Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Özet

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Özet

Görsel biyokimya, toplu faz çalışmalarında gerçekleşen ortalamada gizlenen tek enzimlerin veya enzim komplekslerinin stokastik özelliklerini gözlemlemek için güçlü bir tekniktir. Görselleştirmeyi başarmak için, bir tuzağın sabit, diğerinin hareketli olduğu çift optik cımbız, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirilmiş çok akışlı bir mikroakışkan odanın bir kanalına odaklanır. Optik cımbızlar, floresan olarak etiketlenmiş DNA'nın tek moleküllerini yakalar ve odadan ve sıkışmış boncuklardan geçen sıvı akışı, DNA'yı B formuna (minimum kuvvet altında, yani 0 pN) uzatır ve nükleik asit siyah bir arka plana karşı beyaz bir ip olarak gözlenir. DNA molekülleri, reaksiyonların kontrollü bir şekilde başlatılmasını sağlamak için aşamayı akışa dik olarak çevirerek bir akıştan diğerine taşınır. Başarıya ulaşmak için, optik olarak berrak kanallara sahip mikroakışkan cihazlar, bir şırınga pompasında yerinde tutulan cam şırıngalarla eşleştirilir. Optimum sonuçlar, akış hücresine kalıcı olarak bağlanmış konektörler, mekanik olarak sert ve kimyasal olarak dayanıklı olan ve laminer akışı yasaklayan kabarcıkları ortadan kaldıran anahtarlama valflerine bağlı borular kullanır.

Giriş

Protein-DNA etkileşimlerini tek molekül düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak görselleştirme yeteneği, genom stabilitesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır ^1,2. DNA'nın tek molekülleriyle birer birer çalışmaya ek olarak, yakındaki tek tek moleküller arasındaki işlemleri görüntüleme yeteneği ek içgörü sağlar ^3,4,5. Ek DNA moleküllerinin manipülasyonu hem ek optik tuzaklar hem de yüksek kaliteli, çok kanallı, mikroakışkan akış hücreleri gerektirir⁶.

Birden fazla optik tuzak oluşturmak için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Bunlar arasında galvanometre tarama aynaları, akustik optik modülatörler ve holografik optik cımbız 4,7,8,9 üreten kırınımsal optikler bulunur. Çoğu zaman, tarama aynaları ve akustik optik modülatörler devre mülk tuzakları üretir. Burada açıklanan kurulumda, tek bir Nd: YAG lazerin ışını polarizasyon üzerine bölünür ve daha sonra galvanometre lazer tarama aynaları mobil tuzak olarak adlandırılan şeyin konumunu kontrol eder (Şekil 1)⁴. Tuzak ışını mikroskop hedefinin arka açıklığına yönlendirmek için aynaların ve filtrelerin konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bir HeNe lazer kullanılır. Bu, HeNe ışını çıplak gözle görülebildiği için genel hizalamayı kolaylaştırırken, kızılötesi ışınlar görünmez. HeNe ışını, aynaların ve diğer bileşenlerin konumlandırılmasını daha az stresli hale getirmek için çalışmak için daha güvenlidir. Başlangıçta, bu lazerin ışın yolu 1064 nm ışından ayrıdır, ancak aynı ışın yoluna ve daha sonra mikroskop hedefine sokulur. Fiziksel hizalama sağlandıktan sonra, 1064 nm ışının HeNe ışınının üzerine konumlandırılması yapılır ve bu, ışın konumunu ve kalitesini görselleştirmek için bir kızılötesi görüntüleyici ve çeşitli ışın görüntüleme araçlarının kullanılmasıyla kolaylaştırılır. Daha sonra, ışın genişletici tanıtılır ve elde edilen genişletilmiş kızılötesi ışın, hedefin arka açıklığına hizalanır. Son olarak, hedef kaldırılır ve her polarize ışındaki güç ölçülür ve λ/2 dalga plakaları kullanılarak eşit olacak şekilde ayarlanır (Şekil 1C). Güç ölçümleri, hedefe geri dönüldüğünde de yapılır ve tipik olarak% 53'lük bir güç kaybı olur. Bununla birlikte, odak düzleminde kararlı sabit ve hareketli optik tuzaklar oluşturmak için yeterli güç vardır (Şekil 1D).

DNA işlemlerini görüntülemek için, mikroakışkan akış hücreleri, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip tek molekül düzeyinde kontrollü ölçümlere izin verdikleri için önemli bir rol oynamaktadır (Şekil 2). Mikroakışkan terimi, 5-500 μm^10,11 arasında değişen boyutlarda bir veya daha fazla kanaldaki sıvıları manipüle etme yeteneğini ifade eder. Akış terimi, bir kanal içindeki gerçek sıvıyı ifade eder ve kanal, bir akışkan akışının veya akışlarının hareket ettiği fiziksel kanalı ifade eder. Tek kanallı akış hücresi tasarımı, reaksiyonların gözlemlendiği ve tipik olarak sadece bir sıvı akışının mevcut olduğu ortak, fiziksel bir kanala sahiptir. Bu nedenle, bu tasarımlar tek akışlı akış hücreleri olarak bilinir. Buna karşılık, çok akışlı akış hücreleri, iki veya daha fazla giriş kanalının tek, ortak, fiziksel bir kanalda birleştiği mikroakışkan bir cihaz olarak tanımlanır (Şekil 2A). Ortak kanal içinde, bireysel kanallardan kaynaklanan sıvı akışları birbirine paralel olarak akar ve difüzyon nedeniyle aralarında sadece minimum karışım meydana gelerek ayrı kalır (Şekil 2B). Deney kurulumlarının çoğunda, tek bir pompa sıvıları her kanala aynı hızda iter. Buna karşılık, sınır yönlendirmesi kullanıldığında, üç veya daha fazla, bağımsız olarak kontrol edilen pompa, sıvıları kanallardan iter. Bununla birlikte, her pompa farklı bir hızda çalışır, ancak ortak kanaldaki net akış hızı sabit^12'dir. Bu, sadece pompa hızını değiştirerek ana kanal bileşenlerinin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlar.

Laminer akışa ek olarak, bir diğer kritik faktör, laminer sıvı akışı içindeki parabolik hız profilidir. En yüksek akış hızı derenin ortasında, en yavaş ise yüzeylerin yanında meydana gelir (Şekil 2C)¹³. Bu profilin, floresan DNA'nın hassas bir şekilde görselleştirilmesi ve doğru tek moleküllü analizler için akışta tutulan bir boncuğa bağlı bir DNA molekülünü tamamen gerdiği düşünülmelidir. Burada, DNA B formuna gerilir ve 0 pN kuvvet altında yerinde tutulur. Bunu başarmak için, optik tuzak konumunun odaklanması alt kapak kayma yüzeyinden 10-20 μm yükseklikte olmalıdır (Şekil 2D). DNA molekülünün B formunun ötesine gerilmemesine dikkat edilmelidir, çünkü bu enzim reaksiyonlarını inhibe edebilir. Tipik tampon koşullar altında, 1 μm = 3.000 bp DNA¹⁴. Ayrıca, kapak kaymasından 10-20 μm uzakta tutularak, DNA kompleksi yüzeyden uzağa yerleştirilir ve böylece yüzey etkileşimleri en aza indirilir.

Mikroakışkan cihaz kanalları oluşturmak için birçok yöntem kullanılmıştır ve bunlar laboratuvarda yapılabilir veya akış hücreleri ticari kaynaklardan satın alınabilir 6,15,16,17. Akış hücrelerini oluşturmak için kullanılan en uygun malzemeler mekanik olarak sert, düşük floresanlı optik olarak şeffaf ve organik çözücülere karşı geçirimsiz olmalıdır⁶. Sıklıkla, borosilikat float cam veya kaynaşmış silika, optik yakalama, görselleştirme ve kuvvet algılama için uygun olan uzun bir süre boyunca istikrarlı bir akış ortamı sağlamak için kullanılır. Bu malzemeler ayrıca yüzey ıslatmasını ve hava kabarcıklarının giderilmesini basitleştirmek için susuz çözücülerin (örneğin, spektrofotometrik sınıf metanol) ve akış hücresini temizlemek için denatürantların (örneğin, 6M guanidinyum hidroklorür) veya deterjanların kullanılmasına izin verir. Son olarak, akışkanları akış hücrelerine sokmak için kullanılan yöntemler, karmaşık vakum pompası sistemlerinden tek şırıngalı pompalara kadar değişir 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Burada açıklanan yaklaşımda, 10 şırıngaya kadar barındırabilen bir şırınga pompası kullanılmıştır (Şekil 3A). Bu, tek kanallı akış hücrelerini veya birden çok giriş kanalına sahip akış hücrelerini kullanma esnekliği sağlar. Burada, üç kanallı bir akış hücresi kullanılır ve poli-eter-eter-keton (PEEK) borusu kullanılarak şırınga pompasında yerinde tutulan şırıngalarla eşleştirilir (Şekil 3A-C). Akışkanların akışı dört yönlü anahtarlama valfleri tarafından kontrol edilir ve böylece kabarcıkların akış hücresine girmesini en aza indirmeye yarar (Şekil 3A, D). Ek olarak, sert cam duvarlara ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı pistonlara sahip Hamilton gaz geçirmez şırıngalar,^pürüzsüz bir akış elde etmek için gerekli olan olağanüstü pürüzsüz piston hareketi sağladıkları için tavsiye edilirler ^14,27.

Açıklanan deneysel sistemde, iki ila beş giriş kanalına sahip akış hücreleri kullanılmıştır. Giriş kanallarının sayısı, yapılan deney tarafından belirlenir. RecBCD ve Hop2-Mnd1 çalışmaları için iki akış kanalı yeterli^14,28 idi. Helikaz için, enzim DNA'nın serbest ucuna bağlandı ve translokasyon ve çözülmeyi başlatmak için magnezyum ve ATP içeren bir akışa çevrildi. Hop2-Mnd1 için, optik olarak hapsedilmiş DNA, proteinler ve tampon ± iki değerli metal iyonları içeren bitişik sıvı akışına çevrildi. Üç kanallı akış hücrelerinin kullanımı, DNA'nın akış 1'de yakalanmasını, protein bağlanmasının gerçekleşmesine izin vermek için DNA'yı akış 2'ye çevirmesini ve daha sonra ATP'nin mevcut olduğu 3. akışa, örneğin reaksiyonları başlatmasını sağlar. Yukarıdakilerin bir varyasyonu, kanal 2'de floresan etiketli protein kullanmaktır, bu da sıvı akışının tamamen beyaz olmasına neden olur ve DNA'nın görselleştirilmesini engeller. Bu molekül akış 3'e çevrildiğinde, reaksiyonlar başlatıldığında hem proteinler hem de DNA artık görülebilir.

Sıvı akışını kontrol etmek için dört yönlü anahtarlama valflerinin kullanılması, akış hücrelerindeki kabarcıkları ortadan kaldırmak için sistemin kritik bir bileşenidir. Kabarcıklar, öngörülemeyen şekillerde büzüldükleri ve genişledikleri için kararlı sıvı akışına zararlıdır, bu da akış hızında hızlı değişikliklere ve türbülansın ortaya çıkmasına neden olur. Vanalar şırıngalar ve giriş boruları arasına yerleştirildiğinde, şırıngalar değiştirildiğinde valf konumu değiştirilerek akış yolunun bağlantısı kesilir. Yeni şırınga yerleştirildiğinde, piston manuel olarak bastırılabilir, böylece >6 μL dışarı atılır (valfin ölü hacmi) ve bu da kabarcıkları neredeyse tamamen ortadan kaldırır.

Bağlayıcıların akış hücrelerine bağlanması, akış hücresi kullanımında genellikle hız sınırlayıcı adımdır. İki tip konektörün kullanımını tanımlıyoruz: prese sığdırma ve kalıcı olanlar (nanoport montajları) olarak bilinen çıkarılabilir. Çıkarılabilir konektörlerin bir akış hücresine yapıştırılması kolaydır ve önerilen PTFE'ye ek olarak farklı esnek boru tipleri bu konektörlerle test edilebilir. Bu, daha pahalı cam akış hücrelerinden ödün vermeden boru ve konektörleri test etmenin hızlı ve uygun maliyetli bir yoludur. Buna karşılık, nanoport tertibatları kalıcı olarak bağlanır, 1.000 psi'ye kadar basınçlara dayanır ve elimizde kullanımları farklı çaplardaki PEEK boruları ile sınırlıdır. PEEK boruları tercihen kullanıldığından bu bir dezavantaj değildir. Kalıcı montajlara sahip tek bir cam akış hücresi, dikkatli kullanımla 1 yıldan fazla bir süre boyunca tekrar kullanılabilir.

Protokol

1. Lazer tuzak hizalama ve polistiren boncuklarla test

NOT: Kurulum için Şekil 1A,B'ye bakın.

DİKKAT: Deneyci, lazer ışını hizalaması sırasında uygun koruyucu gözlük veya lazer güvenlik gözlüğü takmalıdır. Burada açıklanan optik cımbız sistemi hem HeNe hem de IR ışınlarını kullandığından, iki ayrı lazer güvenlik cam eşyası seti gereklidir.

1. HeNe Kiriş hizalaması
   1. Tüm optik bileşenleri breadboard üzerine yerleştirin. Breadboard'u, mikroskopa göre mümkün olduğunca 90° açıya yakın olacak şekilde hizalayın.
   2. Objektif ve telan lensi içeren çiftleşme tüpünü mikroskopa takın (Şekil 1A-11,12).
      NOT: Telan lens, görüntüyü göz merceklerindeki ara görüntü düzlemine odaklamak için kullanılan bir lens sistemidir.
   3. HeNe lazeri açın ve deklanşörü açın (Şekil 1A-18). Işın, ışığın %50'sini ayna 5'e yansıtan 54 mm yükseklikte filtreye (Şekil 1A-3) çarpmalıdır (Şekil 1A-5). Kirişin geri kalan %50'si ayna 4'e (Şekil 1A-4) ayna 3 ile aynı yükseklikte çarpar.
   4. Ayna 4'ü (Şekil 1A-4), ışın ayna 6'ya (Şekil 1A-6) 51 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın.
   5. Ayna 6'yı (Şekil 1A-6), kiriş alt galvanik aynaya 51 mm yükseklikte yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Üst Galvanik aynadan çıkan kiriş 57,5 mm'de olacaktır.
   6. Ayna 3'ü (Şekil 1A-3), bu ışın ayna 5'e (Şekil 1A-5) 57,5 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın. Ayna 5'ten yansıdıktan sonra, ışın ayna 9'a (Şekil 1A-9) aynı yükseklikte çarpmalıdır. Işın ayna 9'da etkili bir şekilde yeniden birleştirilir, hedeften geçer ve telan lens sistemi ayna 21'e (Şekil 1A-21) yansır ve bu da onu hedefe yansıtır.
   7. Mikroskop sahnesine temiz bir mikroskop slaytı yerleştirin. Kamerayı açın ve sabit ve tarama ışınlarının ışınlarını ekranda ayrı ayrı görüntüleyin. Ayna 3, ardından 5 ve 9, son olarak 21 ile başlayarak, sabit kirişi ekranın ortasına yerleştirmek için küçük ayarlamalar yapın.
   8. Ayna 21'den çıkan ışının açısının 90° olduğundan emin olmak için, mikroskobun Z-yüksekliğini değiştirin ve görüntülenen kirişi kızağın üst ve alt yüzeylerine yerleştirin. Aynı olduklarında, kiriş sahneye dik olan doğru konumdadır. Bu ışını deklanşör 19'u kullanarak kapatın (Şekil 1A-19).
   9. Ayna 4 ve 6'dan başlayarak, sabit kirişi ekranın ortasına yerleştirmek için küçük ayarlamalar yapın. Bu ışını kapatın.
2. Kızılötesi (IR) Işın hizalaması
   DİKKAT: Güvenlik nedenleriyle tüm adımları düşük lazer gücünde gerçekleştirin.
   1. Işın ayırıcı 2'de bölünen iletilen ve yansıyan ışınların oranını ayarlamak için dalga plakası 14'ü (Şekil 1A-14) ayarlayın (Şekil 1A-2). Işın ayırıcı 2, lazer ışınının s-bileşenini yansıtır ve p-bileşenini iletir.
   2. 2'den geçen ışın, kirişi alt galvanik aynaya saptıran ayna 7'ye (Şekil 1A-7) çarpar. HeNe ışınının ayna 21'e giden yolunu izlemelidir. Bu konumlandırmayı elde etmek için ayna 7'nin küçük hareketlerini gerçekleştirin.
   3. Ayna 2'yi, ayna 2 tarafından yansıtılan kiriş, ayna 10'a (Şekil 1A-10) 57,5 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın.
   4. Işın, ayna 10'dan ayna 8'e (Şekil 1A-8) 57,5 mm yükseklikte yansıtılır. Sonraki ışın ayna 9'a aynı yükseklikte çarpmalıdır. Değilse, aynalar 10 ve 8'de gerektiği gibi küçük ayarlamalar yapın.
   5. Hedefi çıkarın ve güç ölçerin kafasını hedef taretindeki bağlantı noktasının üzerine yerleştirin.
   6. Her lazer ışınının gücünü Şekil 1C'de gösterildiği gibi eşit olacak şekilde ayarlamak için plaka 14, 15 ve 16'yı (Şekil 1A-14,15,16) kullanın.
   7. Kiriş genişletici 1'i (Şekil 1A-1) yerine yerleştirin. Genişletilmiş lazer ışınını herhangi bir koma veya astigmatizm olmadan dairesel olacak şekilde ayarlayın.
   8. Optik tuzakları test etmek için, suya asılı 1 μm polistiren boncuklardan oluşan bir çözelti yapın. Daha sonra, bu çözeltinin 10 μL'sini bir mikroskop slaydına yerleştirin, üstüne bir kapak kayması yerleştirin ve oje ile kapatın. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve bu 1 μm boncukları yakalayarak optik tuzakları test edin. Boncukların tuzaklara emildiğinden ve sahne hareket ettirildiğinde sabit bir şekilde tutulduğundan emin olun. Tuzaklama, tuzağın her tarafından eşit derecede verimli bir şekilde gerçekleşmelidir.

2. Mikroakışkan oda hazırlığı

1. Akış hücresi, bir kapak kapağı üzerinde polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış ticari olarak inşa edilmiş bir cihazsa, adım 3'e geçin. Konektörleri takılı bir cam cihazsa, adım 4'e geçin.
2. Akış hücresinde konektörler takılı değilse, önce bunları mikroskop slaytındaki giriş deliklerine bağlayın. Bağlayıcı takma adımları için adım 3'e bakın.

3. PDMS akış hücresi kullanarak akış hücresi bağlantıları

NOT: Kurulum için Şekil 2B'ye bakın.

1. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan 3 mm tutun. Boruyu önceden oluşturulmuş porta itin (port 2 bar hat basıncını destekleyebilir).
2. Kalan bağlantı noktalarının her biri için bu yordamı yineleyin. Giriş portlarını şırınga pompasına ve çıkışı bir atık şişesine bağlayın (Şekil 4A,B).
3. Her cam şırıngayı 1 mL spektrofotometrik sınıf metanol ile doldurun. Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışın atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 μL metanol ile temizleyin (Şekil 4C, kapalı konum).
4. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin (Şekil 4C, açık konum). Yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden 100 μL/s akış hızında 800 μL metanol pompalayın.
5. Ertesi gün, 800 μL ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır.

4. Prese uygun boru konektörlerinin takılması

NOT: Kurulum için Şekil 2F'ye bakın.

1. Prese takılan boru konektörleri kullanılacaksa, yapışkan bandı konektörün bir tarafından dikkatlice çıkarın ve mikroskop slaytındaki deliğin üzerine yerleştirin. Birkaç saniye boyunca aşağı basın. Kalan konektörler için işlemi tekrarlayın.
2. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan 3 mm tutun. Boruyu porttaki önceden oluşturulmuş deliğe itin ve kalan portların her biri için bu prosedürü tekrarlayın.
3. Boruları girişlerden anahtarlama valflerine takın. 7. adıma geçin.

5. Kalıcı montajların takılması

NOT: Kurulum için Şekil 2A-C'ye bakın.

1. Yapıştırma işlemi sırasında akış hücresini ve konektörleri yerinde tutmak için ataşmanı temiz, düz bir yüzeyde veya özel yapım bir manifoldda gerçekleştirin.
2. Akış hücresini temiz düz bir yüzeye veya manifoldun girintili bölümüne yerleştirin (Şekil 2B). Montajın altına az miktarda cam yapıştırıcı yerleştirin ve contayı yerleştirin.
3. Nanoportu mikroskop slaytındaki giriş deliklerinden birinin üzerine yerleştirin. Yanal hareket olmadan yavaşça aşağı doğru itin ve yerinde tutun. Kalan bağlantı noktaları için işlemi yineleyin.
4. Manifoldda kurumaya veya kelepçelenmeye bırakın. Akış hücresini manifolddan yavaşça çıkarın ve montajların akış hücresindeki giriş portlarıyla iyi hizalandığından emin olun. Hazır olduğunuzda adım 7'ye geçin.

6. Akış hücresi bağlantıları ve hazırlanması

NOT: Kurulum için Şekil 4A,B'ye bakın.

1. Mikroskop aşamasına bir akış hücresi yerleştirin. Parmağınızı sıkıca tutturan konektörleri kullanarak boruyu takın.
2. Her cam şırıngayı 1 mL spektrofotometrik sınıf metanol ile doldurun. Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışın atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 μL metanol ile temizleyin (Şekil 4C, kapalı konum).
3. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin (Şekil 4C, açık konum). Yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden 100 μL/s akış hızında 800 μL metanol pompalayın.
4. Ertesi gün, 800 μL ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır.

7. Sıvı akışının kontrolü

1. Anahtarlama valflerini kapalı konuma getirin (Şekil 4C). Şırıngaları çıkarın, artık suyu atın ve şırıngaları deneysel çözeltilerle, örneğin DNA boncuklarıyla doldurun; enzim; ve ATP. Şırıngaları pompaya geri döndürün ve anahtarlama valflerine bağlayın.
2. Bu pozisyonda, herhangi bir kabarcığı çıkarmak için pistonları manuel olarak 5-10 μL aşağı doğru zorlayın. Anahtarlama valfi konumunu Açık olarak değiştirin.
3. Tablo 1'de özetlendiği gibi yakalama ve görselleştirme için en uygun akışkan akış hızını elde etmek üzere akış hızı şemasını kullanın. Optik yakalama için en uygun sıvı akışı, boncukların kararlı bir şekilde yakalanmasını sağlamalı ve DNA gerildikten sonra, B formunda (~ 3.000 bp / μm) olmalıdır.

8. Polistiren boncukların tek DNA molekülleri bağlı olarak yakalanması

1. 10x büyütmede, kanal giriş noktalarına yakın sıvı akışları arasındaki sınırı bulun. 100x hedefine yağ ekleyin ve daha yüksek büyütmeye geçin.
2. Optik tuzaklar için deklanşörleri açın (her ikisi birden veya birer tane). Odaklanmış lazer ışınları boncukları yakalamalı ve DNA hemen uzanmalıdır.
3. Bir kompleks tuzağa düşürüldükten sonra, sahneyi akışa dik olarak çevirin (Şekil 3A, C, giriş). Bu, sıkışmış kompleksi DNA boncuk çözeltisinden akış 2'ye taşıyacaktır. Daha fazla çeviri, kompleksi akış 3'e taşıyacaktır.

9. Akış hücresi temizliği

NOT: Bunu günlük olarak gerçekleştirin.

1. Deney tamamlandığında pompayı kapatın. Anahtarlama valflerini kapalı konuma getirin (Şekil 4C).
2. Şırıngaları çıkarın ve boşaltın. Filtrelenmiş damıtılmış su ile üç kez durulayın.
3. Şırıngaları temizleme solüsyonu ile doldurun. Şırıngaları pompaya yerleştirin ve anahtarlama vanalarına bağlayın.
4. Anahtarlama valflerini boşaltın ve konumu açmak için değiştirin. Tipik olarak gece boyunca 100 μL/s akış hızında 800 μL temizleme çözeltisi pompalayın.
5. Ertesi gün, anahtarlama valflerini kapatın ve ardından şırıngaları suyla çıkarın ve durulayın. Akış hücresini ve hatlarını 400-800 μL su ile 400-800 μL / s akış hızında durulayın. Akış hücrelerinin daha yorucu bir şekilde temizlenmesi gerekiyorsa, temizleme çözeltisini 6 M guanidium hidroklorür ile değiştirin.

Sonuçlar

Tuzak hizalamasının ve mukavemetinin ilk testi 1 μm, floresan olmayan polistiren boncuklarla yapılır. Laboratuvarda yapılan araştırmaların çoğu floresan kullandığından, 1 μm, Dragon yeşil polistiren boncuklar kullanarak tuzak mukavemetini daha da test ediyoruz (Şekil 1D, E). Bundan sonra çalışma, DNA'nın bis-intercalating boya YOYO-1^14,29 ile boyandığı DNA-boncuk komplekslerinin optik yakalama...

Tartışmalar

Akış sisteminin dikkatli bir şekilde monte edilmesi, deneylerin başarılı bir şekilde sonuçlanması için kritik öneme sahiptir ^4,6. Protokolün en zorlu yönlerinden biri, konektörlerin cam yüzeye tutturulmasıdır. Bunun için aşağıdaki iki yaklaşımı kullanıyoruz: prese uygun boru konektörleri ve nanoport montajları. Prese takılan konektörler cama kolayca yapışır ve ardından PTFE borularının forseps kullanılarak önceden oluşturulmu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser