Измерение динамики нейропептидов in vivo с временным разрешением с помощью емкостного иммунозонда в сердце свиней

Резюме

Установленные иммунохимические методы измерения пептидных передатчиков in vivo полагаются на микродиализ или объемное извлечение жидкости для получения образца для автономного анализа. Тем не менее, они страдают от пространственно-временных ограничений. Настоящий протокол описывает изготовление и применение емкостного иммунозондового биосенсора, который преодолевает ограничения существующих методов.

Аннотация

Возможность измерения биомаркеров in vivo, имеющих отношение к оценке прогрессирования заболевания, представляет большой интерес для научного и медицинского сообществ. Разрешение результатов, полученных в результате современных методов измерения определенных биомаркеров, может занять несколько дней или недель для получения, поскольку они могут быть ограничены в разрешении как пространственно, так и временно (например, микродиализ жидкостного компартмента интерстициальной жидкости, анализируемой с помощью иммуноферментного анализа [ИФА], высокоэффективной жидкостной хроматографии [ВЭЖХ] или масс-спектрометрии); таким образом, нарушается их руководство своевременной диагностикой и лечением. В настоящем исследовании сообщается об уникальном методе обнаружения и измерения пептидных передатчиков in vivo с использованием емкостного биосенсора иммунозонда (CI probe). Описан протокол изготовления и характеристика in vitro этих зондов. Приведены измерения высвобождения in vivo вызванного симпатической стимуляцией нейропептида Y (NPY). Высвобождение NPY коррелирует с симпатическим высвобождением норадреналина для справки. Данные демонстрируют подход к быстрому и локализованному измерению нейропептидов in vivo. Будущие приложения включают интраоперационную оценку прогрессирования заболевания в режиме реального времени и минимально инвазивное развертывание этих зондов на основе катетера.

Введение

Несколько химических методов обнаружения и количественной оценки биомаркеров обычно используются как в химии белка, так и в клинической диагностике, особенно в диагностике рака и оценке прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуноферментный анализ (ИФА) и масс-спектрометрия, основаны на сборе проб из сосудистого компартмента ^1,2,3 путем объемного забора жидкости или интерстициального компартмента путем микродиализа. Микродиализ использует полупроницаемую мембранную трубку известной длины, которая помещается в интересующую область. Всасывающая жидкость перфузируется через пробирку в течение нескольких минут⁴ для сбора образца для анализа⁵, тем самым ограничивая временное разрешение. Таким образом, собранные образцы обеспечивают только усредненную стоимость с течением времени местной микроокружения и ограничены скоростью перфузии и сбором достаточного объема образца. Кроме того, эти методы требуют объединения экспериментальных данных и усреднения сигналов; поэтому они могут не учитывать изменчивость между субъектами. Важно отметить, что время между сбором проб и последующим автономным анализом исключает немедленное клиническое вмешательство и терапию.

В настоящем протоколе описано использование емкостного иммунозондового биосенсора (CI-зонда) для электрического обнаружения специфических биоактивных пептидов с временным разрешением. Нейропептид Y (NPY), высвобождаемый из постганглионарных симпатических нейронов, которые иннервируют сосудистую систему, эндокард, кардиомиоциты и внутрисердечные ганглии, является основным нейромодулирующим пептидным передатчиком в сердечно-сосудистой системе 6,7,8,9. Метод, представленный здесь, предназначен для измерения NPY, а экспериментальная осуществимость демонстрируется в модели сердца свиней. Однако этот подход применим к любому биологически активному пептиду, для которого доступно селективное антитело¹⁰. Этот способ основан на емкостном соединении между зондом из платиновой проволоки и проводящей жидкостью на функционализированном наконечнике^11,12. В этом приложении взаимодействие опосредовано через антитело против целевого нейропептида (NPY), который был связан с наконечником электрода, взаимодействуя со средой проводящей жидкости. Эта функционализация была достигнута путем электроосаждения реакционноспособного полидофамина на наконечник зонда^10,13 из платиновой ^{проволоки}.

Когда функционализированный антителами зонд помещается в интересующую область in vivo, вызванное эндогенное высвобождение NPY приводит к связыванию с улавливающими антителами на кончике зонда, и проводящая жидкость на поверхности электрода смещается белком NPY. Локальное изменение в электрической среде приводит к вытеснению высокомобильной, высокодиэлектрической жидкости неподвижной, статически заряженной молекулой. Это изменяет интерфейс электрод-жидкость и, таким образом, его емкость, которая измеряется как изменение тока заряда в ответ на командный потенциал ступенчатой функции. Отрицательный потенциал «сброса» используется сразу после каждого отдельного цикла измерения для отталкивания связанного NPY от антитела посредством электростатического взаимодействия, тем самым очищая сайты связывания антител для последующих раундов измерения¹⁰. Это позволяет эффективно измерять NPY с временным разрешением. Уникальный метод CI преодолевает ограничения иммунохимических методов на основе микродиализа, описанных выше, для измерения динамических уровней биомаркеров из одного эксперимента без объединения данных или усреднения сигналов в течение нескольких экспериментов⁹, предоставляя данные почти в режиме реального времени. Более того, способность адаптировать этот метод к любому биомаркеру, представляющему интерес, для которого существует соответствующее антитело в масштабе с временным разрешением и локализацией, обеспечивает значительный технический прогресс в иммунохимическом измерении для оценки прогрессирования заболевания и руководства терапевтическими вмешательствами.

Программное обеспечение для сбора и анализа данных было написано на заказ в IGOR Pro (полностью интерактивная программная среда). Система аналого-цифрового преобразователя (A/D) выдавала командное напряжение под управлением компьютера и получала данные от пользовательского усилителя. Усилитель обладал определенными уникальными особенностями. Они включали резистор обратной связи (переключаемый) для каждого из четырех каналов сбора, что позволяло выбирать цепи зажима напряжения обратной связи 1 МОм или 10 МОм для интеграции вариативности электрода. Блок ступени с одной головкой и взаимной схемой заземления/отсчета для всех четырех каналов сбора также был построен для размещения устройства рядом с сундуком в одном физическом модуле. Для сбора всех сообщаемых данных использовалась настройка резистора обратной связи 1 МОм.

Настройки фильтра и усиления передавались по телеграфу с усилителя и записывались в файл данных. Данные фильтровались на частоте 1 кГц с помощью 2-полюсного аналогового фильтра Бесселя, оцифрованного на частоте 10 кГц. Разница в потенциале между зондом и окружающим проводящим раствором создает емкостный слой Гельмгольца на кончике зонда. Связывание лиганда с антителом на кончике зонда приводит к изменению местного заряда и, таким образом, изменению емкости Гельмгольца. Это изменение емкостной составляющей цепи приводит к сдвигу величины впрыскиваемого заряда, необходимого для приведения зонда к потенциалу в протоколе напряжения ступенчатой функции. Таким образом, связывание конкретного лиганда с функционализированным зондом приводит к изменению измерения емкости электрода как изменение пикового емкостного тока.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по исследованию животных Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и выполнены в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание, 2011). Взрослые самцы йоркширских свиней весом около 75 кг использовались для исследований in vivo ¹⁰.

1. Изготовление и функционализация емкостных иммунозондов

1. Вырежьте платиновую проволоку с перфторалкокси (PFA) длиной 25 см (см. Таблицу материалов) и снимите примерно 5 мм покрытия PFA с одного конца с помощью скальпеля, стараясь не разрезать платиновую проволоку.
2. Вставьте зачищенный конец платинового провода в позолоченный штырь разъема диаметром 1 мм и обрежьте зубья штыря разъема вокруг зачищенного конца платинового провода плоскогубцами (см. Таблицу материалов).
3. Припаяйте платиновый провод к позолоченному контакту разъема. Будьте осторожны, чтобы не использовать чрезмерное количество припоя.
4. Готовят раствор дофамина, растворяя 50 мг дофамина HCl в 50 мл 10 мМ фосфат-буферного физиологического раствора (PBS, pH 6,0) путем перемешивания.
5. Как только дофамин полностью растворится, поместите наконечник платиновой проволоки в сосуд, содержащий свежеприготовленный дофамин PBS. Подключите золотой контакт разъема к каналу головной сцены (см. Таблицу материалов).
6. Подключите дисковый электрод AgCl (заземляющий электрод, см. Таблицу материалов) к заземляющему каналу в головной ступени. Поместите диск AgCl в сосуд, содержащий PBS, дополненный дофамином, и платиновую проволоку; будьте осторожны только для погружения дискового электрода, а не любой длины провода или припоя. Подключите шунт провода к опорным каналам головной ступени перед продолжением.
7. Откройте интерактивное программное обеспечение для сбора данных (см. Таблицу материалов). Подготовьте протокол потенциала команды электроосаждения пилообразного электроосаждения со следующими параметрами: пусковой потенциал = −0,6 В; конечный потенциал = +0,65 В; скорость сканирования = 0,04 В∙^с-1; продолжительность осаждения = 420 с. Начните протокол осаждения полидофамина, убедившись, что все провода подключены правильно.
8. После завершения осаждения полидофамина удалите гранулу AgCl и наконечник платиновой проволоки из сосуда, стараясь не потревожить наконечник электрода из платиновой проволоки. Поместите кончик проволоки в микротрубку, содержащую PBS (pH 7,4) на 2-5 мин по мере приготовления раствора антител; Убедитесь, что наконечник проволоки не соприкасается с боковыми или нижними сторонами микропробирки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор антител может быть получен во время осаждения полидофамина; однако перенос платиновой проволоки из сосуда, содержащего дофамин, в микропробирку PBS после осаждения полидофамина не следует пропускать.
9. Готовят раствор антител. Объедините интересующее антитело с PBS (рН 7,4) в соотношении 1:20 в сосуде соответствующего размера (например, в микротрубке).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-NPY моноклональное антитело (см. Таблицу материалов), используемое здесь, было аликвотировано при 1 мг/мл; примером препарата антител здесь может быть 4 мкл антитела к 76 мкл PBS.
10. Замочите осажденный полидопамином наконечник платинового электрода в растворе антител в течение как минимум 2 ч при комнатной температуре, снова гарантируя, что наконечник платиновой проволоки подвешен в растворе и не опирается на внутреннюю поверхность микротрубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недавняя реализация этого метода благоприятствовала использованию электрода из платиновой проволоки сразу после этого этапа вместо влажного или сухого хранения для последующего использования.
11. После замачивания в растворе антител кратковременно промойте наконечник недавно функционализированного емкостного иммунозонда (CI probe) в PBS (pH 7,4). Теперь зонд готов к использованию.

2. Экспериментальная установка для обнаружения и измерения пептида in vitro

1. Поместите функциональный наконечник зонда CI в проточную камеру, заботясь о том, чтобы никоим образом не потревожить кончик электрода, так как это может повредить сенсорный наконечник зонда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проточная камера была создана путем заливки силиконового эластомера (см. Таблицу материалов) в 35-миллиметровую культуральную посуду с удлиненным яйцевидным наполнителем пространства в центре тарелки. После затвердевания яйцевидная форма удаляется из эластомера. Затем камеру наливают трис-буферным физиологическим раствором (TBS) и пропускают скорость потока 3 мл/мин. Убедитесь, что приток и отток поддерживают уровень жидкости в камере таким образом, чтобы не наблюдалось приливного действия суперфузата. Поток должен оставаться на месте до тех пор, пока используется зонд CI.
2. Перед первым экспериментальным испытанием выполните стандартный запуск TBS для кондиционирования зонда CI. Настройте следующий командный протокол напряжения: положительный шаговый потенциал = +100 мВ; отрицательный шаговый потенциал = −5 мВ; длительность шага = 20 мс; продолжительность приобретения = 600 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно обеспечить уравновешивание зонда на начальном этапе циклического командного потенциала до сбора данных.
3. Создайте раствор интересующего пептида, используя тот же TBS для поддержания состава суперфузата. Настройте коллекторную систему, в которой суперфьюзат можно переключать между TBS и TBS, дополненным пептидами, без введения пузырьков в систему трубок или проточную камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовался синтетический пептид NPY свиней (см. Таблицу материалов).
4. Настройте протокол сбора данных, чувствительный к пептидам, используя стандартные параметры TBS (см. шаг 2.2.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данной реализации продолжительность каждого экспериментального испытания составляла 360 с (120 с TBS, 120 s пептид-дополненный TBS, 120 s TBS).

3. Адаптация зонда CI для использования in vivo

1. Перед осаждением полидофамина (стадия 1.7.) проденьте открытый наконечник электрода из платиновой проволоки через подкожную иглу 22 G, оставив примерно 2 мм за кончиком иглы. Используя щипцы, аккуратно отогните назад кончик платинового проволочного электрода, создав «колючку», которая свисает с конца подкожной иглы.
   1. Осторожно выньте иглу из колючего наконечника, оставив достаточно проволоки, чтобы поместить ее в сосуд без контакта иглы с жидкостью. Перейдите к шагам 1.4.-1.11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от настроек in vivo может потребоваться разрезать длину платиновой проволоки длиной более 25 см.
2. Перед подключением датчика CI к головной станции убедитесь, что вся электрическая установка правильно заземлена. Невыполнение этого требования может привести к нежелательным электрическим помехам во время экспериментальных записей.
3. Обезболивайте животных после ранее опубликованного отчета¹⁰.
4. Выполните операцию, чтобы обнажить интересующую область.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Срединная стернотомия была выполнена в настоящем исследовании для обнажения сердца. Пожалуйста, смотрите Kluge et ^al.10 для получения подробной информации о хирургии животных.
5. Аккуратно извлеките функционализированный наконечник из ополаскивателя PBS (шаг 1.11.), передайте гидодермическую иглу на колючий зонд C.I. и аккуратно имплантируйте его в интересующую область, прежде чем подключать золотой штифт разъема к головной сцене. После имплантации извлеките подкожную иглу, оставив электрод на месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования зонд был помещен в среднюю боковую стенку миокарда левого желудочка¹⁰.
6. После обеспечения надлежащей электрической настройки приступайте к стандартным и экспериментальным протоколам испытаний (шаг 2.2. и шаг 2.4.).
7. По завершении экспериментов усыплите животное в соответствии с институционально утвержденными методами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании животных усыпляют под глубоким наркозом путем индукции фибрилляции желудочков¹⁰.

Результаты

Изготовление и определение характеристик электродов
Был изготовлен гибкий емкостный иммунозонд (зонды CI), и репрезентативное изображение изображено на рисунке 1A. Электродный потенциал устанавливали с помощью управляемой компьютером цепи зажима напряжения...

Обсуждение

Настоящий протокол описывает изготовление и тестирование емкостного иммунозонда (зонда CI), способного обнаруживать и измерять биомаркеры, представляющие интерес как в условиях in vitro , так и in vivo . Обнаружение достигается путем улавливания биомаркера на кончике электрода. Собы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654