Заживление ран роговицы рыбок данио: от истирания до анализа закрытия раны

Резюме

Этот протокол фокусируется на повреждении глазной поверхности рыбок данио путем истирания для оценки последующего закрытия раны на клеточном уровне. Этот подход использует глазной заусенец для частичного удаления эпителия роговицы и использует сканирующую электронную микроскопию для отслеживания изменений в морфологии клеток во время закрытия раны.

Аннотация

Как прозрачная поверхность глаза, роговица играет важную роль в ясном зрении. Благодаря своему расположению эта ткань склонна к экологическим нарушениям. Действительно, травмы глаз, наиболее часто встречающиеся клинически, - это травмы роговицы. В то время как заживление ран роговицы широко изучалось у мелких млекопитающих (то есть мышей, крыс и кроликов), исследования физиологии роговицы пренебрегли другими видами, включая рыбок данио, несмотря на то, что рыбки данио являются классической исследовательской моделью.

В этом отчете описывается метод выполнения истирания роговицы на рыбках данио. Рана выполняется in vivo на обезболенных рыбах с помощью глазного заусенца. Этот метод позволяет воспроизвести эпителиальную рану, оставляя остальную часть глаза нетронутой. После истирания контролируется закрытие раны в течение 3 ч, после чего рана реэпителизируется. С помощью сканирующей электронной микроскопии с последующей обработкой изображений можно исследовать форму эпителиальных клеток и апикальные выступы для изучения различных этапов закрытия эпителиальной раны роговицы.

Характеристики модели рыбок данио позволяют изучать физиологию эпителиальной ткани и коллективное поведение эпителиальных клеток при оспаривании ткани. Кроме того, использование модели, лишенной влияния слезной пленки, может дать новые ответы относительно реакции роговицы на стресс. Наконец, эта модель также позволяет очертить клеточные и молекулярные события, участвующие в любой эпителиальной ткани, подвергшейся физической ране. Этот метод может быть применен для оценки эффективности препарата при доклинических испытаниях.

Введение

Поскольку большинство эпителиев находятся в контакте с внешней средой, они склонны к физическим травмам, что делает их хорошо подходящими для изучения процессов заживления ран. Среди хорошо изученных тканей роговица является чрезвычайно полезной моделью в исследовании клеточных и молекулярных аспектов заживления ран. Как прозрачная внешняя поверхность, он обеспечивает физическую защиту глаза и является первым элементом, который фокусирует свет на сетчатке. Хотя структура и клеточный состав сетчатки различаются между видами¹, эти элементы роговицы, как правило, похожи во всех глазах камерного типа, независимо от вида.

Роговица состоит из трех основных слоев². Первым и самым внешним слоем является эпителий, который постоянно обновляется для обеспечения его прозрачности. Вторым слоем является строма, которая содержит рассеянные клетки, называемые кератоцитами, в толстом слое строго организованных коллагеновых волокон. Третьим и самым внутренним слоем является эндотелий, который позволяет диффузии питательных веществ и жидкостей из передней камеры во внешние слои. Эпителиальные и стромальные клетки взаимодействуют через факторы роста и цитокины³. Это взаимодействие подчеркивается быстрым апоптозом и последующей пролиферацией кератоцитов после повреждения эпителия ^4,5. В случае более глубокой раны, такой как пункция, кератоциты принимают активное участие в процессе заживления⁶.

Находясь в контакте с внешней средой, распространены физические травмы роговицы. Многие из них вызваны мелкими посторонними предметами⁷, такими как песок или пыль. Рефлекс трения глаз может привести к обширным эпителиальным ссадинам и ремоделированию^{роговицы 8}. В зависимости от размера и глубины раны эти физические травмы болезненны и занимают несколько дней, чтобы зажить⁹. Оптимальные характеристики заживления ран модели облегчают понимание клеточных и молекулярных аспектов закрытия раны. Кроме того, такие модели также оказались полезными для тестирования новых молекул с потенциалом для ускорения заживления роговицы, как ранее было продемонстрировано^10,11.

Протокол, описанный здесь, направлен на использование рыбок данио в качестве соответствующей модели для изучения физического повреждения роговицы. Эта модель очень удобна для фармакологических скрининговых исследований, поскольку она позволяет добавлять молекулы непосредственно в воду резервуара и, следовательно, вступать в контакт с целебной роговицей. Подробности, представленные здесь, помогут ученым провести свои исследования на модели рыбок данио. Травма in vivo выполняется с притупленным глазным заусенцем. Воздействие на эпителиальные клетки, прилегающие или находящиеся на расстоянии от него, можно проанализировать путем специфического удаления центрального эпителия роговицы. В последние годы многочисленные доклады были посвящены такому методу на роговице грызунов 12,13,14,15,16,17; однако на сегодняшний день только в одном докладе этот метод применялся к рыбкам данио¹⁸.

Из-за своей простоты физическая рана полезна для очерчивания роли эпителиальных клеток в закрытии раны. Другой устоявшейся моделью повреждения роговицы является химический ожог, особенно щелочной ожог 19,20,21. Однако такой подход косвенно повреждает всю поверхность глаза, включая периферическую роговицу и строму роговицы¹⁹. Действительно, щелочные ожоги потенциально вызывают язвы роговицы, перфорации, помутнение эпителия и быструю неоваскуляризацию²², а неконтролируемый исход щелочных ожогов дисквалифицирует этот подход для общих исследований заживления ран. Многочисленные другие методы также используются для исследования заживления ран роговицы в соответствии с конкретным направлением рассматриваемого исследования (например, полная эпителиальная санация²³, сочетание химического и механического повреждения раны частичной толщины²⁴, эксимерная лазерная абляция для ран, простирающихся до стромы²⁵). Использование глазного заусенца ограничивает фокусную точку эпителиальной реакцией на рану и обеспечивает высокую воспроизводимость раны.

Как и при каждом способе нанесения раны, использование глазного заусенца имеет свои преимущества и недостатки. Основным недостатком является то, что реакция в основном эпителиальная, она не полностью отражает ссадины, наблюдаемые в клинических условиях. Тем не менее, этот метод имеет множество преимуществ, в том числе легкость, с которой он может быть настроен и выполнен, его точность, его воспроизводимость и тот факт, что он неинвазивный, что делает его методом, хорошо переносимым животными.

протокол

Все эксперименты были одобрены национальным советом по экспериментам на животных.

1. Препараты

1. Подготовьте раствор трицина, используемый для анестезии²⁶ заранее (0,4% раствор, используемый в этом протоколе). Используйте перчатки и храните материалы в вытяжном капюшоне, когда это возможно.
   1. На 50 мл 0,4% раствора взвесьте 200 мг порошка трикаина в пробирке объемом 50 мл. Растворите порошок примерно в 45 мл двухдистиллированной воды.
   2. Отрегулируйте рН раствора трицина до 7 с 1 М Трис (рН 8,8, ~1,25 мл). Добавьте раствор Триса в запас трикаина в аликвотах, тщательно перемешайте бульон после каждой аликвоты и проверяйте рН после каждого добавления Триса.
2. Перед экспериментом готовят 0,02% рабочий раствор трикаина.
   1. Разморозить 2 мл 0,4% раствора и добавить в 40 мл системной воды (конечная концентрация 0,02%). Поместите раствор в небольшую емкость.
3. Перед экспериментом подготовьте восстановительную воду, содержащую анальгетик. Используйте перчатки и держите материалы в вытяжном капюшоне, когда это возможно.
   1. На один литр восстановительной воды взвесьте 2,5 мг порошка лидокаина гидрохлорида и растворите его в пресной системной воде. Проверьте pH и при необходимости отрегулируйте его до 7.
4. Перед экспериментом готовят фиксирующий раствор (2,5% глутаровый альдегид в 0,1 М растворе фосфата натрия (Na-РО₄) при рН 7,4). Используйте перчатки и храните материалы в вытяжном капюшоне.
   1. На 10 мл фиксирующего раствора пипетку 5 мл 0,2 М Na-PO₄ в трубку. Добавьте 0,5 мл 50% глутаральдегида и добавьте двойную дистиллированную воду для получения конечного объема 10 мл. Защитите раствор от света и храните его на льду или в холодильнике перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы необходимо собирать в течение нескольких часов после ранения, подготовьте фиксирующий раствор непосредственно перед использованием.
5. Подготовьте оборудование к ранению (рисунок 1).
   1. Заполните резервуары для восстановления или меньшие контейнеры системной водой.
   2. Приготовьте офтальмологический заусенец. Убедитесь, что наконечник заусенца чистый. При необходимости удалите остатки клеток влажным ватным тампоном.
   3. Сделайте разрез в сторону мягкой губки и смочите губку системной водой. Поместите губку на основание/ступень рассекающего микроскопа. Обеспечьте достаточное рабочее пространство для использования заусенца и достаточное освещение с боков и / или выше, чтобы правильно видеть поверхность глаза.

2. Анестезия

1. Перенесите рыбу из аквариума на 0,02% раствор трицина с помощью сетки как можно мягче.
2. Следите за анестезией, проверяя отсутствие реакции на легкие механические раздражители.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для последовательной анестезии используется 2-минутное воздействие трикаина перед истиранием взрослых рыб дикого типа AB. С рыбами другого генетического происхождения может потребоваться другая продолжительность.

3. Истирание

1. Аккуратно поместите обезболенную рыбу ложкой в разрез на губке, высунув голову из поверхности губки.
2. Включите заусенец и сфокусируйте вид микроскопа на поверхности глаза.
3. Осторожно подойдите к поверхности глаза кончиком заусенца. При прикосновении к поверхности глаза начните движение кончика заусенца по поверхности глаза круговыми движениями. Избегайте резких движений, так как это может привести к наклону глаза в гнезде и проскальзыванию кончика заусенца.
4. Когда истирание будет сделано, осторожно поместите рыбу в системную воду, содержащую анальгетик для восстановления.
5. Очистите заусенец сразу после использования влажным ватным тампоном.

4. Сбор образцов

1. В нужный момент времени подберите рыбу сетью и поместите ее в 0,02% раствор трицена. Держите животное в растворе до тех пор, пока оперкулярное движение полностью не прекратится, и рыба не отреагирует на прикосновения.
2. Поместите рыбу на чашку Петри ложкой и подержите ее пинцетом. Обезглавить рыбу рассекающими ножницами. Избегайте появления царапин на поверхности глаза при работе с образцом.
3. Поместите ткань в пробирку, содержащую 0,1 М Na-PO₄.
   1. Промыть ткань, заменив 0,1 М Na-PO₄ чистым буфером, чтобы в растворе не осталось крови.

5. Обработка образцов для электронной микроскопии

1. Зафиксируют ткань в 2,5% глутаральдегиде/0,1 М Na-PO₄ (рН 7,4) в течение ~24 ч при +4 °C. Держите образец на вращающемся/встряхивающемся держателе образца для обеспечения надлежащей фиксации.
2. Извлеките фиксирующий раствор и несколько раз промойте образец 0,1 М Na-PO₄.
3. Рассекните образец на этом этапе.
   1. Поместите образец на каплю 0,1 М Na-PO₄ на рассекающую пластину. Если необходимо изобразить оба глаза одной и той же рыбы, разрежьте образец головы на две части тонкими рассекающими ножницами.
   2. Кроме того, собирайте глаза только путем осторожного размещения кончиков тонкого пинцета в глазницу со стороны глаза, уделяя особое внимание тому, чтобы не поцарапать поверхность глаза. Затем вытащите глаз из гнезда.
   3. Переложите рассеченный образец в пробирку, содержащую 0,1 М Na-PO₄. Убедитесь, что в пробирке для образцов нет лишней ткани, так как она может прилипать к верхней части глаза во время обработки образца.
4. Хранить образец в 0,1 М Na-PO₄ (максимум одну неделю) при температуре +4 °C.
5. Обработка образцов для электронной микроскопии.
   1. Постфиксируют образцы в 2% тетроксид осмия в буфере 0,1 М Na-PO₄ в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
   2. Промывайте образцы 3 раза в течение 5 минут, каждую промывку в 0,1 М Na-PO₄ на RT.
   3. Обезвоживать образцы последовательно в 30%, 50% и 70% этаноле в течение 1 ч в каждом растворе на РТ.
   4. Погружайте образцы в 96% этанол в течение 2-3 ч при РТ.
   5. Затем инкубируют образцы два раза в 100% этаноле, сначала в течение 1 ч, а затем в свежем 100% этаноле в течение ночи при +4 °C.
   6. Подвергайте образцы 30 циклам в автоматизированной сушилке критической точки.
6. Встраивание и платиновое покрытие образцов.
   1. Поместите клейкую вкладку на крепление. Если образец должен быть отмечен на верхней части крепления, оставьте лист бумаги для обложки вкладки на вкладке и напишите идентификатор образца на бумаге.
   2. Поместите крепление с помощью вкладки на основание рассекающего микроскопа.
   3. Аккуратно поместите образец ткани на крепление тонким пинцетом, роговицу вверх.
   4. Покрыть образец платиной с помощью соответствующего устройства. После нанесения покрытия храните образцы при комнатной температуре до получения изображения.

6. Визуализация (рисунок 2)

1. Работайте с устройствами в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве пользователя и экспертами по визуализации.
2. Получите изображения желаемого увеличения и используйте 2 000-2 500x изображений для анализа.
3. Отрегулируйте яркость и контрастность так, чтобы на изображении не было переэкспонированных областей, а границы ячеек и микрориджи были видны как можно четче.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положение и угол наклона ткани влияют на настройки яркости и контрастности. Возможно, потребуется отрегулировать их от образца к образцу и между различными областями ткани.

7. Измерение формы, размера и рисунка микрориджа

1. Откройте изображение TIFF в Fiji ImageJ 1.53²⁷. Задайте масштаб с помощью шкалы масштаба изображения: создайте линию, равную по размеру шкале масштаба с помощью инструмента «Линия ». Выберите Анализ | Задайте масштаб и введите в известном расстоянии. Откройте менеджер окупаемости инвестиций из | анализа Меню Инструменты .
2. Для параметра Размер ячейки и округлость выберите Анализ | Установка | измерений Дескрипторы фигур. Используйте инструмент «Увеличительное стекло », чтобы увидеть ячейки под увеличением. Выделите ячейки с помощью инструмента «Полигон » и добавьте каждый выделенный фрагмент в диспетчер окупаемости инвестиций. Наконец, измерьте выбранные ячейки и сохраните измерение.
3. Анализ микрориджа (рисунок 3 и рисунок 4)
   1. Убедитесь, что изображение находится в 8-битном формате из image | Меню ввода .
   2. Выделите ячейку с помощью инструмента « Полигон » и очистите фон в | «Правка». Очистите снаружи.
   3. Сгладьте изображение один-три раза, выбрав Обработать | Сглаживайте и регулируйте яркость и контрастность с помощью image | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность , чтобы микрориджи выделялись как можно более четко.
   4. Закрутите изображение из Process | фильтры | Convolve, превратитесь в двоичный из Process | Двоичные | Создайте двоичный файл и скелетируйте черно-белое изображение, выбрав Обработать | Двоичные | Скелетонизация.
   5. Использование функции Анализ скелета в | Анализа Скелетное меню для измерения параметров микрориджа и сохранения значений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В SEM отдельные изображения могут отличаться по яркости и контрастности. Таким образом, этапы анализа могут нуждаться в корректировке от изображения к изображению.

Результаты

Это исследование описывает метод с использованием офтальмологического заусенца в экспериментах по заживлению ран роговицы рыбок данио. Метод модифицирован по сравнению с предыдущими исследованиями на мышах, где было показано, что заусенец эффективно удаляет эпителиальные клеточные...

Обсуждение

Физические травмы роговицы являются наиболее распространенной причиной визитов пациентов офтальмологии в больницу. Поэтому важно установить соответствующие модели для изучения различных аспектов патофизиологии роговицы. До сих пор мышь является наиболее часто используемой модель?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica