Method Article
يصف هذا العمل تطوير أقطاب كهربائية مرنة متداخلة للتنفيذ في نماذج أورام المخ 3D ، أي في الثقافة المختبرية ، في نموذج البويضة ، وفي نموذج الفئران في الجسم الحي . يمكن استخدام الطريقة المقترحة لتقييم آثار المجالات الكهربائية النبضية على الأورام بمستويات مختلفة من التعقيد.
يصعب القضاء على الورم الأرومي الدبقي بعلاجات الأورام القياسية بسبب درجة غزوه العالية. تعتبر العلاجات الكهربائية الحيوية القائمة على المجالات الكهربائية النبضية (PEFs) واعدة لتحسين كفاءة العلاج. ومع ذلك ، فإنها تعتمد على أقطاب صلبة تسبب أضرارا حادة ومزمنة ، خاصة في الأنسجة الرخوة مثل الدماغ. في هذا العمل ، تم استخدام الإلكترونيات المرنة لتوصيل PEFs إلى الأورام وتم تقييم الاستجابة البيولوجية باستخدام المجهر الفلوري. تم طلاء أقطاب الذهب المتداخلة على ركيزة رقيقة وشفافة من الباريلين-C بالبوليمر الموصل PEDOT: PSS ، مما أدى إلى جهاز متوافق ومتوافق حيويا. تم فحص آثار PEFs على الأورام وبيئتها المكروية باستخدام نماذج بيولوجية مختلفة. أولا ، تم استزراع أحاديات الطبقة من خلايا الورم الأرومي الدبقي فوق الأقطاب الكهربائية للتحقيق في الظواهر في المختبر. كخطوة وسيطة ، تم تطوير نموذج في البويضات حيث تم تطعيم كرويات الورم المهندسة في الغشاء الجنيني للسمان. بسبب عدم وجود جهاز مناعي ، أدى ذلك إلى أورام شديدة الأوعية الدموية. في هذه المرحلة المبكرة من التطور ، ليس للأجنة جهاز مناعي ، ولا يتم التعرف على الأورام كأجسام غريبة. وبالتالي ، يمكن أن تتطور بسرعة أثناء تطوير الأوعية الخاصة بهم من نظام الأوعية الدموية الجنيني الحالي ، والذي يمثل نموذجا ثمينا للسرطان 3D. أخيرا ، تم تقييم توصيل القطب المرن ل PEFs في كائن حي كامل مع نظام مناعي وظيفي ، باستخدام نموذج فأر اصطناعي ، orthograft (داخل الجمجمة). تم تطعيم كرويات الورم في دماغ الفئران الفلورية متعددة الجينات قبل زرع أجهزة القطب العضوي المرنة. مكنت نافذة الجمجمة المغلقة من التصوير متعدد الفوتونات للورم وبيئته المكروية أثناء العلاج ب PEFs على مدى عدة أسابيع.
الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) هو ورم شديد التوغل وبالتالي يصعب القضاء عليه بالعلاجات القياسية مثل الاستئصال والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. على الرغم من العلاجات متعددة الوسائط ، لا يزال التشخيص سيئا للغاية ويعاني معظم المرضى من تطور المرض في غضون عام واحد من التشخيص 1,2. في الآونة الأخيرة ، أظهر تطوير العلاجات الكهربائية الحيوية إمكانات كبيرة لتحسين العلاجات الحالية. تستخدم هذه العلاجات توصيل المجالات الكهربائية النبضية (PEF) ، عادة في جلسة علاج واحدة ، لتعطيل سلامة الغشاء الخلوي والبيئة المكروية للأورام. يمكن أن يكون اضطراب غشاء الخلية هذا ، المعروف أيضا باسم التثقيب الكهربائي ، قابلا للعكس أو لا رجعة فيه اعتمادا على شدة المجال الكهربائي وعدد النبضات. يتم تطبيق التثقيب الكهربائي الذي لا رجعة فيه (IRE) كتقنية استئصال الأنسجة غير الحرارية التي تسبب فيها النبضات الكهربائية أضرارا قاتلة للأغشية الخلوية مما يؤدي إلى موت الخلايا3. يتم تطبيق التثقيب الكهربائي العكسي في العلاج الكيميائي الكهربائي (ECT) ، وهي تقنية راسخة تتكون من توصيل PEFs بالاشتراك مع أدوية العلاج الكيميائي لتعزيز امتصاص الدواء في الخلايا السرطانية4. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات الحديثة التثقيب الكهربائي للكالسيوم كبديل للعلاج بالصدمات الكهربائية بكفاءة عالية لعلاج السرطان ، وهو أيضا غير مكلف ويؤدي إلى آثار جانبية أقل5. على الرغم من هذه التطورات الواعدة ، يتم تطبيق PEFs بشكل عام باستخدام أقطاب كهربائية معدنية صلبة من المعروف أنها تسبب أضرارا للأنسجةالرخوة 6. الدماغ حساس بشكل خاص لمثل هذه الأجهزة الغازية حيث يؤدي عدم التطابق الميكانيكي إلى حدوث التهاب وتندب نجمي7.
