استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء

Summary

يتم تسهيل الكيمياء الحيوية البصرية أحادية الجزيء التي تمت دراستها من خلال غرف الموائع الدقيقة بشكل كبير باستخدام برميل زجاجي ، ومحاقن مانعة لتسرب الغاز ، ووصلات مستقرة للأنابيب بخلايا التدفق ، والقضاء على الفقاعات عن طريق وضع صمامات التبديل بين المحاقن والأنابيب. يصف البروتوكول الفخاخ البصرية المزدوجة التي تمكن من تصور معاملات الحمض النووي والتفاعلات بين الجزيئات.

Abstract

الكيمياء الحيوية البصرية هي تقنية قوية لمراقبة الخصائص العشوائية للإنزيمات المفردة أو مجمعات الإنزيم التي يتم حجبها في المتوسط الذي يحدث في دراسات المرحلة السائبة. لتحقيق التصور ، يتم تركيز الملقط البصري المزدوج ، حيث يتم تثبيت أحد المصيدة والآخر متحرك ، في قناة واحدة لغرفة الموائع الدقيقة متعددة التيارات الموضوعة على مرحلة مجهر مضان مقلوب. تحبس الملقط البصري جزيئات مفردة من الحمض النووي المسمى بالفلورسنت وتدفق السوائل عبر الغرفة وتتجاوز الخرز المحبوس ، وتمتد الحمض النووي إلى شكل B (تحت الحد الأدنى من القوة ، أي 0 pN) مع ملاحظة الحمض النووي كخيط أبيض على خلفية سوداء. يتم نقل جزيئات الحمض النووي من تيار إلى آخر ، عن طريق ترجمة المرحلة المتعامدة مع التدفق لتمكين بدء التفاعلات بطريقة خاضعة للرقابة. لتحقيق النجاح ، يتم تزاوج أجهزة الموائع الدقيقة ذات القنوات الواضحة بصريا مع المحاقن الزجاجية المثبتة في مكانها في مضخة حقنة. تستخدم النتائج المثلى الموصلات المرتبطة بشكل دائم بخلية التدفق ، وهي أنابيب صلبة ميكانيكيا ومقاومة كيميائيا ، ومتصلة بصمامات التبديل التي تقضي على الفقاعات التي تمنع التدفق الصفحي.

Introduction

قدمت القدرة على تصور تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد وفي الوقت الفعلي نظرة ثاقبة مهمة لاستقرار الجينوم ^1,2. بالإضافة إلى العمل مع جزيئات مفردة من الحمض النووي واحدا تلو الآخر ، فإن القدرة على عرض المعاملات بين الجزيئات الفردية القريبة توفر رؤية إضافية³،^4،5. يتطلب التلاعب بجزيئات الحمض النووي الإضافية كلا من الفخاخ البصرية الإضافية بالإضافة إلى خلايا تدفق الموائع الدقيقة عالية الجودة ومتعددة القنوات⁶.

هناك العديد من الطرق المتاحة لإنشاء أكثر من مصيدة بصرية واحدة. وتشمل هذه مرايا مسح الجلفانومتر ، ومعدلات البصريات الصوتية ، والبصريات الحيود ، والتي تولد ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد⁴،⁷،^8،9. في كثير من الأحيان ، تنتج مرايا المسح الضوئي والمعدلات البصرية الصوتية مصائد تشارك بالوقت. في الإعداد الموضح هنا ، يتم تقسيم شعاع ليزر Nd: YAG واحد على الاستقطاب ، ثم تتحكم مرايا المسح الضوئي بالليزر الجلفانومتر في موضع ما يسمى بالمصيدة المتنقلة (الشكل 1) ⁴. لتسهيل وضع المرايا والمرشحات لتوجيه شعاع الاصطياد إلى الفتحة الخلفية لهدف المجهر ، يتم استخدام ليزر HeNe. هذا يجعل المحاذاة الكلية أسهل لأن شعاع HeNe مرئي للعين المجردة ، في حين أن أشعة الأشعة تحت الحمراء ليست كذلك. يعد شعاع HeNe أيضا أكثر أمانا للعمل مع جعل وضع المرايا والمكونات الأخرى أقل إرهاقا. في البداية ، يكون مسار شعاع هذا الليزر منفصلا عن شعاع 1064 نانومتر ، ولكن يتم إدخاله في نفس مسار الحزمة ، ثم في هدف المجهر. بمجرد تحقيق المحاذاة المادية ، يتم وضع شعاع 1064 نانومتر أعلى شعاع HeNe ويتم تسهيل ذلك من خلال استخدام عارض الأشعة تحت الحمراء وأدوات تصوير الحزمة المختلفة لتصور موضع الحزمة وجودتها. بعد ذلك ، يتم إدخال موسع الحزمة ، ويتم محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء الموسع الناتج على الفتحة الخلفية للهدف. أخيرا ، تتم إزالة الهدف ويتم قياس القدرة في كل حزمة مستقطبة وتعديلها باستخدام ألواح موجية λ / 2 لتكون متساوية (الشكل 1C). يتم إجراء قياسات الطاقة أيضا بمجرد إرجاع الهدف وعادة ما يكون هناك فقدان للطاقة بنسبة 53٪. ومع ذلك ، هناك طاقة كافية لتشكيل مصائد بصرية ثابتة ومتحركة مستقرة في المستوى البؤري (الشكل 1D).

لتصوير معاملات الحمض النووي ، تلعب خلايا تدفق الموائع الدقيقة دورا رئيسيا لأنها تسمح بالقياسات الخاضعة للرقابة على مستوى الجزيء الواحد بدقة مكانية وزمانية عالية (الشكل 2). يشير مصطلح الموائع الدقيقة إلى القدرة على معالجة السوائل في قناة واحدة أو أكثر بأبعاد تتراوح من 5-500 ميكرومتر^10,11. يشير مصطلح التيار إلى السائل الفعلي داخل القناة وتشير القناة إلى القناة المادية التي يتحرك فيها تيار أو تيارات مائعة. يحتوي تصميم خلية التدفق أحادية القناة على قناة مادية مشتركة حيث يتم ملاحظة التفاعلات وعادة ما يكون هناك تيار سائل واحد فقط. وبالتالي ، تعرف هذه التصميمات باسم خلايا التدفق أحادية الدفق. في المقابل ، يتم تعريف خلايا التدفق متعددة الدفق على أنها جهاز موائع دقيقة تتلاقى فيه قناتان أو أكثر من قنوات الدخول في قناة مادية واحدة مشتركة (الشكل 2 أ). داخل القناة المشتركة ، تتدفق تيارات السوائل التي تنشأ من القنوات الفردية بالتوازي مع بعضها البعض ، وتظل منفصلة مع حدوث الحد الأدنى من الاختلاط بينها بسبب الانتشار (الشكل 2 ب). في معظم الإعدادات التجريبية ، تدفع مضخة واحدة السوائل إلى كل قناة بنفس السرعة. في المقابل ، عند استخدام التوجيه الحدودي ، تقوم ثلاث مضخات أو أكثر يتم التحكم فيها بشكل مستقل بدفع السوائل عبر القنوات. ومع ذلك ، تعمل كل مضخة بسرعة مختلفة ولكن معدل التدفق الصافي في القناة المشتركة ثابت¹². هذا يسمح بالتبادل السريع لمكونات القناة الرئيسية ببساطة عن طريق تغيير سرعة المضخة.

بالإضافة إلى التدفق الصفحي ، هناك عامل حاسم آخر هو ملف تعريف سرعة القطع المكافئ داخل تيار السائل الرقائقي. تحدث أعلى سرعة تدفق في منتصف التيار ويحدث الأبطأ بجوار الأسطح (الشكل 2C)¹³. يجب اعتبار هذا المظهر الجانبي لتمديد جزيء الحمض النووي المرتبط بخرزة مثبتة في التيار بالكامل من أجل التصور الدقيق للحمض النووي الفلوري والتحليلات الدقيقة لجزيء واحد. هنا ، يمتد الحمض النووي إلى الشكل B ويتم تثبيته في مكانه تحت 0 pN من القوة. لتحقيق ذلك ، يجب أن يكون تركيز موضع المصيدة الضوئية على موضع 10-20 ميكرومتر من سطح الغطاء السفلي (الشكل 2D). يجب توخي الحذر حتى لا يمتد جزيء الحمض النووي إلى ما بعد الشكل B لأن هذا يمكن أن يمنع تفاعلات الإنزيم. في ظل ظروف المخزن المؤقت النموذجية ، 1 ميكرومتر = 3000 نقطة أساس من الحمض النووي¹⁴. علاوة على ذلك ، من خلال محاصرة 10-20 ميكرومتر من الغطاء ، يتم وضع مركب الحمض النووي بعيدا عن السطح وبالتالي تقليل التفاعلات السطحية.

تم استخدام العديد من الطرق لإنشاء قنوات جهاز الموائع الدقيقة ويمكن القيام بذلك في المختبر أو يمكن شراء خلايا التدفق من المصادر التجارية⁶،¹⁵،^16،17. يجب أن تكون المواد المثلى المستخدمة لبناء خلايا التدفق صلبة ميكانيكيا ، وشفافة بصريا مع مضان منخفض ، وغير منفذة للمذيبات العضوية⁶. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام الزجاج المصقول البورسليكات ، أو السيليكا المنصهرة لتوفير بيئة تدفق مستقرة لفترة طويلة مناسبة للاصطياد البصري والتصور واكتشاف القوة. تسمح هذه المواد أيضا باستخدام المذيبات غير المائية (على سبيل المثال ، الميثانول من الدرجة الطيفية) لتبسيط ترطيب السطح وإزالة فقاعات الهواء ، والمواد المسخة (على سبيل المثال ، 6M guanidinium hydrochloride) أو المنظفات لتنظيف خلية التدفق. أخيرا ، تختلف الطرق المستخدمة لإدخال السوائل في خلايا التدفق من أنظمة مضخات التفريغ المعقدة إلى مضخات المحاقن المفردة 14،¹⁸،¹⁹،^20،21،^22،23،²⁴،²⁵،^26،27. في النهج الموضح هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة يمكنها استيعاب ما يصل إلى 10 محاقن (الشكل 3 أ). يوفر هذا المرونة لاستخدام خلايا التدفق أحادية القناة أو خلايا التدفق ذات قنوات مدخل متعددة. هنا ، يتم استخدام خلية تدفق ثلاثية القنوات ويتم تزاوجها مع المحاقن المثبتة في مكانها على مضخة المحقنة باستخدام أنابيب poly-ether-ether-ketone (PEEK) (الشكل 3A-C). يتم التحكم في تدفق السوائل بواسطة صمامات تبديل رباعية الاتجاهات وبالتالي تعمل على تقليل إدخال الفقاعات في خلية التدفق (الشكل 3 أ ، د). بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام محاقن هاملتون محكمة الغاز التي لها جدران زجاجية صلبة وغطاسات مطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) ، لأنها توفر حركة مكبس سلسة بشكل استثنائي ضرورية للحصول على تدفق سلس^14,27.

في النظام التجريبي الموصوف ، تم استخدام خلايا التدفق مع قناتين إلى خمس قنات. يتم تحديد عدد قنوات المدخل من خلال التجربة التي يتم إجراؤها. لدراسة RecBCD و Hop2-Mnd1 ، كانت قناتان دفق كافية^14,28. بالنسبة إلى اللولب ، كان الإنزيم مرتبطا بالطرف الحر من الحمض النووي وترجم إلى تيار يحتوي على المغنيسيوم و ATP لبدء النقل والتفكيك. بالنسبة إلى Hop2-Mnd1 ، تمت ترجمة الحمض النووي المحاصر بصريا إلى تيار السائل المجاور الذي يحتوي على البروتينات والمخزن المؤقت ± أيونات المعادن ثنائية التكافؤ. يتيح استخدام خلايا التدفق ثلاثية القنوات للمرء حبس الحمض النووي في التيار 1 ، وترجمة الحمض النووي إلى التيار 2 للسماح بحدوث ارتباط البروتين ، ثم التدفق 3 حيث يوجد ATP ، على سبيل المثال ، لبدء التفاعلات. الاختلاف في ما سبق هو استخدام البروتين الموسوم بالفلورسنت في القناة 2 ، مما يؤدي إلى أن يكون تيار السائل أبيض تماما ويمنع تصور الحمض النووي. عندما يترجم هذا الجزيء إلى تيار 3 ، يكون كل من البروتينات والحمض النووي مرئيا الآن عند بدء التفاعلات.

يعد استخدام صمامات التبديل رباعية الاتجاهات للتحكم في تدفق السوائل مكونا مهما في النظام للقضاء على الفقاعات في خلايا التدفق. الفقاعات ضارة بتدفق السوائل المستقر لأنها تتقلص وتتوسع بطرق غير متوقعة مما يؤدي إلى تغيرات سريعة في سرعة التدفق وإدخال الاضطراب. عندما يتم وضع الصمامات بين المحاقن وأنابيب المدخل ، يتم فصل مسار التدفق عن طريق تبديل موضع الصمام عند تغيير المحاقن. عندما يتم وضع المحقنة الجديدة في مكانها ، يمكن الضغط على المكبس يدويا بحيث يتم إخراج >6 ميكرولتر (الحجم الميت للصمام) وهذا يزيل الفقاعات بالكامل تقريبا.

غالبا ما يكون ربط الموصلات بخلايا التدفق هو خطوة تحديد المعدل في استخدام خلايا التدفق. وصفنا استخدام نوعين من الموصلات: قابلة للإزالة تعرف باسم press-fit وأخرى دائمة (تجميعات nanoport). الموصلات القابلة للإزالة سهلة الالتصاق بخلية التدفق ويمكن اختبار أنواع مختلفة من الأنابيب المرنة بالإضافة إلى PTFE الموصى بها باستخدام هذه الموصلات. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لاختبار الأنابيب والموصلات دون التضحية بخلايا تدفق الزجاج الأكثر تكلفة. في المقابل ، يتم إرفاق مجموعات المنافذ النانوية بشكل دائم ، وتتحمل ضغوطا تصل إلى 1000 رطل / بوصة مربعة ، وفي أيدينا ، يقتصر استخدامها على أنابيب PEEK بأقطار مختلفة. هذا ليس عيبا حيث يفضل استخدام أنابيب PEEK. يمكن إعادة استخدام خلية تدفق زجاجية واحدة مع تجميعات دائمة مرفقة لأكثر من 1 سنة مع الاستخدام الدقيق.

Protocol

1. محاذاة مصيدة الليزر واختبارها باستخدام حبات البوليسترين

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 1 أ ، ب.

تنبيه: يجب على القائم بالتجربة ارتداء نظارات واقية مناسبة أو نظارات أمان بالليزر أثناء محاذاة شعاع الليزر. نظرا لأن نظام الملقط البصري الموصوف هنا يستخدم كلا من حزم HeNe و IR ، يلزم وجود مجموعتين منفصلتين من الأواني الزجاجية الآمنة بالليزر.

1. محاذاة شعاع HeNe
   1. ضع جميع المكونات البصرية على اللوح. قم بمحاذاة اللوح بحيث يكون قريبا من زاوية 90 درجة قدر الإمكان بالنسبة إلى المجهر.
   2. قم بتوصيل أنبوب التزاوج الذي يحتوي على الهدف وعدسة telan بالمجهر (الشكل 1A-11،12).
      ملاحظة: عدسة telan هي نظام عدسة يستخدم لتركيز الصورة على مستوى الصورة المتوسط في العدسات.
   3. قم بتشغيل ليزر HeNe وافتح الغالق (الشكل 1A-18). يجب أن يضرب الشعاع المرشح (الشكل 1A-3) على ارتفاع 54 مم يعكس 50٪ من الضوء على المرآة 5 (الشكل 1A-5). تصطدم نسبة 50٪ المتبقية من الحزمة بالمرآة 4 (الشكل 1A-4) بنفس ارتفاع المرآة 3.
   4. اضبط المرآة 4 (الشكل 1A-4) بحيث تصطدم الحزمة بالمرآة 6 (الشكل 1A-6) على ارتفاع 51 مم.
   5. اضبط المرآة 6 (الشكل 1A-6) بحيث يتم توجيه الحزمة إلى المرآة الجلفانية السفلية على ارتفاع 51 مم. سيكون الشعاع الذي يخرج من المرآة الجلفانية العلوية عند 57.5 مم.
   6. اضبط المرآة 3 (الشكل 1A-3) بحيث يضرب هذا الشعاع المرآة 5 (الشكل 1A-5) على ارتفاع 57.5 مم. بمجرد انعكاس المرآة 5 ، يجب أن تضرب الحزمة المرآة 9 (الشكل 1A-9) بنفس الارتفاع. يتم إعادة تجميع الحزمة بشكل فعال في المرآة 9 ، ويمر عبر الهدف ، ونظام عدسة telan على المرآة 21 (الشكل 1A-21) ، مما يعكسه في الهدف.
   7. ضع شريحة مجهر نظيفة على مرحلة المجهر. قم بتشغيل الكاميرا وتصوير حزم الحزم الثابتة والمسح الضوئي بشكل فردي على الشاشة. بدءا من المرآة 3 ، ثم 5 و 9 ، وأخيرا 21 ، قم بإجراء تعديلات صغيرة لوضع الحزمة الثابتة في وسط الشاشة.
   8. للتأكد من أن زاوية خروج الشعاع من المرآة 21 هي 90 درجة ، قم بتغيير ارتفاع Z للمجهر وضع الحزمة المصورة على الأسطح العلوية والسفلية للشريحة. عندما تكون متطابقة ، تكون الحزمة في الموضع الصحيح ، وهو عمودي على المرحلة. قم بإغلاق هذا الشعاع باستخدام الغالق 19 (الشكل 1A-19).
   9. بدءا من المرايا 4 و 6 ، قم بإجراء تعديلات صغيرة لوضع الشعاع الثابت في وسط الشاشة. مصراع هذا الشعاع.
2. محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء (IR)
   تنبيه: نفذ جميع الخطوات بطاقة ليزر منخفضة لأسباب تتعلق بالسلامة.
   1. اضبط لوحة الموجة 14 (الشكل 1A-14) لضبط نسبة الحزم المرسلة والمنعكسة التي يتم تقسيمها عند مقسم الحزمة 2 (الشكل 1A-2). يعكس مقسم الشعاع 2 المكون s لشعاع الليزر وينقل المكون p.
   2. تصطدم الحزمة التي تمر عبر 2 بالمرآة 7 (الشكل 1A-7) ، والتي تنحرف الحزمة إلى المرآة الجلفانية السفلية. يجب أن يتبع مسار شعاع HeNe على المرآة 21. أداء حركات صغيرة من مرآة 7 لتحقيق هذا الوضع.
   3. اضبط المرآة 2 بحيث يضرب الشعاع الذي تنعكس بواسطة المرآة 2 المرآة 10 (الشكل 1A-10) على ارتفاع 57.5 مم.
   4. ينعكس الشعاع من المرآة 10 إلى المرآة 8 (الشكل 1A-8) على ارتفاع 57.5 مم. يجب أن يضرب الشعاع اللاحق المرآة 9 بنفس الارتفاع. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإجراء تعديلات صغيرة على المرايا 10 و 8 حسب الحاجة.
   5. قم بإزالة الهدف ووضع رأس عداد الطاقة فوق المنفذ في برج الهدف.
   6. استخدم اللوحات 14 و 15 و 16 (الشكل 1A-14،15،16) لضبط قوة كل شعاع ليزر بحيث تكون متساوية كما هو موضح في الشكل 1C.
   7. ضع موسع الشعاع 1 (الشكل 1A-1) في مكانه. اضبط شعاع الليزر الموسع ليكون دائريا دون أي غيبوبة أو استجماتيزم.
   8. لاختبار الفخاخ البصرية ، اصنع محلولا من حبات البوليسترين 1 ميكرومتر معلقة في الماء. بعد ذلك ، ضع 10 ميكرولتر من هذا المحلول على شريحة مجهر ، ضع غطاء في الأعلى وأغلقه بطلاء الأظافر. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واختبر الفخاخ الضوئية عن طريق محاصرة هذه الخرز 1 ميكرومتر. تأكد من امتصاص الخرز في الفخاخ وتثبيته بثبات عند تحريك المسرح. يجب أن يحدث الاصطياد بكفاءة متساوية من جميع جوانب المصيدة.

2. إعداد غرفة الموائع الدقيقة

1. إذا كانت خلية التدفق عبارة عن جهاز تم إنشاؤه تجاريا مصنوع من polydimethylsiloxane (PDMS) على قسيمة غطاء ، فانتقل إلى الخطوة 3. إذا كان جهازا زجاجيا به موصلات متصلة ، فانتقل إلى الخطوة 4.
2. إذا لم تكن خلية التدفق تحتوي على موصلات متصلة ، فقم بربطها بفتحات الدخول الموجودة على شريحة المجهر أولا. راجع الخطوة 3 لمعرفة خطوات توصيل الموصلات.

3. اتصالات خلية التدفق باستخدام خلية تدفق PDMS

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2D.

1. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف. امسك أنبوب PTFE 3 مم من الطرف الحر بالملقط. ادفع الأنبوب إلى المنفذ المشكل مسبقا (يمكن أن يدعم المنفذ ضغط خط 2 بار).
2. كرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية. قم بتوصيل منافذ المدخل بمضخة المحقنة والمخرج بزجاجة نفايات (الشكل 4 أ ، ب).
3. املأ كل حقنة زجاجية ب 1 مل من الميثانول من الدرجة الطيفية. قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول (الشكل 4C ، الوضع المغلق).
4. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق (الشكل 4C ، الوضع المفتوح). ضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.
5. في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام.

4. إرفاق موصلات أنابيب الصحافة المناسبة

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2F.

1. إذا كان سيتم استخدام موصلات أنابيب مناسبة للضغط ، فقم بإزالة الشريط اللاصق بعناية من جانب واحد من الموصل وضعه فوق الفتحة الموجودة في شريحة المجهر. اضغط لأسفل لبضع ثوان. كرر العملية للموصلات المتبقية.
2. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف. امسك أنبوب PTFE 3 مم من الطرف الحر بالملقط. ادفع الأنبوب إلى الفتحة المشكلة مسبقا في المنفذ وكرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية.
3. قم بتوصيل الأنابيب من المداخل بصمامات التبديل. انتقل إلى الخطوة 7.

5. إرفاق الجمعيات الدائمة

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2A-C.

1. قم بإجراء المرفق إما على سطح نظيف ومسطح أو على مشعب مصمم خصيصا لتثبيت خلية التدفق والموصلات في مكانها أثناء حدوث الترابط.
2. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف أو في القسم الغائر من المشعب (الشكل 2 ب). ضع كمية صغيرة من الغراء الزجاجي في الجزء السفلي من المجموعة وأدخل الختم.
3. ضع المنفذ النانوي فوق أحد فتحات الدخول على شريحة المجهر. ادفع برفق لأسفل وثبت في مكانه بدون حركة جانبية. كرر العملية للمنافذ المتبقية.
4. السماح ليجف أو المشبك في مكانه في المشعب. قم بإزالة خلية التدفق برفق من المشعب وتأكد من محاذاة التجميعات جيدا مع منافذ الدخول في خلية التدفق. انتقل إلى الخطوة 7 عندما تكون جاهزا.

6. اتصالات خلية التدفق والتحضير

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 4 أ ، ب.

1. ضع خلية تدفق على مرحلة المجهر. قم بتوصيل الأنبوب باستخدام الموصلات الضيقة للإصبع.
2. املأ كل حقنة زجاجية ب 1 مل من الميثانول من الدرجة الطيفية. قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول (الشكل 4C ، الوضع المغلق).
3. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق (الشكل 4C ، الوضع المفتوح). ضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.
4. في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام.

7. التحكم في تدفق السوائل

1. أدر صمامات التبديل إلى الوضع المغلق (الشكل 4 ج). إزالة المحاقن ، والتخلص من المياه المتبقية ، وملء المحاقن مع حلول تجريبية ، على سبيل المثال ، حبات الحمض النووي ؛ انزيم; و ATP. أعد المحاقن إلى المضخة وقم بتوصيلها بصمامات التبديل.
2. في هذا الوضع ، قم بإجبار الغطاسات يدويا على خفض 5-10 ميكرولتر لإزالة أي فقاعات. قم بتغيير موضع صمام التبديل إلى فتح.
3. استخدم مخطط معدل التدفق لتحقيق سرعة تدفق السوائل المثلى للملائمة والتصور كما هو موضح في الجدول 1. يجب أن يتيح التدفق الأمثل للسوائل للاصطياد البصري الاصطياد المستقر للخرز وبمجرد تمدد الحمض النووي ، يجب أن يكون على شكل B (~ 3000 bp / μm).

8. محاصرة حبات البوليسترين مع جزيئات الحمض النووي المفردة المرفقة

1. عند التكبير 10x ، حدد موقع الحد الفاصل بين تيارات السوائل بالقرب من نقاط دخول القناة. أضف الزيت إلى هدف 100x وانتقل إلى التكبير الأعلى.
2. افتح مصاريع الفخاخ الضوئية (إما كلاهما أو واحد في كل مرة). يجب أن تحبس أشعة الليزر المركزة الخرز ويجب أن يمتد الحمض النووي على الفور.
3. بمجرد محاصرة المجمع ، قم بترجمة المرحلة بشكل عمودي على التدفق (الشكل 3A ، C ، أقحم). سيؤدي ذلك إلى نقل المركب المحاصر من محلول حبة الحمض النووي إلى التيار 2. مزيد من الترجمة ستنقل المجمع إلى تيار 3.

9. تنظيف خلايا التدفق

ملاحظة: نفذ هذا يوميا.

1. قم بإيقاف تشغيل المضخة عند اكتمال التجربة. أدر صمامات التبديل إلى الوضع المغلق (الشكل 4 ج).
2. إزالة المحاقن وتفريغها. شطف ثلاث مرات بالماء المقطر المصفى.
3. املأ المحاقن بمحلول التنظيف. ضع المحاقن في المضخة وقم بتوصيلها بصمامات التبديل.
4. تطهير صمامات التبديل وتغيير الموقف لفتح. ضخ 800 ميكرولتر من محلول التنظيف بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة عادة بين عشية وضحاها.
5. في اليوم التالي ، أغلق صمامات التبديل ، ثم قم بإزالة المحاقن وشطفها بالماء. شطف خلية التدفق والخطوط مع 4-800 ميكرولتر من الماء بمعدل تدفق 400-800 ميكرولتر / ساعة. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التنظيف الشاق لخلايا التدفق ، فاستبدل محلول التنظيف ب 6 M guanidium hydrochloride.

النتائج

يتم إجراء الاختبار الأولي لمحاذاة المصيدة وقوتها باستخدام حبات البوليسترين غير الفلورية 1 ميكرومتر. نظرا لأن معظم الأبحاث التي أجريت في المختبر تستخدم مضان ، فإننا نختبر قوة المصيدة باستخدام 1 ميكرومتر ، حبات البوليسترين الخضراء التنين (الشكل 1D ، E). بعد ذلك يتغير ...

Discussion

يعد التجميع الدقيق لنظام التدفق أمرا بالغ الأهمية لنجاح نتائج التجارب ^4,6. أحد أكثر جوانب البروتوكول تحديا هو ربط الموصلات بالسطح الزجاجي. لهذا ، نستخدم النهجين التاليين: موصلات الأنابيب المناسبة للضغط وتجميعات المنافذ النانوية. تلتصق الموصلات المناسبة لل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser