den Lipidproben (1/8 des gesamten Probenvolumens, das für eine Absorption im Bereich des Standards KH2PO4 erforderlich ist) werden auf 90 °C erhitzt, bis sie vollständig trocken sind.
  4. 50 μl 70%ige Perchlorsäure in alle Röhrchen geben und 30 min bei 180 °C erhitzen. Kühlen Sie die Röhren auf Raumtemperatur ab. Geben Sie 250 μl Wasser, 50 μl 2,5 % Ammoniummolybdat und 50 μl 10 % Ascorbinsäure in jedes Röhrchen.
    HINWEIS: 2,5 % Ammoniummolybdat und 10 % Ascorbinsäure sind Gewichts-/Vol-Konzentrationen. Sie müssen frisch zubereitet werden und können bei 4 °C bis zu 1 Woche gelagert werden.
  5. Bewahren Sie die Röhrchen 1 h lang in einem Schüttelinkubator bei 37 °C auf. Aliquotieren Sie 130 μl der Probe in eine 96-Well-Platte und messen Sie die Extinktion bei 630 nm mit einem Spektralphotometer.

5. Derivatisierung

VORSICHT: Es wird berichtet, dass Trimethylsilyldiazomethan (TMSD) beim Menschen viele toxikologische Wirkungen hat. TMSD in Lösung zielt auf Niere, Leber, Magen-Darm-Trakt, Skelettmuskulatur, Zentralnervensystem sowie Atmungs- und Fortpflanzungssystem ab. Beim Umgang mit dieser Chemikalie ist äußerste Vorsicht geboten. Der gesamte Prozess sollte in einer gut belüfteten Chemikalienhaube durchgeführt werden.

  1. In die untere organische Phase der Proben, die am Ende von Schritt 3.2.3 entnommen wurden, werden 50 μl 2 M TMSD zugegeben. Lassen Sie die Reaktion 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 250 U/min ablaufen. Nach 10 min fügen Sie 10 μl Eisessig hinzu, um die Reaktion zu löschen, was durch das Verschwinden der gelben Farbe in der Lösung angezeigt wird.
  2. Klopfen Sie auf die Röhrchen und öffnen Sie sie vorsichtig, um das bei der Abschreckreaktion gebildete N2 zu entfernen. Nachdem N2 -Gas ausgetreten ist, schließen Sie die Röhren und drehen Sie sie nach unten. Geben Sie dann 600 μl Waschlösung nach der Derivatisierung hinzu und wirbeln Sie sie 2 Minuten lang in einem Mischer bei 250 U/min.
  3. Verwerfen Sie ~400 μL aus der oberen Phase, die sich bilden wird. Wiederholen Sie Schritt 5.2. Die gesamte obere Phase verwerfen und 50 μl 90%iges Methanol in die untere Phase geben und mischen.
  4. Die Proben werden 2 h lang in einem Zentrifugalkonzentrator bei 800 x g im Vakuum getrocknet. Nach dem Trocknen sollten die Röhrchen ~20 μL der verbleibenden Probe enthalten. 180 μl 100 % Methanol hinzufügen, gut mischen und bis zu 2-3 Tage vor der LC-MS/MS bei 4 °C lagern.

6. Datenerfassung und -analyse

  1. Datenerfassung bei der Direktinfusions-MS (DIMS)
    HINWEIS: MS kann entweder durch direkte Infusion oder durch Flüssigkeitschromatographie MS (LC-MS) durchgeführt werden. In diesem Abschnitt beschreiben wir die auf direkten Infusionen basierende MS.
    1. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Erzeugen Sie eine lineare Ansprechkurve für die Verdünnungsreihe synthetischer Standards und verdünnen Sie die Probe basierend auf der linearen Reaktion des Geräts so, dass die Intensität des Lipidanalyten innerhalb der Linearität des Geräts liegt. Verdünnen Sie Gesamtlipidextrakte oder Lipidstandards mit einer Mischung aus 2:1 Methanol:Chloroform (vol/vol). Wählen Sie die Verdünnung der Gesamtlipidextrakte und der synthetischen Standards individuell für jeden Versuch.
    3. Übertragen Sie die Extrakte und Standards auf einzelne Fläschchen. Vermeiden Sie Luftblasen beim Transfer von Proben in Probengefäße mit MS. Luftblasen erzeugen einen hohen Druck in der Säule und behindern die Lipidanalyse.
    4. Vor der Analyse zentrifugieren Sie die Proben 9 Minuten lang bei 6.440 x g und laden Sie sie in eine 96-Well-Platte und verschließen Sie sie mit Aluminiumfolie.
    5. Führen Sie MS-Analysen auf einem hochauflösenden Massenspektrometer mit der Direktinfusionsmethode durch. Erzielen Sie eine stabile ESI-basierte Ionisierung von Glycerophospholipiden unter Verwendung einer robotischen Nanoflow-Ionenquelle unter Verwendung von Chips mit Sprühdüsen mit einem Durchmesser von 4,1 μm.
    6. Steuern Sie die Ionenquelle mit einer benutzerdefinierten Massenspektrometer-Software und stellen Sie Ionisationsspannungen auf +1,2 kV bzw. -1 kV im positiven bzw. negativen Modus ein. Gegendruck bei 1 psi in beiden Modi; und Temperatur der Ionentransferkapillare bei 180 °C. Führen Sie die Erfassung mit einer Massenauflösung durch, Rm/z400 = 100.000. In Abbildung 2A finden Sie die Softwareschnittstelle zum Einrichten der Massenspektrometerparameter.
    7. Getrocknete Gesamtlipidextrakte werden in 400 μl Chloroform:Methanol (1:2) wieder aufgelöst. Für die Analyse werden 60 μl Proben auf eine 96-Well-Ionenquelle geladen und mit Aluminiumfolie versiegelt. Analysieren Sie jede Probe 20 Minuten lang im Positiv-Ionen-Modus, um PC, Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylethanolamin (PE), PE-O (ethergebundenes Phosphatidylethanolamin), Ceramid (Cer) und Ceramidphosphat (Cer-P) nachzuweisen.
    8. Führen Sie eine unabhängige Erfassung im negativen Ionenmodus für 20 Minuten durch, bei der PA und PI erkannt wurden. In Abbildung 2B finden Sie spezifische Details zum Geräteaufbau für die Datenerfassung für hochauflösende MS und eine gezielte Liste von PA-Spezies, die in die Einrichtung der datenabhängigen Erfassung (DDA) einbezogen wurden.
      HINWEIS: Die Softwareschnittstelle zum Einrichten der DDA-Methode ist in Abbildung 2C dargestellt. Die Liste der PA-Moleküle, auf die bei diesem Ansatz abzielt, ist in Tabelle 2 aufgeführt. Ein Screenshot des experimentellen Ergebnisses des DDA-Ansatzes ist in Abbildung 2D dargestellt.
  2. Datenanalyse bei der Direktinfusions-MS (DIMS)
    HINWEIS: Die Analyse von Massendaten, die von allen Arten von Massenspektrometern erzeugt werden, erfordert eine automatisierte Lipidanalyseplattform. LipidXplorer36 ist eine nicht-kommerzielle Software, die alle Arten von DIMS-Lipidexperimenten unterstützt. Diese Software finden Sie hier: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Nachdem die Daten mit den in Schritt 6.1 beschriebenen Methoden erfasst wurden, identifizieren Sie die Lipidspezies mit Hilfe einer Lipidanalyseplattform, indem Sie m/z ihrer monoisotopischen Peaks mit den entsprechenden Einschränkungen der Elementzusammensetzung abgleichen. Das Beispiel für den Datenimport ist in Abbildung 3A dargestellt. Stellen Sie die Massentoleranz auf 10 ppm und den Intensitätsschwellenwert entsprechend dem von der Massenspektrometer-Software gemeldeten Geräuschpegel ein.
    2. Kompilieren Sie nach dem Import MFQL-Abfragen (Molecular Fragmentation Query Language) für PA basierend auf der chemischen Struktur von PA, die in Abbildung 3B dargestellt ist. In Abbildung 3C finden Sie die MFQL, die in der Lipidanalyseplattform eingerichtet ist.
    3. Mit einem ähnlichen Ansatz kompilieren Sie MFQL für andere Glycerophospholipide in der Software der Lipidanalyseplattform. Jede Abfrage zielt auf eine Lipidklasse ab, und viele Abfragen können in einer einzigen Ausführung verwendet werden.
    4. Führen Sie alle MFQLs aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Alle identifizierten Lipidspezies werden in einer einzigen Ergebnisdatei in .csv Dateiformat mit den Häufigkeiten der entsprechenden Vorläufer- und/oder Fragmentionen für die anschließende Quantifizierung der Lipide angegeben. Ein Beispiel für die Ausgabe ist in Tabelle 3 dargestellt.

7. Flüssigchromatographie und Tandem-MS von derivatisierten Proben

  1. Die in Schritt 5.4 gewonnenen Proben werden durch Flüssigchromatographie mit einem Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesystem getrennt. Achten Sie bei der Auswahl dieses Systems darauf, dass die Software mit der des für die Analyse verwendeten Massenspektrometers integriert werden kann.
  2. Schließen Sie das System an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer an. Wählen Sie eine Trennspalte aus. Für die Trennung anderer Lipide als PI4P und PI(4,5)P2 ist eine C18-Säule (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) zu wählen. Wählen Sie für PI4P und PI(4,5)P2 eine C4-Säule mit den Abmessungen 300 Å (1,0 mm x 100 mm x 1,7 μm).
  3. Bereiten Sie die mobile Phase, die Ammoniumformiat enthält, vor, indem Sie Ammoniumformiat zuerst in massenspektrometrischem Wasser und dann in organischen Lösungsmitteln auflösen. Beschallen Sie alle Lösungsmittel, die in der Massenspektrometrie verwendet werden, für 20 Minuten, um Luftblasen zu entfernen.
  4. Die Säule wird äquilibriert, indem Lösung A mit Wasser + 0,1 % Ameisensäure und Lösung B mit Acetonitril + 0,1 % Ameisensäure infundiert wird.
  5. Injizieren Sie das Eluat aus dem Flüssigkeitschromatographiesystem (Injektionsvolumen im Bereich von 1-20 μL) zur Analyse in das Massenspektrometer. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,1 ml/min und die Temperatur der Säule auf Raumtemperatur ein. Injizieren Sie das gesamte aus der Säule kommende Eluvolumen in das Massenspektrometer.
  6. Beginnen Sie in der Probeninjektionssequenz immer mit einer leeren Lösungsmittelinjektion (Methanol) und bewahren Sie zwischen den biologischen Proben für die Qualitätskontrolle der Massenspektrometrie (jeder sechste Lauf) ordentliche Standardproben auf.
  7. Für den Versuchsaufbau des Hybrid-Triple-Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometers ist das Massenspektrometer vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers zu kalibrieren. Verwenden Sie für PA, PC und PI die Elektrospray-Ionisation (ESI), um die Ionen zu erzeugen, und arbeiten Sie im positiven Modus, um die positiv geladenen Lipidspezies zu detektieren. Erfassen Sie die Daten und analysieren Sie sie mithilfe der installierten Datenanalysesoftware mit dem System.
  8. Optimieren Sie die Parameter für die Analyse gemäß dem entsprechenden verwendeten internen Standard. Die Parameter des Massenspektrometers sind wie folgt: Verweilzeit = 30 ms; CAD (kollisionsaktivierte Dissoziation) = 3 psi; GS1 (Ausgangsgas 1) = 24 psi und GS2 (Ausgangsgas 2) = 21 psi; CUR (Vorhanggas) = 30 psi; IS (ESI-Spannung) = 4,5 kV; und TEM (Quellentemperatur) = 450 °C.
  9. Für PI4P und PI(4,5)P2 ist das Massenspektrometer im positiven Modus zu verwenden. Die Parameter des Massenspektrometers lauten wie folgt: Verweilzeit = 65 ms; CAD (kollisionsaktivierte Dissoziation) = 2 psi; GS1 (Ausgangsgas 1) und GS2 (Ausgangsgas 2) = 20 psi; CUR (Vorhanggas) = 37 psi; IS (ESI-Spannung) = 5,2 kV; und TEM (Quellentemperatur) = 350 °C.

8. Normalphasen-Flüssigkeitschromatographie - Überwachung mehrerer Reaktionen - erweiterter Produktionen-Scan MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Chromatographische Bedingungen
    1. Verwenden Sie eine Normalphasen-LC-Methode mit einer Kieselerdesäule, die in der Lage ist, PA von anderen Phospholipiden zu trennen. Verwenden Sie Hexan:Isopropylalkohol:100 mM wässriges NH4COOH im Verhältnis 68:30:2 als mobile Phase A und Isopropylalkohol:Hexan:100 mM wässriges NH4COOH im Verhältnis 70:20:10 als mobile Phase B.
      HINWEIS: Diese Kombination bot die beste Trennung und maximale Selektivität der verschiedenen molekularen PA-Spezies.
    2. Nutzen Sie das chromatographische Verhalten von Referenzverbindungen (interne Standards) in Bezug auf Auflösung und Peakform, um die optimalen Bedingungen zu wählen.
    3. Führen Sie die chromatographische Trennung an einer Kieselsäuresäule (1 mm x 150 mm x 3 μm) bei Raumtemperatur an einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule durch. Stellen Sie das Injektionsvolumen des Autosamplers auf 6 μl und die Eluentenflussrate auf 210 μl/min ein.
    4. Nach 5 min Äquilibrierung mit 100 % der mobilen Phase A erhöhen Sie die mobile Phase B linear auf 30 % über 5 min, weiter auf 80 % über 5 min, dann auf 100 % über 5 min und halten Sie sie 5 min lang konstant bei 100 %. Zum Schluss die Säule für 9 Minuten wieder ins Gleichgewicht bringen.
  2. Massenspektrometrie
    1. Verwenden Sie ein Hybrid-Triple-Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer, das im negativen ESI-Modus arbeitet. Steuern Sie den Systembetrieb und die Datenerfassung mit der mitgelieferten Analysesoftware. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Optimieren Sie die Quellparameter durch Fließinjektionsanalyse des internen Standardgemisches. Stellen Sie dementsprechend die Ionensprühspannung = -4,5 kV, die Quellentemperatur (TEM) = 450 °C, das kollisionsaktivierte Dissoziationsgas (CAD) = 3 psi ein. Verwenden Sie Stickstoffgas als Kollisionsgas und stellen Sie das Zerstäubergas (GS1) = 24 psi, das Hilfsgas (GS2) = 21 psi und das Vorhanggas (CUR) = 30 psi ein.
    3. Stellen Sie die verbindungsabhängigen Ionenpfadparameter auf das Declustering-Potential (DP) = -42 V, das Eintrittspotenzial (EP) = -6 V und das Kollisionszell-Austrittspotential (CXP) = -12 V ein, optimiert durch kontinuierliche Infusion der internen Standard-Gemischlösung. Aufzeichnung vollständiger Produktspektren zusammen mit MRM-Übergängen von Vorläufern zu Produkten mit unterschiedlicher Kollisionsenergie (CE) von 12 eV bis 40 eV für die Fragmentierungsanalyse mit der im Massenspektrometer verfügbaren EPI-Scanfunktion.
      HINWEIS: Die MRM-getriggerte IDA-basierte EPI zeichnet gleichzeitig das Vorläufer-Ionenprodukt, das Ionen-Scanning und die On-the-fly-MS/MS-Erfassung auf. Die MRM verengte den Ionenscanbereich in Quadrupol 1 (Q1) und die Ionenfalle erhöhte die Anzahl der Ionenfragmente, die Q2 durchliefen, wodurch die qualitative Fähigkeit der Quadrupol-MS/MS erheblich verbessert wurde, insbesondere für die Erfassung aller Fragmente, die aus dem Vorläuferion entstehen. Im EPI-Modus werden in Q3 mehrere Fragmentionen, die aus den Vorläuferionen entstehen, mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis detektiert.
    4. Führen Sie MRM-Experimente mit CE von 39 eV durch, um eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen. Begrenzen Sie die maximale Anzahl von MRM auf 75 und die Verweilzeit auf 30 ms, um die MRM eines bestimmten Moleküls, das zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Laufs aus der chromatographischen Säule eluiert, zu erkennen und aufzuzeichnen. Dadurch erhöht sich die Einschaltdauer der Maschine.
    5. Führen Sie eine experimentelle Abstimmung durch, um die besten Ionisationsparameter für PA zu bestimmen, wie oben beschrieben. Für dieses Experiment stellen Sie die Ionensprühspannung = -4,5 kV, die Quellentemperatur (TEM) = 450 °C, das kollisionsaktivierte Dissoziationsgas (CAD) = 3 psi ein. Verwenden Sie Stickstoffgas als Kollisionsgas. Stellen Sie das Verneblergas (GS1) = 24 psi, das Hilfsgas (GS2) = 21 psi und das Vorhanggas (CUR) = 30 psi ein.
    6. Untersuchen Sie alle Abstimmungsdaten manuell, um die richtige Auswahl der Ionisationsparameter und der Produktionsionen sicherzustellen. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl des Produkts die Minimierung potenzieller Interferenzen zwischen MRM-Kanälen. Die experimentellen Parameter, die für die Analyse aller PA-Molekülspezies verwendet wurden, sind in Tabelle 4 dargestellt.
      HINWEIS: Das hybride lineare Ionenfallen-Massenspektrometer mit Triple-Quadrupol ermöglicht es uns, den MRM-Scan-Modus mit der Ionenfallen-Scan-Funktion zu kombinieren und so ein schnelles und hohes Scannen zu ermöglichen, indem Methoden wie der EPI-Scan zur Aufzeichnung nützlicher Tandem-Massenspektren jedes detektierten Vorläufers verwendet werden. Um unterschiedliche molekulare Spezies von PA zu identifizieren, haben wir in dieser Studie diesen MRM-EPI-basierten MS/MS-Ansatz genutzt, der auf dem konventionellen Triple-Quadrupol-Ionenweg mit der EPI-Scanning-Eigenschaft der Ionenfalle basiert, die von der Analysesoftware gesteuert wird.

Ergebnisse

Bestimmung der Linearität der Messung in MS. Linearität ist die Fähigkeit der MS-Methode, Ergebnisse zu liefern, die direkt proportional zur Konzentration des Lipidanalyten sind. Die Linearität hängt ab von (a) der Ionisationseffizienz des Lipidanalyten und (b) dem Ionisationsverhalten des Lipidanalyten bei unterschiedlichen Konzentrationen hängt von der verwendeten Ionenquelle ab. Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI), die in dieser Studie verwendet wird, bleibt d...

Diskussion

Eine Reihe von Beweisen konvergiert mit mehreren Rollen von Signallipiden bei der Regulierung der Organisation und Funktion von Drosophila-Photorezeptoren. Zusätzlich zu der gut untersuchten Rolle von Lipiden bei der Regulierung der Phototransduktion3 wurden Signallipide auch mit dem Proteintransport und der subzellulären Organisation in Verbindung gebracht 23,30,39,40,41.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die in diesem Manuskript beschriebene Arbeit wurde unterstützt vom Department of Atomic Energy der indischen Regierung (Project Identification No. RTI 4006), das Department of Biotechnology der indischen Regierung (BT/PR4833/MED/30/744/2012) und ein India Alliance Senior Fellowship (IA/S/14/2/501540) an PR. Wir danken der NCBS Mass Spectrometry Facility, insbesondere Dr. Dhananjay Shinde und den Mitgliedern des PR-Labors für ihre Beiträge zur Entwicklung dieser Methoden.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 N methanolic HCLFor total lipid isolation
0.88% KClSigma AldrichP9541For total lipid isolation
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tubesEppendorf,022431081/022431102For total lipid isolation
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polar lipids999974Lipid Internal Standard
37% pure HClSigma Aldrich320331For total lipid isolation
96-well plateTotal Organic Phosphate assay
AcetoneFisher Scientific32005For dissections
Ammonium molybdateTotal Organic Phosphate assay
Ascorbic AcidTotal Organic Phosphate assay
Bath sonicator
BEH300 C18 column [1.0 mm x 100mm x 1.7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Blade holderFine Scientific Tools10052-11For dissections
BOD incubatorTotal Organic Phosphate assay
Breakable bladesFine Scientific tools10050-00For dissections
Butter paperGE healthcare10347671For dissections
C4, 300 A0, [1.7 μm x1 mm x 100 mm] columnWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Chromatography amber color glass vials with insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polar lipids860517Lipid Internal Standard
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polar lipids850172Lipid Internal Standard
Dissecting microscopesOlympusSZ51For dissections
Dry heat bath.
Eluent AHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (68:30:2) , for LC
Eluent BHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (70:20:10), for LC
Filter paperIndica-HM274039For dissections
FlasksBorosilFor dissections
FliesNANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab kitchen, composition: corn flour 80 g/L, D-glucose 20 g/L, sucrose 40 g/L, agar 8 g/L, yeast extract 15 g/L, propionic acid 4 mL, TEGO (methyl para hydroxybenzoate) 0.7 g/L, orthophosphoric acid 0.6 mL)
ForcepsFine Scientific Tools11254-20For dissections
Fume hood
FunnelBorosilFor dissections
Glacial acetic acidFisher ScientificA35-500For derivatization
Glass bottles: transparent and amber colorFor total lipid isolation
High-temperature-resistant phosphate-free glass tubes.Total Organic Phosphate assay
Homogenization tubes with zirconium oxide beadsFor total lipid isolation
Homogenizer instrumentPrecellys
Humidified CO2 connected to fly padsFor fly pushing
Illumination controlled incubatorsPanasonic SanyoMIR-553For fly rearing
Initial organic mixturemethanol:chloroform (2:1), For total lipid isolation
LC-MS grade ChloroformSigma Aldrich650498For total lipid isolation
LC-MS grade MethanolSigma Aldrich34860For total lipid isolation
LC-MS grade waterSigma Aldrich34877For total lipid isolation
Light meterHTC instrumentsLX-103
Low retention tipsEppendorf0030072006/72014/72022/72030For total lipid isolation
LTQ Orbitrap XL instrumentThermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
Lysophosphatidic acid (LPA)- 13:0Avanti polar lipidsLM-1700Lipid Internal Standard
Lysophosphatidic acid (LPA)- 17:1Avanti polar lipidsLM 1701Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -13:0Avanti polar lipidsLM-1600Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -17:1Avanti polar lipids855677Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC)- 19:0Avanti polar lipids855776Lipid Internal Standard
Perchloric acid.Total Organic Phosphate assay
Phosphate standard potassium dihydrogen phosphateTotal Organic Phosphate assay
Phosphate-buffered saline (PBS)NANAComposition: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Phosphatidic acid (PA)- 12:0/13:0Avanti polar lipids, LM-1400 Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1404Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-(17:0/17:0)Avanti polar lipids830856Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-16:0-D31/18:1Avanti polar lipids860453Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC) -12:0/13:0Avanti polar lipidsLM-1000Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1004Lipid Internal Standard
Phosphatidylethanolamine (PE) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-110Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol (PI) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1504Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1904Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1901Lipid Internal Standard
Robotic nanoflow ion sourceTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
Silicone padsFor dissections
solvent A0.1% formic acid in water, for LC
solvent B0.1% formic acid in acetonitrile, for LC
Table-top centrifuge
Thermo-mixer
TMS-diazomethaneAcrosAC385330050For derivatization
Triple quadrupole mass spectrometerAB SciexQTRAP 6500
UPLC systemWaters Acquity
Vacuum centrifugal concentratorScanvac , Labogene
Vortex machine

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