Method Article
Este trabalho descreve o desenvolvimento de eletrodos interdigitalizados flexíveis para implementação em modelos de tumores cerebrais 3D, a saber, cultura in vitro , modelo in ovo e modelo murino in vivo. O método proposto pode ser utilizado para avaliar os efeitos de campos elétricos pulsados em tumores em diferentes níveis de complexidade.
O glioblastoma é difícil de erradicar com terapias oncológicas padrão devido ao seu alto grau de invasividade. Os tratamentos bioelétricos baseados em campos elétricos pulsados (PFE) são promissores para a melhoria da eficiência do tratamento. No entanto, eles dependem de eletrodos rígidos que causam danos agudos e crônicos, especialmente em tecidos moles, como o cérebro. Neste trabalho, eletrônica flexível foi utilizada para entregar PEFs aos tumores e a resposta biológica foi avaliada com microscopia fluorescente. Eletrodos de ouro interdigitalizados em um substrato fino e transparente de parileno-C foram revestidos com o polímero condutor PEDOT:PSS, resultando em um dispositivo conformável e biocompatível. Os efeitos dos PEFs sobre os tumores e seu microambiente foram examinados usando vários modelos biológicos. Primeiro, monocamadas de células de glioblastoma foram cultivadas em cima dos eletrodos para investigar fenômenos in vitro. Como etapa intermediária, um modelo in ovo foi desenvolvido onde esferoides tumorais modificados foram enxertados na membrana embrionária de uma codorna. Devido à ausência de um sistema imunológico, isso levou a tumores altamente vascularizados. Neste estágio inicial de desenvolvimento, os embriões não têm sistema imunológico e os tumores não são reconhecidos como corpos estranhos. Assim, eles podem se desenvolver rapidamente enquanto desenvolvem seus próprios vasos a partir do sistema vascular embrionário existente, o que representa um valioso modelo de câncer 3D. Finalmente, a entrega flexível de eletrodos de PFE foi avaliada em um organismo completo com um sistema imunológico funcional, usando um modelo singênico de camundongo ortoenxerto (intracraniano). Esferoides tumorais foram enxertados no cérebro de camundongos transgênicos multifluorescentes antes da implantação de dispositivos de eletrodos orgânicos flexíveis. Uma janela craniana selada permitiu a imagem multifóton do tumor e seu microambiente durante o tratamento com PFE durante um período de várias semanas.
O glioblastoma multiforme (GBM) é um tumor altamente invasivo e, portanto, difícil de erradicar com tratamentos padrão, como ressecção, radioterapia e quimioterapia. Apesar dos tratamentos multimodais, o prognóstico permanece muito ruim e a maioria dos pacientes apresenta progressão da doença em até 1 ano após o diagnóstico 1,2. Recentemente, o desenvolvimento de tratamentos bioelétricos tem mostrado grande potencial para melhorar as terapias existentes. Essas terapias usam a entrega de campos elétricos pulsados (PFE), tipicamente em uma única sessão de tratamento, para interromper a integridade da membrana celular e o microambiente dos tumores. Essa ruptura da membrana celular, também conhecida como eletroporação, pode ser reversível ou irreversível, dependendo da intensidade do campo elétrico e do número de pulsos. A eletroporação irreversível (IRE) é aplicada como uma técnica de ablação tecidual não térmica na qual pulsos elétricos causam danos fatais às membranas celulares, levando à morte celular3. A eletroporação reversível é aplicada na eletroquimioterapia (ECT), uma técnica estabelecida que consiste na administração de PFE em combinação com drogas quimioterápicas para aumentar a captação de drogas em células cancerígenas4. Além disso, estudos recentes demonstraram a eletroporação do cálcio como uma alternativa à ECT com alta eficiência para o tratamento do câncer, que também é barata e induz menos efeitos colaterais5. Apesar desses avanços promissores, os PEFs são geralmente aplicados usando eletrodos rígidos e metálicos que são conhecidos por causar danos aos tecidos moles6. O cérebro é particularmente sensível a tais dispositivos invasivos, onde a incompatibilidade mecânica induz inflamação e cicatrizes astrogliais7.
Nesse contexto, um sistema flexível de administração de PFE em combinação com modelos 3D de tumores de glioblastoma é apresentado, desde a microfabricação até um modelo murino. Os eletrodos conformais são feitos com processos padrão de microfabricação de filme fino, incluindo o uso de materiais macios e biocompatíveis, como parileno-C, ouro e PEDOT: PSS 8,9. Um projeto de eletrodo interdigitado é usado para cobrir uma grande área de superfície, mantendo a transparência adequada para imagens entre os dedos do eletrodo10. Para o modelo tumoral, esferoides 3D de células de glioblastoma expressando um repórter de fluorescência geneticamente codificado são produzidos usando uma variação do método de placa de 96 poços de sobreposição líquida11. Os esferoides são enxertados na membrana corioalantóica de um embrião de codorna, resultando em um modelo in ovo que tem sido amplamente utilizado para estudar angiogênese ou toxicologia medicamentosa12,13. Os tumores podem ser enxertados e vascularizados pela vasculatura do embrião na ausência de um sistema imunológico nessa fase do desenvolvimento embrionário12. Eletrodos flexíveis são então colocados em cima do tumor vascularizado para estudar o efeito da entrega de PFE no esferoide e sua vasculatura. Finalmente, esses efeitos são investigados em um organismo vivo completo, incluindo o microambiente tumoral e o sistema imunológico, implantando esferoides modificados no parênquima cerebral de modelos murinos14. Eletrodos flexíveis são colocados no topo do local de inserção e a craniotomia é selada com uma janela de vidro, permitindo imagens repetidas de dois fótons ao longo de várias semanas.
Esses métodos serão úteis para pessoas interessadas em vários domínios, desde engenharia microeletrônica até aplicações oncológicas. O protocolo de microfabricação pode ser usado e adaptado para qualquer aplicação que exija eletrodos metálicos de filme fino revestidos com PEDOT:PSS. Além disso, os modelos biológicos desenvolvidos para a avaliação de tratamentos elétricos antitumorais serão de interesse geral para a investigação da diferenciação da resposta celular, vascular e imune aos materiais implantados.
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação francesa e em conformidade com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. A pesquisa em animais foi autorizada pela Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône e aprovada pelo comitê de ética da Provence Cote D'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. Microfabricação flexível do dispositivo (Figura 1)
2. Geração de glioblastoma GCaMP6f linhagem celular estável
3.3D modelos
4. Entrega e imagem do Campo Elétrico Pulsado (PEF)
Este protocolo permite a aplicação a dois modelos de glioblastoma nos quais um sistema flexível de entrega de PFE é integrado. Seguindo as etapas de microfabricação e embalagem, eletrodos flexíveis são caracterizados em solução salina por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) para avaliar e validar seu desempenho. Os eletrodos revestidos com PEDOT:PSS mostram as regiões tipicamente dominadas por capacitivo e resistivo separadas por uma frequência de corte, enquanto os eletrodos não revestidos apresentam apenas comportamento capacitivo (Figura 2).
Uma variação do método de placa de 96 poços de sobreposição líquida é usada para cultivar tumores 3D feitos de células de glioblastoma transfectadas expressando de forma estável um repórter de cálcio intracelular fluorescente. O crescimento dos esferoides pode ser observado com um microscópio de campo brilhante (Figura 3; ED 0). Pelo menos 2 ou 3 dias são necessários para obter esferoides esféricos e densos, dependendo da linhagem celular e do número de células semeadas.
No modelo in ovo , os esferoides são enxertados na membrana corioalantóica de um embrião de codorna (Figura 3; ED 6). O sucesso do enxerto pode ser avaliado por microscopia de fluorescência alguns dias depois, uma vez que as células vivas possuem cálcio intracelular, sendo, portanto, fluorescentes (Figura 3; ED 9). A vascularização do tumor pode ser observada em microscópio de fluorescência por injeção de corante fluorescente nos vasos sanguíneos (Figura 3; ED9). No entanto, nem sempre pode ser possível visualizar os vasos sanguíneos dentro do tumor, pois o esferoide é muito denso. Os eletrodos interdigitados flexíveis são colocados sobre o tumor vascularizado (Figura 3; ED 9) e conectado a um gerador de pulso. A sonda deve ser colocada suavemente para evitar sangramento do embrião; caso contrário, o corante fluorescente pode se espalhar, o que obstrui qualquer observação por imagem. A entrega correta do pulso ao ambiente biológico pode ser verificada medindo a corrente que passa pelo circuito. A imagem destes em modelos ovolitros permite o monitoramento em tempo real do efeito das PFE sobre o cálcio intracelular em um tumor de glioblastoma 3D, bem como da vasoconstrição induzida na vasculatura do tumor, evitando qualquer influência de outros tipos celulares, incluindo o sistema imunológico15.
O estudo do efeito do PFE sobre o glioblastoma também pode ser realizado em um modelo mais completo e preditivo. De fato, o modelo in vivo descrito acima14 consiste em enxertar um tumor de glioblastoma 3D no parênquima cerebral de um camundongo (Figura 4). O local de injeção do tumor é entupido por um hemi-grânulo de gel de dextrano reticulado, para recapitular as restrições biofísicas fisiológicas durante o crescimento do tumor. Embora descrito na referência14, vale ressaltar novamente que é criticamente importante que o hemi-cordão de dextrano seja precisamente supercolado à dura-máter; caso contrário, o tumor pode escapar através da dura-máter aberta e cobrir completamente o cérebro, tornando a imagem impossível. Para qualquer imagem crônica, o crescimento do tecido que ocorre à medida que a janela craniana cicatriza representa uma séria barreira, pois o novo tecido não é transparente e torna as imagens nebulosas ou inutilizáveis. Portanto, depois de inserir e colar o hemi-talão, as paredes laterais da janela craniana aberta precisam ser seladas com uma fina camada de supercola meticulosamente colocada ao redor da parede da cavidade, sem deixar a supercola escorregar ou fluir para a dura-máter. Quando a sonda flexível é colocada no topo do local de injeção do tumor, nenhuma bolha pode ficar sob a sonda, por duas razões. Em primeiro lugar, a imagem não pode prosseguir quando as bolhas estão presentes. Em segundo lugar, as bolhas servem como isolantes, alterando assim as propriedades de estimulação elétrica. Depois de tomar as precauções descritas acima, a craniotomia é selada com uma janela de vidro cimentada ao crânio para permitir imagens crônicas ao longo de semanas. Como o tumor consiste em células expressivas GCaMP ou DsRed, a injeção pode ser confirmada com um microscópio de fluorescência. A impedância eletroquímica dos eletrodos deve ser medida para validar o desempenho após a implantação. Em comparação com a impedância em solução salina, espera-se um aumento da impedância in vivo em frequências acima de 100 Hz devido à presença de um ambiente biológico (Figura 5). Parênquima neural vascularizado e infiltração tumoral podem ser observados e caracterizados através do substrato transparente ao longo de semanas por microscopia de dois fótons (Figura 6). O uso de animais transgênicos expressando proteínas fluorescentes em células de interesse (células imunes e neurônios) pode, por exemplo, permitir a demonstração do processo inflamatório mínimo induzido apenas pelo implante de eletrodos (Figura 6A) ou mostrar a presença de micróglia e monócitos 26 dias após o implante de um eletrodo estimulado por PFE implantado em cima de um tumor GBM em crescimento (Figura 6B1 ). Neste último caso, tanto células derivadas de monócitos periféricos quanto células microgliais residentes no cérebro foram encontradas ao redor e dentro do tumor (Figura 6B2). No dia da entrega do FPE, as almofadas de contato dos eletrodos flexíveis podem ser conectadas ao gerador de pulso, diretamente sob o microscópio de dois fótons. No geral, este modelo pode ser usado para investigar o efeito de tratamentos bioelétricos ao longo do tempo usando vários tipos de células envolvidas no desenvolvimento de tumores cerebrais, até uma profundidade de cerca de 500 μm.
Figura 1: Microfabricação de eletrodos flexíveis. (A) Padronização de eletrodos de ouro e substrato de Parileno C. (B) Abertura do esboço. (C) PEDOT: revestimento PSS. (D) Conexões e embalagens. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Espectroscopia de impedância eletroquímica de eletrodos de ouro flexíveis e eletrodos frios revestidos com PEDOT:PSS em uma solução salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O modelo in ovo do glioblastoma. ED 0: Esferoide observado com um microscópio de campo brilhante. ED 3: Shell less culture de um embrião de codorna 3 dias após a abertura. ED 6: Tumor implantado na CAM observado com microscópio de campo brilhante. ED 9: Dispositivo flexível colocado no tumor vascularizado (tumor em verde e vasos sanguíneos em vermelho). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A aplicação in vivo . (A) Esquema para experimentos in vivo. (B) Colocação da sonda antes da aplicação do vidro de cobertura e da resina acrílica. (C) Implantação da sonda concluída. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Espectroscopia de impedância eletroquímica de eletrodos de ouro flexíveis em uma solução salina em comparação com uma sonda implantada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem multiespectral intravital de dois fótons através de eletrodos . (A) Imagem em mosaico da superfície cerebral saudável em um camundongo AMU-Neuroinflam multifluorescente controle 3 dias após o implante do eletrodo. O ciano mostra a arborização dendrítica dos neurônios piramidais da camada 5, o verde mostra granulócitos e monócitos recrutados e o amarelo mostra a micróglia ativada e as células dendríticas. O rosa mostra a difusão infravermelha devido ao acúmulo de calor. (B1) Imagem semelhante à de A, mas 26 dias após o implante esferoide do tumor 200 μm de profundidade dentro do córtex imediatamente seguido de implantação de eletrodo. Observe o acúmulo de células imunes verdes e amarelas. (B2) Imagem semelhante à da B1 , mas 100 μm abaixo da superfície dos eléctrodos. Observe a presença de arborização dendrítica neuronal azul na periferia da própria massa tumoral vermelha infiltrada por micróglia amarela e células dendríticas. O azul profundo mostra um segundo sinal harmônico do colágeno peritumoral. (B3) Vista ampliada de B2 mostrando a presença de somas de interneurônios (indicados por setas) nas proximidades do tumor. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A abordagem descrita neste trabalho permite que modelos de tumores cerebrais com um sistema integrado de entrega de PFE estudem o efeito de PFE em diferentes níveis de organização biológica. O protocolo de microfabricação consiste em processos padrão de filme fino, que proporcionam um grande grau de liberdade no projeto de eletrodos que podem ser adaptados à aplicação específica. Às vezes, uma etapa adicional de recozimento térmico pode ser útil no final da fabricação, para reduzir a flexão dos eletrodos que ocorreu durante a fabricação.
O uso de uma linhagem celular de glioblastoma estável expressando um indicador fluorescente de cálcio evita todas as complicações ligadas à entrega e retenção de corantes, especialmente em tumores 3D muito densos16. De fato, um alto nível de expressão é observado durante um longo período em comparação com os indicadores químicos padrão de cálcio fluorescente17. Esse protocolo pode ser aplicado a várias linhagens celulares, pois é comumente utilizado para a atividade neural de imagem11. Aqui, foram utilizadas linhagens celulares humanas e murinas (U87 e Gl261 para implantação em camundongos imunodeficientes ou imunocompetentes, respectivamente). De fato, estudos recentes mostraram que a linhagem celular U87 é diferente da das células originais, pois muitas mutações foram adquiridas ao longo de anos de cultura celular, afetando a reprodutibilidade experimental18. O método utilizado para a preparação de tumores 3D é de alto rendimento, reprodutível e permite a geração de esferoides de tamanho específico, dependendo da linhagem celular, do número de células na semeadura e do tempo de crescimento19. No entanto, esses esferoides são densos, o que apresenta uma desvantagem ao visualizar o núcleo do tumor.
O modelo in ovo é útil como uma primeira abordagem para estudar o efeito do PFE em tumores 3D e sua vasculatura, sem interações com outros tipos de células que estão presentes no cérebro. Esse modelo é barato, rápido, de alto rendimento e levanta menos questões éticas do que os modelos animais. É importante manter a integridade do embrião durante todo o experimento, pois isso pode afetar sua sobrevivência e a qualidade da imagem. Cuidados especiais devem ser tomados ao abrir o ovo de codorna, para evitar danos à membrana embrionária. O enxerto e a colocação dos eletrodos flexíveis também devem ser realizados com cuidado, para evitar sangramento que possa matar o embrião. A injeção de corante fluorescente nos vasos sanguíneos permite a visualização simultânea das células tumorais e a vascularização com microscopia de fluorescência. A injeção intraocular deve ser realizada com cuidado para evitar que o corante vaze para o líquido embrionário, o que poderia causar uma fluorescência residual no fundo que degrada a qualidade da imagem. Esse modelo também pode ser utilizado para acompanhar a captação de medicamentos, pois permite o acesso ao sistema circulatório. No entanto, os experimentos são limitados pelo tempo de sobrevivência de 12 dias do embrião, permitindo assim 7 dias de observação, o que é significativamente menor do que o modelo in vivo 21.
O modelo de tumor cerebral in vivo pode ser monitorado por 4 a 5 semanas antes que os animais atinjam um desfecho experimental ético determinado por uma súbita perda de peso de 20%. É bem tolerado e permanece no lugar se a cauda de conexão do eletrodo não for muito longa. Caso contrário, os animais tendem a arranhar o conector de viragem, que pode ser rasgado, impedindo assim a conexão subsequente com o estimulador. Este período de 4 semanas é, no entanto, valioso para cobrir os diferentes estágios do desenvolvimento do glioblastoma. Ao comparar as densidades de células tumorais no mesmo volume de interesse em diferentes intervalos de tempo, a evolução da cinética de crescimento tumoral pode ser observada. Em particular, observou-se aumento do crescimento tumoral no momento da troca imune22. Um estudo semelhante na presença de um eletrodo estimulante informaria sobre o efeito do PFE na taxa de proliferação tumoral e na sensibilidade do tumor à eliminação imunológica. Em comparação com o modelo in ovo , o modelo in vivo pode ser visto como um valioso modelo pré-clínico para estudar o impacto das células imunes na progressão do tumor e sua contribuição para o efeito terapêutico do PFE. Este protocolo é adaptado de um artigo anterior com a adição de um dispositivo de eletrodo flexível no tumor antes da colocação de uma janela craniana14. Tanto o tratamento bioelétrico agudo quanto o crônico de tumores podem ser caracterizados por observações diretas e subsequentes com microscopia de dois fótons, uma vez que a estimulação inicial deve induzir a morte celular e desencadear uma desregulação duradoura da resposta imune.
As conexões da sonda flexível são facilmente acessíveis sob o microscópio de dois fótons. Os parâmetros de estimulação elétrica podem, portanto, ser ajustados em tempo real com base no efeito observado no tecido neural e / ou nas células-alvo, semelhante à forma como um médico realizaria procedimentos intervencionistas ao observar imagens de ressonância magnética ou tomografia computadorizada de seu paciente. Uma consideração final é a importância da vedação cuidadosa do eletrodo no cérebro com supercola e cola de silicone para evitar o crescimento do tecido.
Em conclusão, o protocolo aqui descrito representa um modelo inovador para estudar o efeito da terapia com PFE com eletrodos de polímero orgânico flexíveis para modelos tumorais de glioblastoma. Os dois modelos exibem diferentes níveis de complexidade, de modo que os efeitos celulares, vasculares ou imunológicos podem ser separados para uma melhor compreensão dos mecanismos de ação. Eletrodos conformais e superficiais reduzem o dano iatrogênico ao mesmo tempo em que possibilitam a ruptura do microambiente tumoral, desencadeando vasoconstrição ou desregulação do cálcio intracelular15.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
O trabalho aqui relatado foi apoiado pela Agência Nacional de Pesquisa da França (ANR-18-CE19-0029). Os autores agradecem calorosamente a S.M. Bardet por sua contribuição para a geração de uma linhagem celular GCaMP6f estável e a D. O'Connor por sua ajuda com o modelo in ovo .
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
96-well plate | Falcon | 353075 | |
Acetone | Technic | 530 | |
Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
agarose | Sigma | A9539 | |
autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
Buprenorphine | Axience | ||
Carprofen | Rimadyl | ||
Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
Flask | Greiner | 658170 | |
Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
Lab made pulse generator | |||
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
Plastic mask | Selba | ||
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
Propan-2-ol | Technic | 574 | |
Protolaser S | LPKF | ||
puromycin | Gibco | A11103 | |
Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
spin coater | Süss Microtec | ||
Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
Super glue | Office depot | ||
tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
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