في هذا السياق ، يتم تقديم نظام توصيل PEF مرن بالاشتراك مع نماذج 3D لأورام الورم الأرومي الدبقي ، من التصنيع الدقيق إلى نموذج الفئران. تصنع الأقطاب الكهربائية المطابقة بعمليات تصنيع دقيقة قياسية للأغشية الرقيقة ، بما في ذلك استخدام مواد ناعمة ومتوافقة حيويا مثل parylene-C والذهب و PEDOT: PSS 8,9. يتم استخدام تصميم القطب المقسم لتغطية مساحة سطح كبيرة مع الحفاظ على الشفافية الكافية للتصوير بين أصابع القطب10. بالنسبة لنموذج الورم ، يتم إنتاج كرويات ثلاثية الأبعاد لخلايا الورم الأرومي الدبقي التي تعبر عن مراسل مضان مشفر وراثيا باستخدام تباين في طريقة لوحة 96 بئرا المتراكبةالسائلة 11. يتم تطعيم الكرات في الغشاء المشيمي لجنين السمان ، مما ينتج عنه نموذج في البويضة تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة تكوين الأوعية أو علم السموم الدوائية12،13. يمكن تطعيم الأورام والأوعية الدموية بواسطة الأوعية الدموية للجنين في غياب جهاز المناعة في هذه المرحلة من التطور الجنيني12. ثم يتم وضع أقطاب كهربائية مرنة فوق الورم الوعائي لدراسة تأثير توصيل PEF على الكرة الأرضية والأوعية الدموية. أخيرا ، يتم التحقيق في هذه التأثيرات على كائن حي كامل ، بما في ذلك البيئة المكروية للورم والجهاز المناعي ، عن طريق زرع كرويات مهندسة في حمة الدماغ لنماذجالفئران 14. يتم وضع أقطاب كهربائية مرنة أعلى موقع الإدخال ويتم إغلاق حج القحف بنافذة زجاجية ، مما يسمح بالتصوير المتكرر ثنائي الفوتون على مدار عدة أسابيع.
ستكون هذه الطرق مفيدة للأشخاص المهتمين بمجالات مختلفة تتراوح من هندسة الإلكترونيات الدقيقة إلى تطبيقات الأورام. يمكن استخدام بروتوكول التصنيع الدقيق وتكييفه لأي تطبيق يتطلب أقطاب معدنية رقيقة مغلفة ب PEDOT: PSS. علاوة على ذلك ، فإن النماذج البيولوجية التي تم تطويرها لتقييم العلاجات الكهربائية المضادة للأورام ستكون ذات أهمية عامة للتحقيق في تمايز الاستجابة الخلوية والأوعية الدموية والمناعية للمواد المزروعة.
تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للتشريع الفرنسي ووفقا لتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية المؤرخ 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) لرعاية واستخدام المختبر. تم ترخيص البحث على الحيوانات من قبل إدارة الخدمات Vétérinaires des Bouches-du-Rhône وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة الأخلاقية في بروفانس كوت دازور (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. التصنيع الدقيق للجهاز المرن (الشكل 1)
2. توليد خط الخلية المستقرة GCaMP6f الورم الأرومي الدبقي
نماذج 3.3D
4. توصيل وتصوير المجال الكهربائي النبضي (PEF)
يسمح هذا البروتوكول بالتطبيق على نموذجين من الورم الأرومي الدبقي يتم فيهما دمج نظام توصيل PEF مرن. بعد خطوات التصنيع الدقيق والتعبئة ، يتم تمييز الأقطاب الكهربائية المرنة في محلول ملحي بواسطة التحليل الطيفي للمعاوقة الكهروكيميائية (EIS) لتقييم أدائها والتحقق من صحته. تظهر الأقطاب الكهربائية المطلية ب PEDOT: PSS المناطق النموذجية التي تهيمن عليها السعة والمقاومة مفصولة بتردد قطع ، بينما تعرض الأقطاب الكهربائية غير المطلية سلوكا سعويا فقط (الشكل 2).
يتم استخدام تباين في طريقة لوحة 96 بئر تراكب السائل لزراعة أورام 3D مصنوعة من خلايا الورم الأرومي الدبقي المنقولة بثبات معبرة عن مراسل الكالسيوم داخل الخلايا الفلورية. يمكن ملاحظة نمو الأجسام الكروية باستخدام مجهر المجال الساطع (الشكل 3 ؛ إد 0). هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2 أو 3 أيام للحصول على كروية كروية وكثيفة ، وهذا يتوقف على خط الخلية وعدد الخلايا المصنفة.
في نموذج البويضة ، يتم تطعيم الأجسام الكروية في الغشاء المشيمي الألانتوي لجنين السمان (الشكل 3 ؛ الشكل 3 ؛ إد 6). يمكن تقييم نجاح الكسب غير المشروع بواسطة الفحص المجهري الفلوري بعد بضعة أيام ، حيث تحتوي الخلايا الحية على الكالسيوم داخل الخلايا ، وبالتالي فهي فلورية (الشكل 3 ؛ إد 9). يمكن ملاحظة الأوعية الدموية للورم تحت المجهر الفلوري عن طريق حقن صبغة فلورية في الأوعية الدموية (الشكل 3 ؛ ED9). ومع ذلك ، قد لا يكون من الممكن دائما تصور الأوعية الدموية داخل الورم لأن الكرة الكروية كثيفة للغاية. يتم وضع الأقطاب الكهربائية المرنة المتداخلة فوق الورم الوعائي (الشكل 3; ED 9) ومتصلة بمولد النبض. يجب وضع المسبار برفق لتجنب نزيف الجنين ؛ خلاف ذلك ، يمكن أن تنتشر صبغة الفلورسنت ، مما يعيق أي ملاحظة عن طريق التصوير. يمكن التحقق من التوصيل الصحيح للنبضة إلى البيئة البيولوجية عن طريق قياس التيار الذي يمر عبر الدائرة. يسمح تصوير هذه النماذج في البويضات بالمراقبة في الوقت الفعلي لتأثير PEFs على الكالسيوم داخل الخلايا في ورم الورم الأرومي الدبقي 3D ، بالإضافة إلى تضيق الأوعية الناجم عن الأوعية الدموية للورم ، وتجنب أي تأثير لأنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الجهاز المناعي15.
يمكن أيضا إجراء دراسة تأثير PEF على الورم الأرومي الدبقي في نموذج أكثر اكتمالا وتنبؤا. في الواقع ، يتكون النموذج في الجسم الحي الموصوف أعلاه14 من تطعيم ورم أرومي دبقي ثلاثي الأبعاد في حمة الدماغ للفأر (الشكل 4). يتم توصيل موقع حقن الورم بواسطة حبة هيمي جل ديكستران متقاطعة ، لتلخيص القيود الفيزيائية الحيوية الفسيولوجية أثناء نمو الورم. على الرغم من وصفها في المرجع14 ، يجدر إعادة التأكيد على أنه من الأهمية بمكان أن يتم لصق حبة هيمي ديكستران بدقة على الأم الجافية. خلاف ذلك ، يمكن للورم الهروب من خلال الجافية المفتوحة وتغطية الدماغ بالكامل ، مما يجعل التصوير مستحيلا. بالنسبة لأي تصوير مزمن ، يشكل نمو الأنسجة الذي يحدث أثناء شفاء نافذة الجمجمة حاجزا خطيرا ، حيث أن الأنسجة الجديدة غير شفافة وتجعل الصور ضبابية أو غير قابلة للاستخدام. لذلك ، بعد إدخال حبة hemi ولصقها ، يجب إغلاق الجدران الجانبية لنافذة الجمجمة المفتوحة بطبقة رقيقة من superglue موضوعة بدقة في جميع أنحاء جدار التجويف ، دون ترك الغراء الفائق ينزلق أو يتدفق على الجافية. عندما يتم وضع المسبار المرن أعلى موقع حقن الورم ، لا يمكن أن تبقى أي فقاعات تحت المسبار ، لسببين. أولا ، لا يمكن أن يستمر التصوير عند وجود فقاعات. ثانيا ، تعمل الفقاعات كعوازل ، وبالتالي تغيير خصائص التحفيز الكهربائي. بعد اتخاذ الاحتياطات الموضحة أعلاه ، يتم إغلاق حج القحف بنافذة زجاجية مثبتة على الجمجمة للسماح بالتصوير المزمن على مدار أسابيع. نظرا لأن الورم يتكون من خلايا تعبير GCaMP أو DsRed ، يمكن تأكيد الحقن باستخدام مجهر مضان. يجب قياس المعاوقة الكهروكيميائية للأقطاب الكهربائية للتحقق من صحة الأداء بعد الزرع. بالمقارنة مع المعاوقة في المحلول الملحي ، من المتوقع زيادة المعاوقة في الجسم الحي عند ترددات أعلى من 100 هرتز بسبب وجود بيئة بيولوجية (الشكل 5). يمكن ملاحظة الحمة العصبية الوعائية وتسلل الورم وتمييزها من خلال الركيزة الشفافة على مدار أسابيع بواسطة المجهر ثنائي الفوتون (الشكل 6). يمكن أن يسمح استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في الخلايا ذات الأهمية (الخلايا المناعية والخلايا العصبية) ، على سبيل المثال ، بإظهار الحد الأدنى من العملية الالتهابية التي يسببها زرع القطب وحده (الشكل 6 أ) أو إظهار وجود الخلايا الدبقية الصغيرة والوحيدات بعد 26 يوما من زرع قطب كهربائي محفز PEF مزروع فوق ورم GBM المتنامي (الشكل 6B1 ). في الحالة الأخيرة ، تم العثور على كل من الخلايا المشتقة من الخلايا الطرفية والخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ حول الورم وداخله (الشكل 6B2). في يوم تسليم PEF ، يمكن توصيل وسادات الاتصال للأقطاب الكهربائية المرنة بمولد النبض ، مباشرة تحت المجهر ثنائي الفوتون. بشكل عام ، يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في تأثير العلاجات الكهربائية الحيوية بمرور الوقت باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا المشاركة في تطور ورم المخ ، حتى عمق حوالي 500 ميكرومتر.
الشكل 1: التصنيع الدقيق للأقطاب الكهربائية المرنة . (أ) نقش قطب الذهب وركيزة الباريلين C. (ب) افتتاح المخطط التفصيلي. (ج) PEDOT: طلاء PSS. (د) التوصيلات والتعبئة والتغليف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحليل الطيفي للمعاوقة الكهروكيميائية لأقطاب الذهب المرنة و PEDOT: أقطاب كهربائية باردة مغلفة ب PSS في محلول ملحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: نموذج البويضات للورم الأرومي الدبقي. ED 0: كروي لوحظ بمجهر المجال الساطع. ED 3: قذيفة أقل ثقافة جنين السمان بعد 3 أيام من الفتح. ED 6: الورم المزروع في الطب التكميلي والبديل لوحظ باستخدام مجهر المجال الساطع. ED 9: جهاز مرن يوضع على الورم الوعائي (ورم باللون الأخضر والأوعية الدموية باللون الأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التطبيق في الجسم الحي. أ: مخطط التجارب في الجسم الحي. (ب) وضع المسبار قبل وضع غطاء زجاجي وراتنج أكريليك. (ج) زرع مسبار مكتمل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل الطيفي للمعاوقة الكهروكيميائية لأقطاب الذهب المرنة في محلول ملحي مقارنة بمسبار مزروع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التصوير ثنائي الفوتون متعدد الأطياف داخل الجسم من خلال أقطاب كهربائية . (أ) صورة مبلطة لسطح الدماغ السليم في فأر تحكم متعدد الفلورسنت AMU-Neuroinflam بعد 3 أيام من زرع القطب الكهربائي. يظهر السماوي التشجير الشجيري للخلايا العصبية الهرمية من الطبقة 5 ، ويظهر اللون الأخضر الخلايا المحببة والوحيدات المجندة ، ويظهر اللون الأصفر الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة والخلايا المتغصنة. يظهر اللون الوردي انتشار الأشعة تحت الحمراء بسبب تراكم الحرارة. (ب1) صورة مماثلة كما في A ولكن بعد 26 يوما من زرع الورم الكروي 200 ميكرومتر عميق داخل القشرة تليها مباشرة زرع القطب الكهربائي. لاحظ تراكم الخلايا المناعية الخضراء والصفراء. (ب2) صورة مماثلة كما في B1 ولكن 100 ميكرومتر تحت سطح الأقطاب الكهربائية. لاحظ وجود التشجير الشجيري العصبي الأزرق في محيط كتلة الورم الأحمر نفسها التي تسللت إليها الخلايا الدبقية الصفراء والخلايا المتغصنة. يظهر اللون الأزرق الغامق إشارة توافقية ثانية من الكولاجين حول الورم. (ب 3) عرض مكبر ل B2 يظهر وجود ورم بين الخلايا العصبية (يشار إليه بالأسهم) بالقرب من الورم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتيح النهج الموصوف في هذا العمل لنماذج أورام المخ مع نظام توصيل PEF متكامل دراسة تأثير PEFs على مستويات مختلفة من التنظيم البيولوجي. يتكون بروتوكول التصنيع الدقيق من عمليات الأغشية الرقيقة القياسية ، والتي توفر درجة كبيرة من الحرية في تصميم القطب الكهربائي الذي يمكن تكييفه مع التطبيق المحدد. في بعض الأحيان ، يمكن أن تكون خطوة التلدين الحراري الإضافية مفيدة في نهاية التصنيع ، لتقليل انحناء الأقطاب الكهربائية التي حدثت أثناء التصنيع.
إن استخدام خط خلايا الورم الأرومي الدبقي المستقر الذي يعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري يتجنب جميع المضاعفات المرتبطة بتوصيل الصبغة والاحتفاظ بها ، خاصة في الأورام ثلاثية الأبعاد الكثيفةجدا 16. في الواقع ، لوحظ مستوى تعبير مرتفع على مدى فترة طويلة مقارنة بمؤشرات الكالسيوم الفلورية الكيميائيةالقياسية 17. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على خطوط الخلايا المختلفة ، حيث يستخدم عادة لتصوير النشاط العصبي11. هنا ، تم استخدام خطوط الخلايا البشرية والفئران (U87 و Gl261 للزرع في الفئران التي تعاني من نقص المناعة أو المناعة ، على التوالي). في الواقع ، أظهرت الدراسات الحديثة أن خط خلية U87 يختلف عن خط الخلايا الأصلية حيث تم اكتساب العديد من الطفرات على مدار سنوات من زراعة الخلايا ، مما أثر على التكاثر التجريبي18. الطريقة المستخدمة لإعداد أورام 3D عالية الإنتاجية ، قابلة للتكرار ، وتسمح بتوليد كرويات بحجم معين اعتمادا على خط الخلية ، وعدد الخلايا عند البذر ، ووقت النمو19. ومع ذلك ، فإن هذه الأجسام الكروية كثيفة ، مما يمثل عيبا عند التصوير في قلب الورم.
نموذج في البويضة مفيد كنهج أول لدراسة تأثير PEF على أورام 3D والأوعية الدموية ، دون تفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الدماغ. هذا النموذج غير مكلف وسريع وعالي الإنتاجية ويثير قضايا أخلاقية أقل من النماذج الحيوانية. من المهم الحفاظ على سلامة الجنين طوال التجربة بأكملها ، حيث يمكن أن يؤثر ذلك على بقائه وجودة التصوير. يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء فتح بيضة السمان ، لتجنب الأضرار التي لحقت الغشاء الجنيني. يجب أيضا إجراء الكسب غير المشروع ووضع الأقطاب الكهربائية المرنة بعناية ، لتجنب النزيف الذي يمكن أن يقتل الجنين. يسمح حقن صبغة الفلورسنت في الأوعية الدموية بالتصور المتزامن للخلايا السرطانية والأوعية الدموية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يجب إجراء الحقن داخل العين بعناية لتجنب تسرب الصبغة إلى السائل الجنيني ، مما قد يتسبب في حدوث مضان متبقي في الخلفية يؤدي إلى تدهور جودة التصوير. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لمتابعة امتصاص الدواء ، لأنه يسمح بالوصول إلى الدورة الدموية. ومع ذلك ، فإن التجارب محدودة بوقت بقاء الجنين لمدة 12 يوما ، مما يسمح ب 7 أيام من المراقبة ، وهو أقصر بكثير من النموذج21 في الجسم الحي.
يمكن مراقبة نموذج ورم الدماغ في الجسم الحي لمدة 4 إلى 5 أسابيع قبل أن تصل الحيوانات إلى نقطة نهاية تجريبية أخلاقية يحددها فقدان الوزن المفاجئ بنسبة 20٪. إنه جيد التحمل ويظل في مكانه إذا لم يكن ذيل توصيل القطب طويلا جدا. خلاف ذلك ، تميل الحيوانات إلى خدش موصل التقليب ، والذي قد يتمزق في النهاية ، وبالتالي يمنع الاتصال اللاحق بالمحفز. ومع ذلك ، فإن فترة 4 أسابيع هذه ذات قيمة لتغطية المراحل المختلفة لتطور الورم الأرومي الدبقي. عند مقارنة كثافة الخلايا السرطانية في نفس حجم الاهتمام على فترات زمنية مختلفة ، يمكن ملاحظة تطور حركية نمو الورم. على وجه الخصوص ، لوحظ نمو الورم المعزز في وقت التبديل المناعي22. دراسة مماثلة في وجود قطب كهربائي محفز من شأنه أن يفيد في تأثير PEF على معدل انتشار الورم وحساسية الورم للقضاء المناعي. بالمقارنة مع نموذج البويضات ، يمكن اعتبار النموذج في الجسم الحي نموذجا قيما قبل السريري لدراسة تأثير الخلايا المناعية على تطور الورم ومساهمتها في التأثير العلاجي ل PEF. تم تكييف هذا البروتوكول من مقال سابق مع إضافة جهاز قطب كهربائي مرن على الورم قبل وضع نافذة الجمجمة14. يمكن وصف كل من العلاجات الكهربائية الحيوية الحادة والمزمنة للأورام بالملاحظات المباشرة واللاحقة باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون نظرا لأنه من المتوقع أن يؤدي التحفيز الأولي إلى موت الخلايا ويؤدي إلى خلل دائم في الاستجابة المناعية.
يمكن الوصول بسهولة إلى وصلات المسبار المرن تحت المجهر ثنائي الفوتون. وبالتالي يمكن تعديل معلمات التحفيز الكهربائي في الوقت الفعلي بناء على التأثير الملحوظ على الأنسجة العصبية و / أو الخلايا المستهدفة ، على غرار الطريقة التي يقوم بها الطبيب بإجراء الإجراءات التدخلية أثناء مراقبة صور التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب لمريضه. الاعتبار الأخير هو أهمية الختم الدقيق للقطب الكهربائي على الدماغ باستخدام الغراء الفائق وغراء السيليكون لمنع إعادة نمو الأنسجة.
في الختام ، يمثل البروتوكول الموصوف هنا نموذجا مبتكرا لدراسة تأثير علاج PEF مع أقطاب البوليمر العضوية المرنة لنماذج ورم الورم الأرومي الدبقي. يظهر النموذجان مستويات مختلفة من التعقيد بحيث يمكن فصل التأثيرات الخلوية أو الوعائية أو المناعية لفهم آليات العمل بشكل أفضل. تقلل الأقطاب الكهربائية السطحية المطابقة من الضرر علاجي المنشأ مع تمكين تعطيل البيئة المكروية للورم ، مما يؤدي إلى تضيق الأوعية أو عدم تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا15.
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
تم دعم العمل المبلغ عنه هنا من قبل الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-18-CE19-0029). يشكر المؤلفون بحرارة S.M. Bardet لمساهمتها في توليد خط خلية GCaMP6f مستقر و D. O'Connor لمساعدتها في نموذج البيض .
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
96-well plate | Falcon | 353075 | |
Acetone | Technic | 530 | |
Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
agarose | Sigma | A9539 | |
autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
Buprenorphine | Axience | ||
Carprofen | Rimadyl | ||
Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
Flask | Greiner | 658170 | |
Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
Lab made pulse generator | |||
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
Plastic mask | Selba | ||
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
Propan-2-ol | Technic | 574 | |
Protolaser S | LPKF | ||
puromycin | Gibco | A11103 | |
Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
spin coater | Süss Microtec | ||
Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
Super glue | Office depot | ||
tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved