通过电容式免疫探 针在猪 心中对神经肽动力学进行时间分辨体内测量

摘要

已建立的免疫化学方法 在体内 测量肽递质，依靠微透析或体液抽取来获得样品进行离线分析。但是，这些都受到时空限制。本方案描述了克服现有技术局限性的电容式免疫探针生物传感器的制造和应用。

摘要

在 体内 测量与疾病进展评估相关的生物标志物的能力是科学界和医学界非常感兴趣的。从当前测量某些生物标志物的方法获得的结果的分辨率可能需要几天或几周才能获得，因为它们在空间和时间上的分辨率都受到限制（例如，通过酶联免疫吸附测定[ELISA]，高效液相色谱[HPLC]或质谱分析的间质液的流体室微透析）;因此，他们对及时诊断和治疗的指导被打乱了。在本研究中，报道了通过使用电容式免疫探针生物传感器（CI探针） 在体内 检测和测量肽递质的独特技术。描述了这些探针的制造方案和 体外 表征。提供交感神经刺激诱导的神经肽Y（NPY） 在体内 释放的测量。NPY释放与去甲肾上腺素的交感神经释放相关，以供参考。数据证明了一种 在体内快速和局部测量神经肽的方法。未来的应用包括术中实时评估疾病进展和基于微创导管的这些探针部署。

引言

用于检测和定量生物标志物的几种化学方法通常用于蛋白质化学和临床诊断，特别是在癌症诊断和心血管疾病进展评估中。目前，诸如高效液相色谱（HPLC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和质谱等方法依赖于通过本体流体抽取从血管区^1，2，3 或通过微透析从血管区室收集样品。微透析采用已知长度的半透膜管，放置在感兴趣的区域。收集液通过管^注水4 分钟以收集样品进行分析⁵，从而限制了时间分辨率。以这种方式，收集的样品仅提供局部微环境随时间变化的平均值，并且受到灌注速率和收集足够样品体积的限制。此外，这些方法需要汇集实验数据和信号平均;因此，他们可能无法解释受试者之间的可变性。重要的是，样本收集和随后的离线分析之间的时间排除了即时临床干预和治疗。

在本方案中，概述了使用电容式免疫探针生物传感器（CI探针）对特定生物活性肽进行时间分辨电检测。神经肽Y（NPY）从神经节后交感神经元释放，支配脉管系统，心内膜，心肌细胞和心内神经节，是心血管系统中主要的神经调节肽递质^{6，7，8，9}。本文提出的方法旨在测量NPY，并在猪心模型中证明了实验可行性。然而，这种方法适用于任何生物活性肽，其选择性抗体是可用的¹⁰。该方法依赖于铂丝探头与功能化尖端^11，12处的导电流体之间的电容结。在该应用中，相互作用通过针对靶神经肽（NPY）的抗体介导，该抗体与电极尖端结合，与导电流体环境连接。这种功能化是通过反应性聚多巴胺电沉积到铂丝探针^10，13的尖端来实现的。

当抗体功能化探针放置在体内感兴趣的区域 时，诱发的内源性NPY释放导致与探针尖端上的捕获抗体结合，并且电极表面的导电液被NPY蛋白置换。电气环境中的局部变化导致具有高迁移率，高介电流体的位移，具有不动的带静电的分子。这改变了电极 - 流体界面，从而改变了其电容，其被测量为响应阶跃函数命令电位的电荷电流的变化。在每个单独的测量周期之后立即采用负的"复位"电位，通过静电相互作用排斥抗体中结合的NPY，从而清除抗体结合位点以进行后续的测量¹⁰。这有效地允许以时间分辨的方式测量NPY。独特的CI技术克服了上述基于微透析的免疫化学方法的局限性，从单个实验中测量动态生物标志物水平，而无需在多个实验上进行数据池或信号平均⁹，提供近乎实时的数据。此外，将这种方法适应任何感兴趣的生物标志物的能力，在时间分辨和局部尺度上存在适当的抗体，为评估疾病进展和指导治疗干预提供了免疫化学测量的重大技术进步。

用于数据采集和分析的软件是用IGOR Pro（一个完全交互式的软件环境）定制的。模数转换器（A/D）系统在计算机控制下发出命令电压，并从定制放大器获取数据。该放大器具有某些独特的功能。这些器件包括一个反馈电阻（可切换），用于四个采集通道中的每一个，允许选择1 MOhm或10 MOhm反馈电压钳位电路来集成电极的可变性。还构建了一个具有单个磁头和所有四个采集通道的相互接地/参考电路的载物台单元，以将设备放置在单个物理模块中靠近胸部的位置。使用1 MOhm反馈电阻设置来收集所有报告的数据。

滤波器和增益设置由放大器电报，并记录在数据文件中。数据通过10 kHz数字化的2极点模拟贝塞尔滤波器以1 kHz进行滤波。探头和周围导电溶液之间的电位差在探头尖端形成亥姆霍兹电容层。配体与探针尖端的抗体结合导致局部电荷改变，从而导致亥姆霍兹电容的变化。电路容性分量的这种变化导致将探头带到阶跃函数电压协议中的电位所需的注入电荷大小发生变化。因此，特定配体与功能化探头的结合导致电极电容测量的变化，作为峰值电容电流的变化。

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研究方案

所有动物实验均获得加州大学洛杉矶分校动物研究委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（第8版，2011年）制定的指南进行。约75公斤的成年雄性约克郡猪用于 体内 研究¹⁰。

1. 电容式免疫探针制造和功能化

1. 使用手术刀从一端切割25厘米长的全氟烷氧（PFA）涂层铂丝（见 材料表），并从一端剥离约5毫米的PFA涂层，小心不要切入铂丝。
2. 将铂线的剥离端插入镀金的 1 mm 公连接器引脚，并使用针尖钳将连接器引脚齿压接到剥离的铂线末端周围（请参见 材料表）。
3. 将铂线焊接到镀金连接器引脚上。注意不要使用过量的焊料。
4. 通过将50mg多巴胺盐酸盐溶解在50mL的10mM磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 6.0）中通过搅拌来制备多巴胺溶液。
5. 一旦多巴胺完全溶解，将铂丝的尖端放在含有新鲜制作的多巴胺补充PBS的容器中。将金色连接器引脚插入头台的通道（请参见 材料表）。
6. 将 AgCl 圆盘电极（接地电极，参见 材料表）连接到头台的接地通道。将AgCl盘置于含有多巴胺补充PBS和铂丝的容器中;小心只浸没圆盘电极，不要浸没任何长度的导线或焊料。在继续之前，将导线分流器连接到头台的参考通道。
7. 打开交互式数据采集软件（见 材料表）。使用以下参数准备锯齿电沉积命令电位协议:起始电位= −0.6 V;端电位 = +0.65 V;扫描速率 = 0.04 V∙^s-1;沉积持续时间 = 420 s.开始聚多巴胺沉积方案，确保所有电线正确连接。
8. 完成聚多巴胺沉积后，从容器中取出AgCl研磨颗粒和铂丝的尖端，注意不要干扰铂丝电极的尖端。将导线的尖端放入含有PBS（pH 7.4）的微管中2-5分钟，作为制备抗体溶液;确保电线尖端不接触微管的侧面或底部。
   注意:抗体溶液可以在聚多巴胺沉积期间制成;然而，不应跳过在聚多巴胺沉积后将铂丝从含多巴胺的容器转移到PBS的微管中。
9. 准备抗体溶液。将感兴趣的抗体与PBS（pH 7.4）在适当大小的容器（例如，微管）中以1:20的比例组合。
   注:此处使用的抗NPY单克隆抗体（见 材料表）以1mg / mL等分;此处的示例抗体制备是4μL抗体对76μLPBS的抗体。
10. 在室温下将铂电极的聚多巴胺沉积尖端浸泡在抗体溶液中至少2小时，再次确保铂丝尖端悬浮在溶液中并且不停留在微管的内表面上。
    注意:该技术的最新实施倾向于在此步骤后立即使用铂丝电极，而不是湿式或干式储存以备后用。
11. 浸泡在抗体溶液中后，在PBS（pH 7.4）中短暂冲洗新功能化的电容式免疫探针（CI探针）尖端。探头现已准备就绪，可供使用。

2. 用于体外 检测和肽测量的实验装置

1. 将CI探针的功能尖端放入流动室中，注意不要以任何方式干扰电极的尖端，因为这样做可能会损坏探头的感觉尖端。
   注意:通过将有机硅弹性体（参见 材料表）倒入35毫米培养皿中并在培养皿中心使用细长的卵形空间填充剂来创建流动室。硬化后，从弹性体中去除卵形。然后用Tris缓冲盐水（TBS）补充腔室，并允许流速为3 mL / min。确保流入和流出保持腔室中的液位，以便不观察到过强熔酸盐的潮汐作用。只要CI探头在使用中，流量就必须保持在原位。
2. 在第一次实验测试之前，执行TBS标准运行以调节CI探针。设置以下命令电压协议:正阶跃电位= +100 mV;负阶跃电位 = −5 mV;步长 = 20 ms;采集持续时间 = 600 s。
   注意:在数据采集之前，在循环命令电位的初始阶段允许探头平衡非常重要。
3. 使用相同的TBS创建目标肽的溶液以维持超级富酸盐的组成。建立一个歧管系统，其中超级富集液可以在TBS和肽补充剂TBS之间切换，而不会将气泡引入管道系统或流动室。
   注:本研究使用合成猪NPY肽（见 材料表）。
4. 使用TBS标准参数设置肽传感数据采集方案（见步骤2.2）。
   注意:在此实施中，每个实验测试的持续时间为360 s（120 s TBS，120 s肽补充TBS，120 s TBS）。

3. CI探针的适配，适合 体内 使用

1. 在聚多巴胺沉积（步骤1.7.）之前，将铂丝电极的暴露尖端穿过22G皮下注射针，在针尖外留下约2mm。使用镊子，轻轻地向后弯曲铂丝电极的尖端，形成悬挂在皮下注射针末端的"倒钩"。
   1. 轻轻地将针头从带刺的尖端中取出，留下足够的铁丝以放置在容器中，而不会使针接触流体。继续执行步骤 1.4.-1.11。
      注意:根据 体内 设置，可能需要切割长度超过25厘米的铂丝。
2. 在将CI探头连接到头台之前，请确保整个电气设置正确接地。如果不这样做，可能会在实验记录期间引入不必要的电气干扰。
3. 在先前发表的报告¹⁰之后麻醉动物。
4. 进行手术以暴露感兴趣的区域。
   注意:在本研究中进行了中位胸骨切开术以暴露心脏。有关动物手术的详细信息，请参阅Kluge等人¹⁰ 。
5. 轻轻地从PBS冲洗器中取出功能化的尖端（步骤1.11），将吸湿性针头向前插入倒钩的CI探头，然后将其轻轻地植入感兴趣的区域，然后将金色连接器引脚插入头台。植入后，取出皮下注射针头，将电极留在原位。
   注意:对于本研究，将探针放置在左心室^心肌10的中侧壁中。
6. 确保正确的电气设置后，继续进行标准和实验测试协议（步骤2.2和步骤2.4）。
7. 实验完成后，按照机构批准的技术对动物实施安乐死。
   注意:在本研究中， 通过 诱导心室颤动在深度麻醉下对动物实施安乐死¹⁰。

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结果

电极制造和表征
制备了柔性电容式免疫探针（CI探针），并描绘了具有代表性的图像 如图1A所示。电极电位由计算机控制的电压钳位电路设置（图1B），并将电极浸入PBS中制成的聚多巴胺溶液中。将聚多巴胺电沉积到导电电极尖端¹³ 上进行功能化。命令电位驱动探头电压，并测量注入的箝位电流。在单周期聚多巴胺沉积...

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讨论

本方案描述了能够在 体外 和体内环境中检测和测量感兴趣的生物标志物的电容式免疫探针（CI探针）的制造和 测试 。通过将生物标志物捕获在电极尖端来实现检测。捕获事件改变了铂丝电容式免疫探针与周围导电流体环境之间的电容结，测量为响应探头中电位移位的电荷电流变化。还提出了一种独特的电采集方案，该方案允许通过静电排斥探针尖端上捕获的生物标志物，在检测周?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654