돼지 심장에서 용량 성 면역 프로브에 의한 신경 펩티드 역학의 시간 해결 생체 내 측정

요약

생체 내에서 펩티드 전달체를 측정하기 위해 확립된 면역화학적 방법은 오프라인 분석을 위한 샘플을 얻기 위해 미세투석 또는 벌크 유체 드로우에 의존한다. 그러나 이들은 시공간 적 한계로 고통 받고 있습니다. 본 프로토콜은 기존 기술의 한계를 극복하는 용량성 면역프로브 바이오센서의 제조 및 적용을 기술한다.

초록

질병 진행의 평가와 관련된 생체내 바이오마커를 측정하는 능력은 과학 및 의학계에 큰 관심사이다. 특정 바이오마커를 측정하는 현재의 방법으로부터 수득된 결과의 분해능은 공간적 및 시간적 분해능에서 제한될 수 있기 때문에 수득하는데 수일 또는 수주가 걸릴 수 있다(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석법[ELISA], 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC], 또는 질량 분광법에 의해 분석된 간질성 유체의 유체 구획 미세투석); 따라서시기 적절한 진단과 치료에 대한 지침이 중단됩니다. 본 연구에서는, 용량성 면역프로브 바이오센서(CI probe)의 사용을 통해 생체내에서 펩티드 전달물질을 검출 및 측정하기 위한 독특한 기술이 보고되었다. 이들 프로브의 제조 프로토콜 및 시험관내 특성화가 기재되어 있다. 생체내에서 교감신경자극-유발된 신경펩티드 Y(NPY) 방출의 측정이 제공된다. NPY 방출은 참고로 노르에피네프린의 교감신경 방출과 상관관계가 있다. 이 데이터는 생체 내에서 신경 펩티드의 빠르고 국소화된 측정을 위한 접근법을 입증한다. 향후 적용에는 질병 진행에 대한 수술 내 실시간 평가 및 이러한 프로브의 최소 침습적 카테터 기반 배치가 포함됩니다.

서문

바이오마커를 검출하고 정량화하기 위한 몇 가지 화학적 방법은 단백질 화학 및 임상 진단, 특히 암 진단 및 심혈관 질환 진행 평가에서 일상적으로 활용됩니다. 현재, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 및 질량 분광법과 같은 방법은 미세투석에 의한 벌크 유체 드로 또는 간질성 구획에 의한 혈관 구획 ^1,2,3으로부터의 샘플 수집에 의존한다. 미세투석은 관심 영역에 배치되는 공지된 길이의 반투과성 막 튜브를 사용한다. 수집 유체는 분석(⁵)을 위해 샘플을 수집하기 위해 수 분에 걸쳐 튜브⁽⁴)를 통해 관류되고, 따라서 시간적 분해능을 제한한다. 이러한 방식으로, 수집된 샘플은 국소 미세환경의 시간에 따른 평균화된 값만을 제공하고, 충분한 샘플 부피의 관류 속도 및 수집에 의해 제한된다. 또한, 이러한 방법은 실험 데이터 및 신호 평균화의 풀링을 필요로합니다. 따라서 피험자 간의 변동성을 설명하지 못할 수 있습니다. 중요한 것은 샘플 수집과 후속 오프라인 분석 사이의 시간이 즉각적인 임상 개입 및 치료제를 배제한다는 것입니다.

본 프로토콜에서, 특정 생체활성 펩티드의 시간-해결 전기적 검출을 위한 용량성 면역프로브 바이오센서(CI probe)의 사용이 개략적으로 설명된다. 혈관조직, 심내막, 심근세포 및 심장 내 신경절을 신경질하는 신경절 후 교감신경 신경세포로부터 방출되는 뉴로펩티드 Y(NPY)는 심혈관 계 6,7,8,9의 주요 신경조절 펩티드 전달물질이다. 여기에 제시된 방법은 NPY를 측정하기 위해 설계되었으며 실험 타당성은 돼지 심장 모델에서 입증됩니다. 그러나, 이러한 접근법은 선택적 항체가 이용가능한 임의의 생체활성 펩티드(¹⁰)에 적용된다. 이 방법은 기능화된 팁(^11,12)에서 백금 와이어 프로브와 전도성 유체 사이의 용량성 접합부에 의존한다. 본 출원에서, 상호작용은 표적 뉴로펩티드 (NPY)에 대한 항체를 통해 매개되었고, 이는 전극 팁에 결합되었고, 전도성 유체 환경을 인터페이싱하였다. 이러한 기능화는 백금 와이어 프로브^(10,13)의 팁 상으로의 반응성 폴리도파민의 전착을 통해 달성되었다.

항체-기능화된 프로브가 생체내에서 관심 영역에 배치될 때, 유발된 내인성 NPY 방출은 프로브 팁 상의 포획 항체에 대한 결합을 유도하고, 전극 표면에서의 전도성 유체는 NPY 단백질에 의해 변위된다. 전기 환경의 국부적 변화는 움직이지 않고 정적으로 하전된 분자를 가진 높은 이동성, 고 유전체 유체의 변위를 초래합니다. 이것은 전극-유체 계면을 변경하고, 따라서 그의 커패시턴스를 변화시키고, 이는 단계-함수 명령 전위에 응답하는 전하 전류의 변화로서 측정된다. 음성 "리셋" 전위는 정전기적 상호작용을 통해 항체로부터 결합된 NPY를 격퇴하기 위해 각각의 개별 측정 사이클 직후에 사용되고, 따라서 측정¹⁰의 후속 라운드를 위해 항체 결합 부위를 클리어링한다. 이를 통해 시간 해결 방식으로 NPY를 효과적으로 측정 할 수 있습니다. 독특한 CI 기술은 위에서 설명한 미세투석 기반 면역화학적 방법의 한계를 극복하여 여러 실험⁹에 걸쳐 데이터 풀링 또는 신호 평균화 없이 단일 실험에서 동적 바이오마커 수준을 측정하여 거의 실시간으로 데이터를 제공합니다. 더욱이, 이 방법을 시간-해결 및 국부적 규모로 적절한 항체가 존재하는 관심있는 임의의 바이오마커에 적응시키는 능력은 질환 진행의 평가 및 치료적 개입의 안내를 위한 면역화학적 측정에서 주요한 기술적 진보를 제공한다.

데이터 수집 및 분석용 소프트웨어는 IGOR Pro(완전 대화형 소프트웨어 환경)로 사용자 정의되어 작성되었습니다. 아날로그-디지털 컨버터(A/D) 시스템은 컴퓨터 제어 하에 명령 전압을 발생시키고 사용자 증폭기에서 데이터를 수집했습니다. 앰프는 특정 고유 한 기능을 가지고있었습니다. 여기에는 네 개의 수집 채널 각각에 대한 피드백 저항기(전환 가능)가 포함되어 있어 전극의 가변성을 통합하기 위해 1MOhm 또는 10MOhm 피드백 전압 클램프 회로를 선택할 수 있습니다. 네 개의 수집 채널 모두에 대해 단일 헤드와 상호 접지/기준 회로가 있는 스테이지 유닛도 단일 물리적 모듈에서 가슴 가까이에 장치를 배치하도록 제작되었습니다. 1 MOhm 피드백 저항기 설정을 사용하여 보고된 모든 데이터를 수집했습니다.

필터 및 이득 설정은 증폭기에서 전신되어 데이터 파일 내에 기록되었습니다. 데이터는 10kHz에서 디지털화된 2극 아날로그 베셀 필터를 통해 1kHz에서 필터링되었습니다. 프로브와 주변 전도성 용액 사이의 전위 차이는 프로브 팁에 헬름홀츠 정전 용량 층을 생성합니다. 프로브 팁에서 항체에 대한 리간드 결합은 변경된 국소 전하를 초래하고, 따라서, 헬름홀츠 커패시턴스의 변화를 초래한다. 회로의 정전 용량 구성 요소의 이러한 변화는 프로브를 스텝 기능 전압 프로토콜의 전위로 가져 오는 데 필요한 주입 된 전하의 크기의 변화를 초래합니다. 따라서, 기능화된 프로브에 대한 특정 리간드의 결합은 피크 용량성 전류의 변화로서 전극 커패시턴스 측정의 변화를 초래한다.

프로토콜

모든 동물 실험은 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 동물 연구위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (8th edition, 2011)에 명시된 지침에 따라 수행되었습니다. 대략 75 kg의 성인 수컷 요크셔 돼지를 생체내 연구¹⁰에 사용하였다.

1. 정전용량 면역프로브 제작 및 기능화

1. 길이 25cm의 퍼플루오로알콕시(PFA) 코팅된 백금 와이어( 재료 표 참조)를 자르고 메스를 사용하여 한쪽 끝에서 약 5mm의 PFA 코팅을 벗겨서 백금 와이어로 절단하지 않도록 주의하십시오.
2. 백금 와이어의 벗겨진 끝을 금도금된 1mm 수 커넥터 핀에 삽입하고 바늘 노즈 플라이어를 사용하여 백금 와이어의 벗겨진 끝 주위에 커넥터 핀 치아를 압착 합니다(재료 표 참조).
3. 백금 와이어를 금도금 커넥터 핀에 납땜합니다. 과도한 양의 납땜을 사용하지 않도록주의하십시오.
4. 교반하여 도파민 HCl 50 mg을 10 mM 인산완충식염수(PBS, pH 6.0)에 50 mL에 용해시켜 도파민 용액을 제조하였다.
5. 도파민이 완전히 용해되면 백금 와이어의 팁을 갓 만든 도파민이 보충된 PBS가 들어있는 용기에 넣습니다. 금색 커넥터 핀을 헤드스테이지의 채널에 꽂 습니다(재료 표 참조).
6. AgCl 디스크 전극(접지 전극, 재료 표 참조)을 헤드스테이지의 접지 채널에 연결합니다. AgCl 디스크를 도파민이 보충된 PBS 및 백금 와이어를 함유하는 용기에 놓는 단계; 디스크 전극을 잠수시키는 것만 조심하고 와이어 또는 솔더의 길이는 사용하지 마십시오. 계속하기 전에 와이어 션트를 헤드 스테이지의 참조 채널에 연결하십시오.
7. 대화형 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다( 자료 표 참조). 다음과 같은 매개 변수로 톱니 전착 명령 전위 프로토콜을 준비하십시오 : 시작 전위 = -0.6V; 종단 전위 = +0.65V; 스캔 속도 = 0.04V∙^s-1; 증착 기간 = 420 초. 폴리도파민 증착 프로토콜을 시작하여 모든 와이어가 올바르게 연결되었는지 확인하십시오.
8. 폴리도파민 증착을 완료한 후, AgCl 접지 펠릿 및 백금 와이어의 팁을 용기로부터 제거하고, 백금 와이어 전극의 팁을 방해하지 않도록 주의한다. 와이어의 팁을 PBS (pH 7.4)를 함유하는 마이크로튜브에 넣고 항체 용액이 제조됨에 따라 2-5분 동안 넣고; 와이어 팁이 마이크로 튜브의 측면 또는 바닥에 닿지 않도록하십시오.
   참고: 항체 용액은 폴리도파민 침착 동안 만들어질 수 있다; 그러나, 폴리도파민 침착 후 도파민 함유 용기로부터 PBS의 마이크로튜브로의 백금 와이어의 전달은 건너뛸 수 없다.
9. 항체 용액을 준비한다. 관심있는 항체를 적절한 크기의 용기 (예를 들어, 마이크로튜브) 내에서 1:20 비로 PBS (pH 7.4)와 결합시킨다.
   참고: 여기에 사용된 항-NPY 모노클로날 항체( 물질 표 참조)는 1 mg/mL로 분취되었다; 여기서의 예시적인 항체 제제는 PBS의 76 μL에 대한 항체의 4 μL일 것이다.
10. 백금 전극의 폴리도파민 증착 팁을 실온에서 최소 2시간 동안 항체 용액에 담그고, 다시 백금 와이어 팁이 용액에 현탁되고 마이크로튜브의 내부 표면에 안착되지 않도록 한다.
    참고: 이 기술의 최근 구현은 나중에 사용하기 위해 습식 또는 건식 저장 대신 이 단계 바로 다음에 백금 와이어 전극을 사용하는 것이 선호되었습니다.
11. 항체 용액에 담근 후, PBS (pH 7.4)에서 새로 기능화된 용량성 면역프로브 (CI 프로브) 팁을 간단히 헹구었다. 이제 프로브를 사용할 준비가 되었습니다.

2. 펩타이드 의 시험관내 검출 및 측정을 위한 실험 설정

1. CI 프로브의 기능 팁을 유동 챔버 내로 놓고, 프로브의 감각 팁이 손상될 수 있으므로 어떤 식으로든 전극의 팁을 방해하지 않도록 주의해야 합니다.
   참고: 유동 챔버는 실리콘 엘라스토머( 재료 표 참조)를 접시 중앙에 길쭉한 난형 공간 필러가 있는 35mm 배양 접시에 붓고 만들었습니다. 경화 후, 난형 형상은 엘라스토머로부터 제거된다. 이어서, 챔버를 트리스-완충 식염수(TBS)로 과융합시키고, 3 mL/분의 유속을 허용한다. 유입 및 유출이 챔버 내의 유체 레벨을 유지하여 수퍼 푸세이트의 조수 작용이 관찰되지 않도록하십시오. 흐름은 CI 프로브가 사용 중인 동안 제자리에 유지되어야 합니다.
2. 첫 번째 실험 테스트 전에 TBS 표준 실행을 수행하여 CI 프로브를 컨디셔닝합니다. 다음 명령 전압 프로토콜을 설정하십시오: 포지티브 스텝 전위 = +100mV; 음의 단계 전위 = -5 mV; 단계 지속 시간 = 20ms; 획득 기간 = 600초.
   참고: 데이터 수집 전에 사이클링 명령 전위의 초기 단계 동안 프로브의 평형을 허용하는 것이 중요합니다.
3. 수퍼푸세이트의 조성물을 유지하기 위해 동일한 TBS를 사용하여 관심있는 펩티드의 용액을 생성한다. 튜브 시스템이나 유동 챔버에 기포를 도입하지 않고도 TBS와 펩티드 보충 TBS 사이에서 수퍼푸세이트를 전환할 수 있는 매니폴드 시스템을 구축하십시오.
   참고: 합성 돼지 NPY 펩티드 ( 물질의 표 참조)가 본 연구에 사용되었다.
4. TBS 표준 파라미터를 사용하여 펩티드 감지 데이터 수집 프로토콜을 설정한다(단계 2.2 참조).
   참고: 이 구현에서, 각 실험 테스트의 지속 기간은 360 s (120 s TBS, 120 s 펩티드 보충 TBS, 120 s TBS)이었다.

3. 생체내 사용을 위한 CI 프로브의 적응

1. 폴리도파민 증착 전에(단계 1.7.), 22 G 피하 주사 바늘을 통해 백금 와이어 전극의 노출된 팁을 실링하고, 바늘의 팁 너머로 대략 2 mm를 남긴다. 포셉을 사용하여 백금 와이어 전극의 끝을 부드럽게 구부려 피하 주사 바늘의 끝에서 매달려있는 "미늘"을 만듭니다.
   1. 철조망 팁에서 바늘을 부드럽게 꺼내어 바늘이 유체에 닿지 않고 용기에 놓을 수있는 충분한 와이어를 남겨 둡니다. 1.4.-1.11단계를 진행합니다.
      참고: 생체 내 설정에 따라 백금 와이어의 길이를 25cm보다 길게 절단해야 할 수도 있습니다.
2. CI 프로브를 헤드스테이지에 연결하기 전에 전체 전기 설정이 올바르게 접지되었는지 확인하십시오. 그렇게하지 않으면 실험 기록 중에 원치 않는 전기 간섭이 발생할 수 있습니다.
3. 이전에 발표 된 보고서¹⁰에 따라 동물을 마취하십시오.
4. 관심 영역을 노출하는 수술을 수행합니다.
   참고 : 심장을 노출시키기 위해 본 연구에서 중간 흉골 절제술을 수행했습니다. 동물 수술에 대한 자세한 내용은 Kluge et ^al.10 을 참조하십시오.
5. PBS 헹굼으로부터 기능화된 팁을 부드럽게 제거하고(단계 1.11.), 하이도더럴 바늘을 바베드된 C.I. 프로브로 전달하고, 금 커넥터 핀을 헤드스테이지에 꽂기 전에 관심 영역에 부드럽게 이식한다. 일단 이식되면 피하 주사 바늘을 꺼내 전극을 제자리에 두십시오.
   주: 본 연구를 위해, 프로브를 좌심실 심근(¹⁰)의 중측벽에 배치하였다.
6. 적절한 전기 설정을 보장한 후 표준 및 실험 테스트 프로토콜을 진행하십시오(2.2단계 및 2.4단계).
7. 실험이 완료되면 제도적으로 승인 된 기술에 따라 동물을 안락사시킵니다.
   참고: 본 연구에서, 동물들은 심실 세동⁽¹⁰)의 유도를 통해 깊은 마취 하에 안락사된다.

결과

전극 제조 및 특성화
유연한 용량성 면역 프로브 (CI 프로브)가 제작되었으며 대표적인 이미지가 그림 1A에 묘사되어 있습니다. 전극 전위는 컴퓨터 제어 전압 클램프 회로에 의해 설정되었고(도 1B), 전극은 PBS로 제조된 폴리도파민 용액에 침지되었다. 폴리도파민은 기능화를 위해 도전성 전극 팁⁽¹³ ) 상에 전기증착되었?...

토론

본 프로토콜은 시험관 내 및 생체내 설정 둘 다에서 관심있는 바이오마커를 검출 및 측정할 수 있는 용량성 면역프로브(CI probe)의 제조 및 시험을 기술한다. 검출은 바이오마커를 전극 팁에 포획함으로써 달성된다. 트래핑 이벤트는 백금 와이어 정전 용량 면역 프로브와 주변 전도성 유체 환경 사이의 용량성 접합을 변경하며, 프로브의 잠재적 이동에 대한 응답으로 전하 전류의 변화...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654