الوقت الذي تم حله في الجسم الحي قياس ديناميكيات Neuropeptide بواسطة مسبار مناعي سعوي في قلب لحم الخنزير

Summary

تعتمد الطرق الكيميائية المناعية المعمول بها لقياس أجهزة إرسال الببتيد في الجسم الحي على غسيل الكلى المجهري أو سحب السوائل السائبة للحصول على العينة لتحليلها في وضع عدم الاتصال. ومع ذلك ، فإن هذه تعاني من قيود مكانية زمنية. يصف هذا البروتوكول تصنيع وتطبيق جهاز استشعار حيوي مناعي سعوي يتغلب على قيود التقنيات الحالية.

Abstract

إن القدرة على قياس المؤشرات الحيوية في الجسم الحي ذات الصلة بتقييم تطور المرض ذات أهمية كبيرة للأوساط العلمية والطبية. ويمكن أن يستغرق الحصول على استبانة النتائج التي يتم الحصول عليها من الطرق الحالية لقياس بعض المؤشرات الحيوية عدة أيام أو أسابيع، حيث يمكن أن تكون محدودة في الدقة مكانيا وزمنيا (على سبيل المثال، الغسيل المجهري لحجرة السوائل للسائل الخلالي الذي يتم تحليله بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم [ELISA]، أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء [HPLC]، أو قياس الطيف الكتلي)؛ وبالتالي ، فإن توجيههم للتشخيص والعلاج في الوقت المناسب يتعطل. في هذه الدراسة ، تم الإبلاغ عن تقنية فريدة للكشف عن أجهزة إرسال الببتيد وقياسها في الجسم الحي من خلال استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (مسبار CI). يتم وصف بروتوكول التصنيع والتوصيف في المختبر لهذه المجسات. يتم توفير قياسات لإطلاق neuropeptide Y (NPY) المستحضر للتحفيز الودي في الجسم الحي . يرتبط إصدار NPY بالإصدار الودي للنورادرينالين كمرجع. توضح البيانات نهجا للقياس السريع والموضعي للببتيدات العصبية في الجسم الحي. وتشمل التطبيقات المستقبلية التقييم في الوقت الحقيقي أثناء العملية الجراحية لتطور المرض والنشر القائم على القسطرة طفيفة التوغل لهذه المجسات.

Introduction

تستخدم العديد من الطرق الكيميائية للكشف عن المؤشرات الحيوية وقياسها بشكل روتيني في كل من كيمياء البروتين والتشخيص السريري ، خاصة في تشخيص السرطان وتقييم تطور أمراض القلب والأوعية الدموية. حاليا، تعتمد طرق مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وقياس الطيف الكتلي على جمع العينات من حجرة الأوعية الدموية¹،^2،3 عن طريق سحب السوائل السائبة أو المقصورة الخلالية عن طريق غسيل الكلى المجهري. يستخدم غسيل الكلى المجهري أنبوب غشاء شبه نافذ بطول معروف يتم وضعه في منطقة ذات أهمية. يتم تمرير سائل التجميع عبر الأنبوب على مدى عدة دقائق⁴ لجمع العينة للتحليل⁵ ، مما يحد من الدقة الزمنية. وبهذه الطريقة، لا توفر العينات المجمعة سوى قيمة متوسطة مع مرور الوقت للبيئة الدقيقة المحلية وتكون محدودة بمعدل التروية وجمع حجم كاف من العينات. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الأساليب تجميع البيانات التجريبية ومتوسط الإشارات؛ لذلك ، قد يفشلون في حساب التباين بين الموضوعات. الأهم من ذلك ، أن الوقت بين جمع العينات والتحليل اللاحق دون اتصال بالإنترنت يمنع التدخل السريري الفوري والعلاجات.

في هذا البروتوكول ، يتم تحديد استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (CI probe) للكشف الكهربائي الذي يتم حله في الوقت المناسب عن ببتيدات نشطة بيولوجيا محددة. Neuropeptide Y (NPY) ، الذي تم إطلاقه من الخلايا العصبية الودية ما بعد العقدية التي تعصب الأوعية الدموية ، والشغاف ، والخلايا العضلية القلبية ، والعقد داخل القلب ، هو ناقل الببتيد العصبي الرئيسي في نظام القلب والأوعية الدموية⁶،^7،8،9. تم تصميم الطريقة المعروضة هنا لقياس NPY ، ويتم توضيح الجدوى التجريبية في نموذج قلب الخنزير. ومع ذلك ، ينطبق هذا النهج على أي ببتيد نشط بيولوجيا يتوفر له جسم مضاد انتقائي¹⁰. تعتمد هذه الطريقة على التقاطع السعوي بين مسبار سلك بلاتيني والسائل الموصل عند الطرف الوظيفي^11,12. في هذا التطبيق ، تم التوسط في التفاعل من خلال جسم مضاد ضد neuropeptide المستهدف (NPY) ، والذي كان مرتبطا بطرف القطب الكهربائي ، وربط بيئة السائل الموصل. تم تحقيق هذا الأداء من خلال الترسيب الكهربائي لمادة البوليدوبامين التفاعلية على طرف مسبار الأسلاك البلاتينية^10,13.

عندما يتم وضع المسبار الوظيفي للأجسام المضادة في منطقة ذات أهمية في الجسم الحي ، يؤدي إطلاق NPY الداخلي المستحضر إلى الارتباط بالأجسام المضادة المحاصرة على طرف المسبار ، ويتم إزاحة السائل الموصل على سطح القطب الكهربائي بواسطة بروتين NPY. يؤدي التغيير المحلي في البيئة الكهربائية إلى إزاحة سائل عالي الحركة وعازل كهربائي عالي مع جزيء غير متحرك ومشحون بشكل ثابت. هذا يغير واجهة القطب والسائل ، وبالتالي ، سعته ، والتي تقاس كتغيير في تيار الشحنة استجابة لجهد أمر وظيفة الخطوة. يتم استخدام جهد "إعادة ضبط" سلبي مباشرة بعد كل دورة قياس فردية لصد NPY المرتبط من الجسم المضاد من خلال التفاعل الكهروستاتيكي ، وبالتالي تطهير مواقع ربط الأجسام المضادة لجولات القياس اللاحقة¹⁰. هذا يسمح بشكل فعال لقياس NPY بطريقة يتم حلها في الوقت المناسب. تتغلب تقنية CI الفريدة من نوعها على قيود الطرق الكيميائية المناعية القائمة على غسيل الكلى المجهري الموضحة أعلاه لقياس مستويات المؤشرات الحيوية الديناميكية من تجربة واحدة دون تجميع البيانات أو الإشارة في المتوسط على مدى العديد من التجارب⁹ ، مما يوفر البيانات في الوقت الفعلي تقريبا. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تكييف هذه الطريقة مع أي مؤشر حيوي ذي أهمية يوجد له جسم مضاد مناسب على نطاق زمني محدد ومحدد الموقع يوفر تقدما تقنيا كبيرا في القياس الكيميائي المناعي لتقييم تطور المرض وتوجيه التدخلات العلاجية.

وكان البرنامج الحاسوبي للحصول على البيانات وتحليلها مكتوبا خصيصا في IGOR Pro (بيئة برمجية تفاعلية بالكامل). أصدر نظام محول تناظري إلى رقمي (A / D) جهدا قياديا تحت سيطرة الكمبيوتر وحصل على بيانات من مكبر صوت مخصص. يمتلك مكبر الصوت بعض الميزات الفريدة. وشملت هذه مقاومة التغذية المرتدة (قابلة للتبديل) لكل قناة من قنوات الاستحواذ الأربع ، مما يسمح باختيار 1 MOhm أو 10 دوائر مشبك الجهد التغذية المرتدة MOhm لدمج تباين القطب الكهربائي. كما تم بناء وحدة مرحلة ذات رأس واحد ودائرة أرضية / مرجعية متبادلة لجميع قنوات الاستحواذ الأربع لوضع الجهاز بالقرب من الصدر في وحدة مادية واحدة. تم استخدام إعداد مقاوم التغذية المرتدة 1 MOhm لجمع جميع البيانات المبلغ عنها.

تم تلغراف إعدادات المرشح والكسب من مكبر الصوت وتسجيلها داخل ملف البيانات. تمت تصفية البيانات عند 1 كيلو هرتز عبر مرشح بيسل تناظري ثنائي القطب رقمي عند 10 كيلو هرتز. الفرق في الجهد بين المسبار والحل الموصل المحيط يخلق طبقة سعوية هيلمهولتز عند طرف المسبار. يؤدي ربط الليغاند بالجسم المضاد عند طرف المسبار إلى تغيير الشحنة المحلية ، وبالتالي تغيير في سعة هيلمهولتز. يؤدي هذا التغيير في المكون السعوي للدائرة إلى تحول في حجم الشحنة المحقونة المطلوبة لجلب المسبار إلى الجهد المحتمل في بروتوكول الجهد ذي الوظيفة التدريجية. وبالتالي ، فإن ربط رباط معين بالمسبار الوظيفي يؤدي إلى تغيير في قياس سعة القطب الكهربائي كتغيير في ذروة التيار السعوي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أبحاث الحيوانات بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية التي حددها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (الطبعة 8th ، 2011). تم استخدام خنازير يوركشاير الذكور البالغة التي يبلغ وزنها حوالي 75 كجم في دراسات الجسم الحي ¹⁰.

1. تصنيع المسبار المناعي السعوي ووظائفه

1. قم بقطع طول 25 سم من الأسلاك البلاتينية المطلية بالبيرفلوروألكوكسي (PFA) (انظر جدول المواد) وتجريد ما يقرب من 5 مم من طلاء PFA من أحد طرفيه باستخدام مشرط ، مع الحرص على عدم قطع السلك البلاتيني.
2. أدخل الطرف المجرد من السلك البلاتيني في دبوس موصل ذكر مطلي بالذهب مقاس 1 مم وقم بتجعيد أسنان دبوس الموصل حول الطرف المجرد من السلك البلاتيني باستخدام كماشة إبرة الأنف (انظر جدول المواد).
3. قم بلحام السلك البلاتيني بدبوس الموصل المطلي بالذهب. احرص على عدم استخدام كمية زائدة من اللحام.
4. تحضير محلول الدوبامين عن طريق إذابة 50 ملغ من الدوبامين HCl في 50 مل من 10 mM المالحة العازلة بالفوسفات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 6.0) عن طريق التحريك.
5. بمجرد إذابة الدوبامين تماما ، ضع طرف السلك البلاتيني في الوعاء الذي يحتوي على PBS المكمل بالدوبامين الطازج. قم بتوصيل دبوس موصل ذهبي بقناة من المنصة الرئيسية (انظر جدول المواد).
6. قم بتوصيل قطب القرص AgCl (القطب الأرضي، انظر جدول المواد) بالقناة الأرضية في المنصة. ضع قرص AgCl في الوعاء الذي يحتوي على PBS وأسلاك البلاتين المكملة بالدوبامين ؛ كن حريصا فقط على غمر قطب القرص وليس أي طول للسلك أو اللحام. قم بتوصيل تحويلة سلكية بالقنوات المرجعية للمنصة الرئيسية قبل المتابعة.
7. افتح برنامج الحصول على البيانات التفاعلي (انظر جدول المواد). قم بإعداد بروتوكول جهد أمر الترسيب الكهربائي لسن المنشار باستخدام المعلمات التالية: جهد البدء = −0.6 V ؛ نهاية المحتملة = +0.65 فولت ؛ معدل المسح الضوئي = 0.04 V∙^s-1 ؛ مدة الترسب = 420 ثانية. ابدأ بروتوكول ترسيب البوليدوبامين ، مما يضمن توصيل جميع الأسلاك بشكل صحيح.
8. بعد الانتهاء من ترسيب البوليدوبامين ، قم بإزالة حبيبة AgCl الأرضية وطرف السلك البلاتيني من السفينة ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف قطب سلك البلاتين. ضع طرف السلك في أنبوب دقيق يحتوي على PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 2-5 دقائق أثناء تحضير محلول الأجسام المضادة ؛ تأكد من أن طرف السلك لا يلامس جانبي أو أسفل الأنبوب الصغير.
   ملاحظة: يمكن إجراء محلول الأجسام المضادة أثناء ترسيب البوليدوبامين. ومع ذلك ، لا ينبغي تخطي نقل سلك البلاتين من الوعاء المحتوي على الدوبامين إلى الأنبوب الدقيق ل PBS بعد ترسب البولي دوبامين.
9. تحضير محلول الأجسام المضادة. الجمع بين الجسم المضاد للاهتمام مع PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) بنسبة 1:20 في وعاء بحجم مناسب (على سبيل المثال ، أنبوب صغير).
   ملاحظة: تم اقتباس الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل NPY (انظر جدول المواد) المستخدم هنا عند 1 ملغم / مل. مثال على إعداد الأجسام المضادة هنا سيكون 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى 76 ميكرولتر من PBS.
10. انقع الطرف المودع بالبوليدوبامين من القطب البلاتيني في محلول الأجسام المضادة لمدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن مرة أخرى تعليق طرف السلك البلاتيني في المحلول وعدم الاستلقاء على السطح الداخلي للأنبوب الدقيق.
    ملاحظة: فضل التنفيذ الأخير لهذه التقنية استخدام قطب الأسلاك البلاتينية مباشرة بعد هذه الخطوة بدلا من التخزين الرطب أو الجاف للاستخدام لاحقا.
11. بعد النقع في محلول الأجسام المضادة ، اشطف لفترة وجيزة طرف المسبار المناعي السعوي (CI probe) الذي تم تشغيله حديثا في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). المسبار جاهز الآن للاستخدام.

2. الإعداد التجريبي للكشف عن الببتيد في المختبر وقياسه

1. ضع الطرف الوظيفي لمسبار CI في غرفة التدفق ، مع الحرص على عدم إزعاج طرف القطب بأي شكل من الأشكال ، لأن القيام بذلك قد يؤدي إلى تلف الطرف الحسي للمسبار.
   ملاحظة: تم إنشاء غرفة التدفق عن طريق صب مطاط صناعي من السيليكون (انظر جدول المواد) في طبق استزراع 35 مم مع حشو مساحة بيضاوية ممدودة في وسط الطبق. بعد التصلب ، تتم إزالة الشكل البيضاوي من المطاط الصناعي. ثم يتم دمج الغرفة مع محلول ملحي مخزن مؤقتا (TBS) ويسمح بمعدل تدفق يبلغ 3 مل / دقيقة. تأكد من أن التدفق الداخلي والخارجي يحافظ على مستوى السائل في الغرفة بحيث لا يلاحظ أي عمل مد وجزر لل superfusate. يجب أن يظل التدفق في مكانه طالما أن مسبار CI قيد الاستخدام.
2. قبل الاختبار التجريبي الأول ، قم بإجراء تشغيل قياسي TBS لتهيئة مسبار CI. قم بإعداد بروتوكول جهد الأوامر التالي: جهد الخطوة الإيجابية = +100 mV ؛ جهد الخطوة السالبة = −5 mV ؛ مدة الخطوة = 20 مللي ثانية ؛ مدة الاستحواذ = 600 ثانية.
   ملاحظة: من المهم السماح بتوازن المسبار خلال المرحلة الأولية من إمكانات قيادة ركوب الدراجات قبل الحصول على البيانات.
3. قم بإنشاء حل للببتيد ذي الأهمية باستخدام نفس TBS للحفاظ على تكوين superfusate. قم بإعداد نظام متعدد حيث يمكن تبديل الفوسات الفائقة بين TBS و TBS المكمل بالببتيد دون إدخال فقاعات في نظام الأنابيب أو غرفة التدفق.
   ملاحظة: تم استخدام ببتيد الخنزير الاصطناعي NPY (انظر جدول المواد) في هذه الدراسة.
4. قم بإعداد بروتوكول الحصول على بيانات استشعار الببتيد باستخدام معلمات TBS القياسية (انظر الخطوة 2.2).
   ملاحظة: في هذا التنفيذ، كانت مدة كل اختبار تجريبي 360 ثانية (120 ثانية TBS، 120 ثانية TBS المكمل بالببتيد، 120 ثانية TBS).

3. تكييف مسبار CI للاستخدام في الجسم الحي

1. قبل ترسب البوليدوبامين (الخطوة 1.7) ، قم بربط الطرف المكشوف لقطب السلك البلاتيني من خلال إبرة تحت الجلد 22 جم ، تاركا حوالي 2 مم وراء طرف الإبرة. باستخدام الملقط ، ثني بلطف طرف قطب السلك البلاتيني ، مما يخلق "بارب" يتدلى من نهاية الإبرة تحت الجلد.
   1. اسحب الإبرة بلطف من الطرف الشائك ، تاركا ما يكفي من الأسلاك لوضعها في الوعاء دون أن تلامس الإبرة السائل. تابع الخطوات من 1.4.إلى 1.11.
      ملاحظة: اعتمادا على الإعداد في الجسم الحي ، قد يكون من الضروري قطع طول سلك البلاتين لفترة أطول من 25 سم.
2. قبل توصيل مسبار CI بالمنصة، تأكد من أن الإعداد الكهربائي بأكمله مثبت بشكل صحيح. قد يؤدي الفشل في القيام بذلك إلى حدوث تداخل كهربائي غير مرغوب فيه أثناء التسجيلات التجريبية.
3. تخدير الحيوانات بعد نشر تقرير سابق¹⁰.
4. إجراء عملية جراحية لفضح المنطقة محل الاهتمام.
   ملاحظة: تم إجراء بضع القص المتوسط في هذه الدراسة لفضح القلب. يرجى الاطلاع على Kluge et ^al.10 للحصول على تفاصيل حول جراحة الحيوانات.
5. قم بإزالة الطرف الوظيفي بلطف من شطف PBS (الخطوة 1.11) ، وقم بإعادة توجيه إبرة hydodermic إلى مسبار C.I. الشائك وازرعه بلطف في المنطقة ذات الأهمية قبل توصيل دبوس الموصل الذهبي في المنصة. بمجرد زرعها ، اسحب الإبرة تحت الجلد ، تاركا القطب الكهربائي في مكانه.
   ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم وضع المسبار في الجدار الجانبي الأوسط لعضلة القلب البطينية اليسرى¹⁰.
6. بعد التأكد من الإعداد الكهربائي المناسب، تابع بروتوكولات الاختبار القياسية والتجريبية (الخطوة 2.2. والخطوة 2.4).
7. عند الانتهاء من التجارب ، القتل الرحيم للحيوان باتباع التقنيات المعتمدة مؤسسيا.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم قتل الحيوانات الرحيم تحت التخدير العميق عن طريق تحريض الرجفان البطيني¹⁰.

النتائج

تصنيع القطب الكهربائي وتوصيف
تم تصنيع مسبار مناعي سعوي مرن (تحقيقات CI) ، وتظهر صورة تمثيلية في الشكل 1A. تم تعيين جهد القطب الكهربائي بواسطة دائرة مشبك الجهد التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر (الشكل 1B) ، وتم غمر القطب الكهربائي في محلول متعدد ا?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول تصنيع واختبار مسبار مناعي سعوي (مسبار CI) قادر على اكتشاف وقياس المؤشرات الحيوية ذات الأهمية في كل من المختبر والجسم الحي . يتم تحقيق الكشف عن طريق محاصرة العلامة الحيوية عند طرف القطب الكهربائي. يغير حدث الاصطياد التقاطع السعوي بين مسبار مناعي سعوي من الأسلاك ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654