التئام جروح قرنية الزرد: من التآكل إلى تحليل التصوير لإغلاق الجرح

Summary

يركز هذا البروتوكول على إتلاف سطح العين لسمك الزرد من خلال التآكل لتقييم إغلاق الجرح اللاحق على المستوى الخلوي. يستغل هذا النهج نتوء العين لإزالة ظهارة القرنية جزئيا ويستخدم المجهر الإلكتروني الماسح لتتبع التغيرات في مورفولوجيا الخلية أثناء إغلاق الجرح.

Abstract

باعتبارها السطح الشفاف للعين ، فإن القرنية مفيدة للرؤية الواضحة. بسبب موقعه ، هذا النسيج عرضة للإهانات البيئية. في الواقع ، فإن إصابات العين الأكثر شيوعا التي تتم مواجهتها سريريا هي تلك الموجودة في القرنية. في حين تمت دراسة التئام جروح القرنية على نطاق واسع في الثدييات الصغيرة (أي الفئران والجرذان والأرانب) ، فقد أهملت دراسات فسيولوجيا القرنية الأنواع الأخرى ، بما في ذلك الزرد ، على الرغم من أن أسماك الزرد هي نموذج بحثي كلاسيكي.

يصف هذا التقرير طريقة لإجراء تآكل القرنية على سمك الزرد. يتم تنفيذ الجرح في الجسم الحي على الأسماك المخدرة باستخدام نتوء العين. تسمح هذه الطريقة بجرح ظهاري قابل للتكرار ، تاركا بقية العين سليمة. بعد التآكل ، يتم مراقبة إغلاق الجرح على مدار 3 ساعات ، وبعد ذلك يتم إعادة ظهارة الجرح. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، متبوعا بمعالجة الصور ، يمكن التحقيق في شكل الخلية الظهارية ، والنتوءات القمية لدراسة الخطوات المختلفة أثناء إغلاق الجرح الظهاري القرنية.

تسمح خصائص نموذج الزرد بدراسة فسيولوجيا الأنسجة الظهارية والسلوك الجماعي للخلايا الظهارية عند تحدي الأنسجة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام نموذج محروم من تأثير الفيلم المسيل للدموع يمكن أن ينتج إجابات جديدة فيما يتعلق باستجابة القرنية للإجهاد. وأخيرا، يسمح هذا النموذج أيضا بتحديد الأحداث الخلوية والجزيئية التي ينطوي عليها أي نسيج ظهاري يتعرض لجرح مادي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على تقييم فعالية الدواء في الاختبارات قبل السريرية.

Introduction

نظرا لأن معظم الظهارة على اتصال بالبيئة الخارجية ، فهي عرضة للإصابة الجسدية ، مما يجعلها مناسبة تماما لدراسة عمليات التئام الجروح. من بين الأنسجة المدروسة جيدا ، تعد القرنية نموذجا مفيدا للغاية في التحقيق في الجوانب الخلوية والجزيئية لالتئام الجروح. كسطح خارجي شفاف ، فإنه يوفر الحماية المادية للعين وهو العنصر الأول لتركيز الضوء على شبكية العين. في حين أن بنية وتكوين الخلية في شبكية العين تختلف بين الأنواع¹ ، فإن هذه العناصر من القرنية متشابهة بشكل عام في جميع العيون من نوع الكاميرا ، بغض النظر عن الأنواع.

تتكون القرنية من ثلاث طبقات رئيسية². الطبقة الأولى والخارجية هي الظهارة ، التي يتم تجديدها باستمرار لضمان شفافيتها. الطبقة الثانية هي السدى ، التي تحتوي على خلايا متناثرة ، تسمى الخلايا القرنية ، داخل طبقة سميكة من ألياف الكولاجين المنظمة بدقة. الطبقة الثالثة والأعمق هي البطانة ، والتي تسمح بانتشار المغذيات والسوائل من الغرفة الأمامية إلى الطبقات الخارجية. تتفاعل الخلايا الظهارية واللحمية عبر عوامل النمو والسيتوكينات³. يتم تسليط الضوء على هذا التفاعل من خلال موت الخلايا المبرمج السريع والانتشار اللاحق للخلايا القرنية بعد الإصابة الظهارية ^4,5. في حالة وجود جرح أعمق ، مثل ثقب ، تلعب الخلايا القرنية دورا نشطا في عملية الشفاء⁶.

كونها على اتصال مع البيئة الخارجية ، والإصابات الجسدية القرنية شائعة. كثير منها ناتج عن أجسام غريبة صغيرة⁷ ، مثل الرمل أو الغبار. يمكن أن يؤدي رد فعل فرك العين إلى سحجات ظهارية واسعة النطاق وإعادة تشكيل القرنية⁸. وفقا لحجم الجرح وعمقه ، فإن هذه الإصابات الجسدية مؤلمة وتستغرق عدة أيام للشفاء⁹. تسهل الخصائص المثلى لالتئام الجروح للنموذج فهم الجوانب الخلوية والجزيئية لإغلاق الجروح. علاوة على ذلك ، أثبتت هذه النماذج أيضا فائدتها لاختبار جزيئات جديدة لديها القدرة على تسريع شفاء القرنية ، كما هو موضح سابقا^10,11.

يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى استخدام أسماك الزرد كنموذج ذي صلة لدراسة الإصابة الجسدية للقرنية. هذا النموذج مناسب للغاية لدراسات الفحص الدوائي لأنه يسمح بإضافة الجزيئات مباشرة إلى ماء الخزان ، وبالتالي ، للتلامس مع قرنية الشفاء. ستساعد التفاصيل المقدمة هنا العلماء على إجراء دراساتهم على نموذج الزرد. يتم تنفيذ الإصابة في الجسم الحي مع لدغ العين باهتة. يمكن تحليل التأثير على الخلايا الظهارية المجاورة أو على مسافة منه عن طريق إزالة ظهارة القرنية المركزية على وجه التحديد. في السنوات الأخيرة ، ركزت العديد من التقارير على مثل هذه الطريقة على قرنية القوارض¹²،13،14،15،^16،17. ومع ذلك ، حتى الآن ، طبق تقرير واحد فقط هذه الطريقة على الزرد¹⁸.

بسبب بساطته ، فإن الجرح المادي مفيد في تحديد دور الخلايا الظهارية في إغلاق الجرح. نموذج آخر راسخ لإصابة القرنية هو الحرق الكيميائي ، وخاصة حرق القلويات¹⁹،^20،21. ومع ذلك ، فإن مثل هذا النهج يضر بشكل غير مباشر بسطح العين بأكمله ، بما في ذلك القرنية الطرفية وسدى القرنية¹⁹. في الواقع ، من المحتمل أن تحفز الحروق القلوية قرحة القرنية ، والثقوب ، والعتامة الظهارية ، والأوعية الدموية الجديدة السريعة²² ، والنتيجة التي لا يمكن السيطرة عليها للحروق القلوية تستبعد هذا النهج للدراسات العامة لالتئام الجروح. تستخدم العديد من الطرق الأخرى أيضا للتحقيق في التئام جروح القرنية وفقا للتركيز الخاص للدراسة المعنية (على سبيل المثال ، التنضير الظهاري الكامل²³ ، والجمع بين الإصابة الكيميائية والميكانيكية للجرح ذي السماكة الجزئية 24 ، والاستئصال بالليزر الإكسيمر للجروح التي تمتد إلى السدى²⁵). استخدام لدغ العين يحد من النقطة البؤرية إلى الاستجابة الظهارية للجرح ويوفر جرحا قابلا للتكرار للغاية.

كما هو الحال مع كل طريقة لإلحاق الجرح ، فإن استخدام نتوء العين له مزايا وعيوب. العيب الرئيسي هو أن الاستجابة تكون في الغالب ظهارية ، فهي لا تعكس تماما السحجات التي شوهدت في الإعداد السريري. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها العديد من المزايا ، بما في ذلك السهولة التي يمكن بها إعدادها وتنفيذها ، ودقتها ، وقابليتها للتكرار ، وحقيقة أنها غير غازية ، مما يجعلها طريقة جيدة التحمل من قبل الحيوانات.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل المجلس الوطني للتجارب على الحيوانات.

1. التحضيرات

1. قم بإعداد محلول مخزون التريكاين المستخدم في التخدير²⁶ مقدما (محلول مخزون 0.4٪ المستخدم في هذا البروتوكول). استخدم القفازات واحتفظ بالمواد في غطاء الدخان كلما أمكن ذلك.
   1. للحصول على 50 مل من محلول 0.4٪ ، قم بوزن 200 ملغ من مسحوق التريكاين في أنبوب 50 مل. يذوب المسحوق في حوالي 45 مل من الماء المقطر المزدوج.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول مخزون التريكاين على 7 مع 1 M Tris (الرقم الهيدروجيني 8.8 ، ~ 1.25 مل). أضف محلول Tris إلى مخزون التريكاين في الأليكوتس ، واخلط المخزون جيدا بعد كل أليكوت ، وتحقق من الرقم الهيدروجيني بعد كل إضافة من تريس.
2. قبل التجربة ، قم بإعداد حل عمل بنسبة 0.02٪ من التريكاين.
   1. قم بإذابة 2 مل من محلول المخزون بنسبة 0.4٪ وأضف إلى 40 مل من مياه النظام (التركيز النهائي 0.02٪). ضع المحلول في حاوية صغيرة.
3. قبل التجربة ، قم بإعداد مياه الاسترداد التي تحتوي على مسكن. استخدم القفازات واحتفظ بالمواد في غطاء الدخان كلما أمكن ذلك.
   1. للحصول على لتر واحد من مياه الاسترداد ، يزن 2.5 ملغ من مسحوق هيدروكلوريد ليدوكائين ويذوبه في مياه النظام العذبة. تحقق من الرقم الهيدروجيني واضبط على 7 إذا لزم الأمر.
4. قبل التجربة ، قم بإعداد محلول التثبيت (2.5٪ glutaraldehyde في محلول 0.1 M فوسفات الصوديوم (Na-PO 4) عند درجة الحموضة_7.4). استخدم القفازات واحتفظ بالمواد في غطاء الدخان.
   1. بالنسبة إلى 10 مل من محلول التثبيت ، قم بماصة 5 مل من 0.2 م Na-PO₄ في أنبوب. أضف 0.5 مل من 50٪ glutaraldehyde ، وأضف الماء المقطر المزدوج للحصول على الحجم النهائي البالغ 10 مل. احمي المحلول من الضوء، واحفظه على الجليد أو في الثلاجة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: إذا كان يجب جمع العينات لعدة ساعات بعد الجرح ، فقم بإعداد محلول التثبيت قبل الاستخدام مباشرة.
5. إعداد المعدات اللازمة للجرح (الشكل 1).
   1. املأ خزانات الاسترداد أو الحاويات الأصغر بمياه النظام.
   2. اجعل لدغة العيون جاهزة. تحقق من أن طرف لدغ نظيف. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة حطام الخلايا باستخدام قطعة قطن رطبة.
   3. قم بعمل شق على جانب إسفنجة ناعمة ، وقم بترطيب الإسفنجة بماء النظام. ضع الإسفنجة على قاعدة / مرحلة مجهر تشريح. تأكد من وجود مساحة عمل كافية لاستخدام النتوء وإضاءة كافية من الجانبين و / أو أعلى لرؤية سطح العين بشكل صحيح.

2. التخدير

1. انقل سمكة من الخزان إلى محلول تريكاين بنسبة 0.02٪ بشبكة بلطف قدر الإمكان.
2. راقب التخدير ، وتحقق من عدم الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الخفيف.
   ملاحظة: للتخدير المستمر ، يتم استخدام التعرض لمدة 2 دقيقة للتريكاين قبل التآكل مع أسماك AB من النوع البري البالغ. مع الأسماك ذات الخلفية الوراثية الأخرى ، قد تكون هناك حاجة إلى مدة مختلفة.

3. التآكل

1. ضع السمك المخدر بلطف بملعقة في الشق الموجود على الإسفنجة ، والرأس بارز من سطح الإسفنج.
2. قم بتشغيل اللدغ ، وركز عرض المجهر على سطح العين.
3. اقترب بعناية من سطح العين بطرف لدغ. عند لمس سطح العين ، ابدأ في تحريك طرف اللدغ على سطح العين بحركة دائرية. تجنب الحركة المفاجئة ، لأنها قد تؤدي إلى إمالة العين في المقبس وانزلاق طرف اللدغ.
4. عند الانتهاء من التآكل ، ضع الأسماك بعناية في مياه النظام التي تحتوي على مسكن للتعافي.
5. نظف النتوء مباشرة بعد الاستخدام باستخدام قطعة قطن رطبة.

4. جمع العينات

1. في الوقت المطلوب ، التقط السمك بشبكة وضعه في محلول تريكاين بنسبة 0.02٪. احتفظ بالحيوان في المحلول حتى تتوقف حركة التشغيل تماما ، ولا تتفاعل الأسماك مع اللمس.
2. ضع السمك على طبق بتري بملعقة ، وأمسكه بملاقط. قطع رأس الأسماك بمقص تشريح. تجنب حدوث أي خدوش على سطح العين عند التعامل مع العينة.
3. ضع الأنسجة في أنبوب عينة يحتوي على 0.1 M Na-PO₄.
   1. شطف الأنسجة عن طريق استبدال 0.1 M Na-PO₄ مع مخزن مؤقت نظيف بحيث لا يبقى الدم في المحلول.

5. معالجة العينات للمجهر الإلكتروني

1. إصلاح الأنسجة في 2.5٪ غلوتارالدهيد / 0.1 M Na-PO 4 (الرقم الهيدروجيني_7.4 ) لمدة ~ 24 ساعة عند +4 درجة مئوية. احتفظ بالعينة على حامل عينة دوار/مهتز لضمان التثبيت المناسب.
2. قم بإزالة محلول التثبيت وشطف العينة عدة مرات باستخدام 0.1 M Na-PO₄.
3. تشريح العينة في هذه المرحلة.
   1. ضع العينة على قطرة 0.1 M Na-PO₄ على لوحة تشريح. إذا كان يجب تصوير كلتا العينين من نفس السمكة ، فقم بقطع عينة الرأس إلى قسمين باستخدام مقص تشريح دقيق.
   2. بدلا من ذلك ، اجمع العينين فقط عن طريق وضع أطراف الملقط الناعم بعناية في محجر العين من جانب العين ، مع الحرص الشديد على عدم خدش سطح العين. ثم اسحب العين من المقبس.
   3. انقل العينة المشوهة إلى أنبوب يحتوي على 0.1 M Na-PO₄. تأكد من عدم وجود أنسجة إضافية في أنبوب العينة، لأنها قد تلتصق بالجزء العلوي من العين أثناء معالجة العينة.
4. قم بتخزين العينة في 0.1 M Na-PO₄ (بحد أقصى أسبوع واحد) عند +4 درجة مئوية.
5. معالجة العينات للتصوير المجهري الإلكتروني.
   1. قم بتثبيت العينات في رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 2٪ في مخزن مؤقت Na-PO₄ 0.1 M لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. اغسل العينات 3 مرات لمدة 5 دقائق كل غسل في 0.1 M Na-PO₄ في RT.
   3. تجفيف العينات على التوالي في 30 ٪ ، 50 ٪ ، و 70 ٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة في كل محلول في RT.
   4. اغمر العينات في 96٪ من الإيثانول لمدة 2-3 ساعات في RT.
   5. بعد ذلك ، احتضن العينات مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪ ، أولا لمدة 1 ساعة ثم في الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ بين عشية وضحاها عند +4 درجة مئوية.
   6. إخضاع العينات ل 30 دورة في مجفف آلي للنقاط الحرجة.
6. تضمين وتغليف العينات بالبلاتين.
   1. ضع علامة تبويب لاصقة على حامل. إذا كان يجب وضع علامة على العينة أعلى الحامل، فاترك قطعة من ورق غلاف علامة التبويب على علامة التبويب واكتب معرف العينة على الورق.
   2. ضع الحامل مع علامة التبويب على قاعدة مجهر تشريح.
   3. ضع عينة الأنسجة بلطف على الحامل باستخدام ملاقط دقيقة ، والقرنية متجهة لأعلى.
   4. قم بتغطية العينة بالبلاتين باستخدام الجهاز المناسب. بعد الطلاء ، قم بتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة حتى التصوير.

6. التصوير (الشكل 2)

1. قم بتشغيل الأجهزة كما هو موضح في دليل المستخدم ومن قبل خبراء التصوير.
2. احصل على صور للتكبير المطلوب، واستخدم 2000-2500 صورة للتحليل.
3. اضبط السطوع والتباين بحيث لا توجد مناطق معرضة بشكل مفرط في الصورة ، ويتم رؤية حدود الخلايا و microridges بأكبر قدر ممكن من الوضوح.
   ملاحظة: يؤثر موضع الأنسجة وزاويتها على إعدادات السطوع والتباين. قد تحتاج إلى تعديلها من عينة إلى أخرى وبين مناطق مختلفة من الأنسجة.

7. قياس شكل الخلية وحجمها ونمط microridge

1. افتح صورة TIFF في فيجي ImageJ 1.53²⁷. تعيين المقياس باستخدام شريط القياس للصورة: قم بإنشاء خط مساو في الحجم لشريط المقياس باستخدام أداة الخط . حدد تحليل | اضبط المقياس، واكتب المسافة المعروفة. افتح مدير عائد الاستثمار من | التحليل قائمة الأدوات .
2. بالنسبة لحجم الخلية واستدارتها، حدد تحليل | تعيين القياسات | واصفات الشكل. استخدم أداة التكبير الزجاجي لرؤية الخلايا تحت التكبير. حدد الخلايا باستخدام أداة المضلع ، وأضف كل تحديد إلى مدير عائد الاستثمار. وأخيرا، قم بقياس الخلايا المحددة، واحفظ القياس.
3. تحليل ميكروريدج (الشكل 3 والشكل 4)
   1. تأكد من أن الصورة بتنسيق 8 بت من | الصور اكتب القائمة.
   2. حدد خلية باستخدام أداة المضلع ، وامسح الخلفية من تحرير | واضح في الخارج.
   3. قم بتنعيم الصورة من مرة إلى ثلاث مرات عن طريق تحديد عملية | قم بالسلاسة، واضبط السطوع والتباين من Image | ضبط | السطوع / التباين بحيث تبرز microridges بأكبر قدر ممكن من الوضوح.
   4. قم بتجميع الصورة من | العملية | الفلاتر إشراك ، تتحول إلى ثنائية من عملية | | الثنائية اجعل الصورة ثنائية، وقم بتهيئة الهيكل العظمي للصورة بالأبيض والأسود عن طريق تحديد عملية | | الثنائية الهيكل العظمي.
   5. استخدم الدالة تحليل الهيكل العظمي في | قائمة الهيكل العظمي لقياس معلمات microridge وحفظ القيم.
      ملاحظة: في SEM، قد تختلف الصور الفردية في السطوع والتباين. وبالتالي ، قد تحتاج الخطوات في التحليل إلى تعديلات من صورة إلى أخرى.

النتائج

تصف هذه الدراسة طريقة تستخدم نتوء العين في تجارب التئام جروح القرنية الزردية. تم تعديل هذه الطريقة من الدراسات السابقة على الفئران ، حيث تبين أن اللدغ يزيل طبقات الخلايا الظهارية بكفاءة¹³. تشمل التحديات في جرح قرنية الزرد الحجم الصغير نسبيا للعين ، وفي حالة التجارب التي تستغر?...

Discussion

إصابات القرنية الجسدية هي السبب الأكثر شيوعا لزيارات مرضى العيون إلى المستشفى. لذلك ، من المهم إنشاء نماذج ذات صلة لدراسة الجوانب المختلفة لفيزيولوجيا القرنية المرضية. حتى الآن ، يعد الماوس هو النموذج الأكثر استخداما لدراسة التئام جروح القرنية. ومع ذلك ، فإن إضافة قطرات العين على العيون ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica