Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine

Özet

Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.

Özet

Gözün şeffaf yüzeyi olarak, kornea net görme için etkilidir. Konumu nedeniyle, bu doku çevresel hakaretlere eğilimlidir. Nitekim klinik olarak en sık karşılaşılan göz yaralanmaları korneada görülen yaralanmalardır. Kornea yara iyileşmesi küçük memelilerde (yani fareler, sıçanlar ve tavşanlar) kapsamlı bir şekilde incelenirken, kornea fizyolojisi çalışmaları, zebra balığı klasik bir araştırma modeli olmasına rağmen, zebra balığı da dahil olmak üzere diğer türleri ihmal etmiştir.

Bu rapor, zebra balığı üzerinde kornea aşınması gerçekleştirmenin bir yöntemini açıklamaktadır. Yara, oküler çapak kullanılarak anestezi uygulanan balıklarda in vivo olarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, gözün geri kalanını sağlam bırakarak tekrarlanabilir bir epitel yarasına izin verir. Aşınmadan sonra, yara kapanması 3 saat boyunca izlenir, daha sonra yara reepitelize edilir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak, ardından görüntü işleme, epitel hücre şekli ve apikal çıkıntılar, kornea epitel yarası kapanması sırasında çeşitli adımları incelemek için araştırılabilir.

Zebra balığı modelinin özellikleri, epitel dokusu fizyolojisinin ve dokuya meydan okunduğunda epitel hücrelerinin kolektif davranışının incelenmesine izin verir. Ayrıca, gözyaşı filminin etkisinden yoksun bir modelin kullanılması, korneanın strese tepkisi ile ilgili yeni cevaplar üretebilir. Son olarak, bu model aynı zamanda fiziksel bir yaraya maruz kalan herhangi bir epitel dokusunda yer alan hücresel ve moleküler olayların tanımlanmasına da izin verir. Bu yöntem, preklinik testlerde ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde uygulanabilir.

Giriş

Epitelyaların çoğu dış çevre ile temas halinde olduğundan, fiziksel yaralanmaya eğilimlidirler, bu da onları yara iyileşme süreçlerinin incelenmesi için çok uygun hale getirir. İyi çalışılmış dokular arasında kornea, yara iyileşmesinin hücresel ve moleküler yönlerinin araştırılmasında son derece yararlı bir modeldir. Şeffaf bir dış yüzey olarak göze fiziksel koruma sağlar ve ışığı retinaya odaklayan ilk unsurdur. Retinanın yapısı ve hücre bileşimi tür¹ arasında farklılık gösterirken, korneanın bu elementleri, türlerden bağımsız olarak tüm kamera tipi gözlerde genellikle benzerdir.

Kornea üç ana tabakadan oluşur². İlk ve en dış katman, şeffaflığını sağlamak için sürekli yenilenen epiteldir. İkinci katman, kesinlikle organize edilmiş kollajen liflerinin kalın bir tabakası içinde, keratositler adı verilen dağınık hücreler içeren stromadır. Üçüncü ve en içteki tabaka, ön odadan dış katmanlara besin ve sıvı difüzyonuna izin veren endoteldir. Epitel ve stromal hücreler büyüme faktörleri ve sitokinler yoluyla etkileşime girer³. Bu etkileşim, epitel yaralanması ^4,5 sonrası hızlı apoptoz ve ardından keratositlerin proliferasyonu ile vurgulanmaktadır. Delinme gibi daha derin bir yara durumunda, keratositler iyileşme sürecinde aktif rol alır⁶.

Dış çevre ile temas halinde olmak, kornea fiziksel yaralanmaları yaygındır. Birçoğu kum veya toz gibi küçük yabancı^{cisimlerden kaynaklanır 7}. Göz ovuşturma refleksi geniş epitel sıyrıklarına ve kornea yeniden şekillenmesine yol açabilir⁸. Yara büyüklüğüne ve derinliğine göre, bu fiziksel yaralanmalar ağrılıdır ve^iyileşmesi birkaç gün sürer 9. Bir modelin optimal yara iyileşme özellikleri, yara kapanmasının hücresel ve moleküler yönlerinin anlaşılmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bu tür modeller, daha önce^10,11'de gösterildiği gibi^, kornea iyileşmesini hızlandırma potansiyeline sahip yeni molekülleri test etmek için de yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Burada açıklanan protokol, zebra balıklarını kornea fiziksel yaralanmasını incelemek için ilgili bir model olarak kullanmayı amaçlamaktadır. Bu model, moleküllerin doğrudan tank suyuna eklenmesine ve dolayısıyla iyileşen bir kornea ile temas etmesine izin verdiği için farmakolojik tarama çalışmaları için oldukça uygundur. Burada verilen detaylar, bilim adamlarının zebra balığı modeli üzerindeki çalışmalarını gerçekleştirmelerine yardımcı olacaktır. İn vivo yaralanma donuk bir oküler çapak ile gerçekleştirilir. Bitişik veya ondan uzak bir mesafedeki epitel hücreleri üzerindeki etki, merkezi kornea epitelinin spesifik olarak çıkarılmasıyla analiz edilebilir. Son yıllarda, çok sayıda rapor kemirgen kornea 12,13,14,15,16,17; ancak, bugüne kadar, sadece tek bir rapor bu yöntemi zebra balığı^18'e uygulamıştır.

Sadeliği nedeniyle, fiziksel yara, epitel hücrelerinin yara kapanmasındaki rolünü tanımlamada yararlıdır. Kornea yaralanmasının bir başka köklü modeli kimyasal yanık, özellikle alkali yanık ^19,20,21'dir. Bununla birlikte, böyle bir yaklaşım dolaylı olarak periferik kornea ve kornea stroma¹⁹ dahil olmak üzere tüm göz yüzeyine zarar verir. Gerçekten de, alkali yanıklar potansiyel olarak kornea ülserlerini, perforasyonları, epitelyal opaklaşmayı ve hızlı neovaskülarizasyonu^{indükler 22} ve alkali yanıkların kontrol edilemeyen sonucu, genel yara iyileşmesi çalışmaları için bu yaklaşımı diskalifiye eder. Söz konusu çalışmanın özel odağına göre kornea yarasının iyileşmesini araştırmak için çok sayıda başka yöntem de kullanılmaktadır (örneğin, tam epitel debridmanı²³, kısmi kalınlıktaki yara 24 için kimyasal ve mekanik yaralanma kombinasyonu, stroma^25'e uzanan yaralar için excimer lazer ablasyonu). Oküler çapak kullanımı, odak noktasını yaraya epitel yanıtı ile sınırlar ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yara sağlar.

Her yara açma yönteminde olduğu gibi, oküler çapak kullanımının avantajları ve dezavantajları vardır. En büyük dezavantajı, yanıtın çoğunlukla epitel olması, klinik ortamda görülen sıyrıkları tam olarak yansıtmamasıdır. Bununla birlikte, bu yöntemin, kurulabileceği ve gerçekleştirilebildiği kolaylık, hassasiyeti, tekrarlanabilirliği ve invaziv olmaması da dahil olmak üzere sayısız avantajı vardır, bu da onu hayvanlar tarafından iyi tolere edilen bir yöntem haline getirir.

Protokol

Tüm deneyler ulusal hayvan deney kurulu tarafından onaylandı.

1. Hazırlıklar

1. Anestezi²⁶ için kullanılan trikain stok çözeltisini önceden hazırlayın (bu protokolde kullanılan% 0.4 stok çözeltisi). Eldiven kullanın ve malzemeleri mümkün olduğunca bir duman başlığında tutun.
   1. % 0.4'lük bir çözeltinin 50 mL'si için, 50 mL'lik bir tüpe 200 mg trikain tozu tartın. Tozu yaklaşık 45 mL çift damıtılmış suda çözün.
   2. Trikain stok çözeltisinin pH'ını 1 M Tris (pH 8.8, ~ 1.25 mL) ile 7'ye ayarlayın. Tris çözeltisini alikotlardaki trikain stoğuna ekleyin, her alikottan sonra stoğu iyice karıştırın ve her Tris ilavesinden sonra pH'ı kontrol edin.
2. Deneyden önce,% 0.02'lik bir trikain çalışma çözeltisi hazırlayın.
   1. 2 mL% 0.4 stok çözeltisini çözün ve 40 mL'lik sistem suyuna ekleyin (son konsantrasyon% 0.02). Çözeltiyi küçük bir kaba koyun.
3. Deneyden önce, analjezik içeren geri kazanım suyunu hazırlayın. Eldiven kullanın ve malzemeleri mümkün olduğunca davlumbazda tutun.
   1. Bir litre geri kazanım suyu için, 2.5 mg lidokain hidroklorür tozu tartın ve tatlı sistem suyunda çözün. PH'ı kontrol edin ve gerekirse 7'ye ayarlayın.
4. Deneyden önce, sabitleme çözeltisini hazırlayın (pH 7.4'te 0.1 M sodyum fosfat (Na-PO₄) çözeltisinde% 2.5 glutaraldehit). Eldiven kullanın ve malzemeleri bir duman başlığında tutun.
   1. 10 mL sabitleme çözeltisi için, bir tüpe 5 mL'lik 0,2 M Na-PO₄ pipetin. 0,5 mL% 50 glutaraldehit ekleyin ve 10 mL'lik son hacmi elde etmek için çift damıtılmış su ekleyin. Çözeltiyi ışıktan koruyun ve kullanmadan önce buzda veya buzdolabında saklayın.
      NOT: Numunelerin yaralamadan sonra birkaç saat boyunca toplanması gerekiyorsa, kullanımdan hemen önce sabitleme solüsyonunu hazırlayın.
5. Ekipmanı yaralama için hazırlayın (Şekil 1).
   1. Geri kazanım tanklarını veya daha küçük kapları sistem suyuyla doldurun.
   2. Oftalmik çapağı hazır bulundurun. Çapak ucunun temiz olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, hücre kalıntılarını nemli bir pamuklu çubukla temizleyin.
   3. Yumuşak bir süngerin yanına bir kesi yapın ve süngeri sistem suyuyla nemlendirin. Süngeri diseksiyon mikroskobunun tabanına/aşamasına yerleştirin. Çapağı kullanmak için yeterli çalışma alanı ve göz yüzeyini düzgün bir şekilde görmek için yanlardan ve / veya yukarıdan yeterli aydınlatma sağlayın.

2. Anestezi

1. Bir balığı tanktan% 0.02 trikain çözeltisine mümkün olduğunca yumuşak bir ağ ile aktarın.
2. Anesteziyi izleyin, hafif mekanik uyaranlara yanıt verilip verilmediğini kontrol edin.
   NOT: Tutarlı anestezi için, yetişkin vahşi tip AB balıklarıyla aşınmadan önce trikaine 2 dakikalık bir maruz kalma kullanılır. Diğer genetik geçmişe sahip balıklarda, farklı bir süreye ihtiyaç duyulabilir.

3. Aşınma

1. Anestezi uygulanan balığı, sünger yüzeyinden çıkıntı yapan bir kaşıkla sünger üzerindeki kesiye yavaşça yerleştirin.
2. Çapağı açın ve mikroskop görünümünü göz yüzeyine odaklayın.
3. Göz yüzeyine çapak ucu ile dikkatlice yaklaşın. Göz yüzeyine dokunurken, çapak ucunu göz yüzeyinde dairesel hareketle hareket ettirmeye başlayın. Ani hareketlerden kaçının, çünkü gözün sokette eğilmesine ve çapak ucunun kaymasına neden olabilir.
4. Aşınma tamamlandığında, balıkları iyileşme için analjezik içeren sistem suyuna dikkatlice yerleştirin.
5. Çapağı kullanımdan hemen sonra nemli bir pamuklu çubukla temizleyin.

4. Örneklerin toplanması

1. İstenilen zaman noktasında, balıkları bir ağ ile alın ve% 0.02 trikain çözeltisine yerleştirin. Operküler hareket tamamen durana kadar hayvanı çözelti içinde tutun ve balık dokunmaya tepki vermez.
2. Balıkları bir kaşıkla Petri kabına yerleştirin ve cımbızla tutun. Balıkları disseksiyon makası ile kafasını kesin. Numuneyi tutarken göz yüzeyinde çizikler çizikleri oluşmasını önleyin.
3. Dokuyu 0,1 M Na-PO₄ içeren bir numune tüpüne koyun.
   1. 0.1 M Na-PO_4'ü temiz tamponla değiştirerek dokuyu durulayın, böylece çözeltide kan kalmaz.

5. Elektron mikroskobu için numune işleme

1. Dokuyu +4 °C'de ~₂₄ saat boyunca% 2.5 glutaraldehit / 0.1 M Na-PO 4 (pH 7.4) içinde sabitleyin. Doğru sabitlemeyi sağlamak için numuneyi dönen/çalkalanan bir numune tutucu üzerinde tutun.
2. Sabitleme çözeltisini çıkarın ve numuneyi 0,1 M Na-PO 4 ile birkaç kez_durulayın.
3. Bu noktada örneği inceleyin.
   1. Numuneyi diseksiyon plakası üzerinde 0,1 M Na-PO_4'lük bir damla üzerine yerleştirin. Aynı balığın her iki gözünün de görüntülenmesi gerekiyorsa, kafa örneğini ince disseksiyon makası ile ikiye bölün.
   2. Alternatif olarak, gözleri yalnızca ince cımbızların uçlarını gözün yanından göz yuvasına dikkatlice yerleştirerek, göz yüzeyini çizmemeye özen göstererek toplayın. Ardından, gözü soketten dışarı çekin.
   3. Disseke edilen numuneyi 0.1 M Na-PO₄ içeren bir tüpe aktarın. Numune işleme sırasında gözün üst kısmına yapışabileceğinden, numune tüpünde ekstra doku olmadığından emin olun.
4. Numuneyi +4 °C'de 0,1 M Na-PO_4'te (maksimum bir hafta) saklayın.
5. Elektron mikroskobu görüntüleme için numuneleri işleyin.
   1. Numuneleri, oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca 0,1 M Na-PO₄ tamponunda% 2 ozmiyum tetroksit içinde sabitleyin.
   2. Numuneleri RT'de 0,1 M Na-PO_4'te her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
   3. Numuneleri RT'deki her çözeltide 1 saat boyunca% 30,% 50 ve% 70 etanol içinde art arda dehidre edin.
   4. Numuneleri RT'de 2-3 saat boyunca% 96 etanol içine batırın.
   5. Daha sonra, numuneleri iki kez% 100 etanolde, önce 1 saat boyunca ve daha sonra +4 ° C'de gece boyunca taze% 100 etanol içinde inkübe edin.
   6. Numuneleri otomatik kritik nokta kurutucuda 30 döngüye tabi tutun.
6. Numuneleri gömün ve platin kaplayın.
   1. Bir montaj parçasına yapışkan bir tırnak yerleştirin. Numunenin montajın üstünde işaretlenmesi gerekiyorsa, sekmeye bir parça sekme kapağı kağıdı bırakın ve örnek kimliğini kağıda yazın.
   2. Montajı, tırnakla birlikte diseksiyon yapan bir mikroskobun tabanına yerleştirin.
   3. Doku örneğini ince cımbızla, kornea yukarı bakacak şekilde yavaşça montaja yerleştirin.
   4. Uygun cihazı kullanarak numuneyi platin ile kaplayın. Kaplamadan sonra, numuneleri görüntülemeye kadar oda sıcaklığında saklayın.

6. Görüntüleme (Şekil 2)

1. Cihazları kullanım kılavuzunda ve görüntüleme uzmanları tarafından önerildiği şekilde çalıştırın.
2. İstediğiniz büyütmenin görüntülerini elde edin ve analiz için 2.000-2.500x görüntü kullanın.
3. Parlaklığı ve kontrastı, görüntüde aşırı pozlanmış alanlar olmayacak ve hücre kenarlıkları ve mikro sırtlar mümkün olduğunca net görünecek şekilde ayarlayın.
   NOT: Dokunun konumu ve açısı parlaklık ve kontrast ayarlarını etkiler. Numuneden numuneye ve dokunun farklı bölgeleri arasında ayarlanmaları gerekebilir.

7. Hücre şeklini, boyutunu ve mikrosırt desenini ölçme

1. TIFF görüntüsünü Fiji ImageJ 1.53^27'de açın. Görüntünün ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın: Çizgi aracıyla ölçek çubuğuna eşit boyutta bir çizgi oluşturun. | Analiz Et'i seçin Ölçeği ayarlayın ve bilinen mesafeye yazın. Yatırım getirisi yöneticisini Analiz | Araçlar menüsü.
2. Hücre boyutu ve yuvarlaklık için | Analiz et'i seçin Ölçümleri ayarlama | Şekil tanımlayıcıları. Büyütme altındaki hücreleri görmek için Büyüteç aracını kullanın. Poligon aracıyla hücreleri seçin ve her seçimi YG yöneticisine ekleyin. Son olarak, seçilen hücreleri ölçün ve ölçümü kaydedin.
3. Microridge analizi (Şekil 3 ve Şekil 4)
   1. Görüntü | görüntünün 8 bit biçiminde olduğundan emin olun Menü yazın .
   2. Poligon aracıyla bir hücre seçin ve arka planı Düzenle | Dışarısı açık.
   3. İşlem | seçerek görüntüyü bir ila üç kez düzgünleştirin Görüntü |'nden pürüzsüzleştirin ve parlaklığı ve kontrastı ayarlayın | ayarlama Parlaklık/Kontrast , böylece mikro sırtlar mümkün olduğunca net bir şekilde öne çıkıyor.
   4. İşlem |'nden görüntüyü birleştirin Filtreler | Convolve, Proses |'dan ikiliye dönüştürün İkili | İkili hale getirin ve İşlem |'i seçerek siyah beyaz görüntüyü iskeletleştirin İkili | İskeletolize.
   5. Analiz |'ndeki İskeleti analiz et işlevini kullanma Mikroridge parametrelerini ölçmek ve değerleri kaydetmek için iskelet menüsü.
      NOT: SEM'de, tek tek görüntüler parlaklık ve kontrast bakımından farklılık gösterebilir. Bu nedenle, analizdeki adımların görüntüden görüntüye ayarlanması gerekebilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, zebra balığı kornea yara iyileşmesi deneylerinde oftalmik çapak kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, çapağın epitel hücre katmanlarını verimli bir şekilde çıkardığı gösterilen fareler üzerindeki önceki çalışmalardan modifiye edilmiştir¹³. Zebra balığı kornea yaralanmasındaki zorluklar, gözün nispeten küçük boyutunu ve zaman alıcı deneyler durumunda, solungaçlardan sabit bir su akışını sürdürme ihtiyacını içerir (Xu ve mesle...

Tartışmalar

Kornea fiziksel yaralanmaları, oftalmoloji hastalarının hastaneye ziyaretlerinin en sık nedenidir. Bu nedenle, kornea patofizyolojisinin farklı yönlerinin incelenmesi için ilgili modellerin oluşturulması önemlidir. Şimdiye kadar, fare kornea yara iyileşmesi çalışması için en yaygın kullanılan modeldir. Bununla birlikte, belirli ilaçların kornea yarasının iyileşmesi üzerindeki etkisini doğrulamak için murin yaralı gözlere göz damlası eklemek zor olabilir. Bu bakımdan, zebra balığı modeli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica