使用双光镊和微流体进行单分子研究

摘要

使用玻璃桶、气密注射器、管道与流通池的稳定连接以及通过在注射器和管道之间放置切换阀来消除气泡，极大地促进了通过微流体室研究的视觉单分子生物化学。该协议描述了双光学陷阱，能够可视化DNA交易和分子间相互作用。

摘要

视觉生物化学是一种强大的技术，用于观察单个酶或酶复合物的随机特性，这些特性在批量阶段研究中发生的平均中被掩盖。为了实现可视化，双光学镊子，其中一个陷阱固定，另一个是移动的，聚焦到位于倒置荧光显微镜载物台上的多流微流体室的一个通道中。光学镊子捕获荧光标记的DNA的单个分子，流体流过腔室并经过捕获的珠子，将DNA拉伸至B形（在最小力下，即0 pN），核酸在黑色背景下被观察为白色字符串。DNA分子从一个流移动到下一个流，通过平移垂直于流动的阶段，以受控方式启动反应。为了取得成功，具有光学透明通道的微流体装置与固定在注射泵中的玻璃注射器配合使用。最佳结果是使用永久粘合到流通池的连接器，机械刚性和耐化学腐蚀的管道，以及连接到开关阀，以消除禁止层流的气泡。

引言

在单分子水平上实时可视化蛋白质-DNA相互作用的能力为基因组稳定性提供了重要的见解^1，2。除了一次处理一个DNA分子外，查看附近单个分子之间的交易的能力还提供了额外的洞察力³，^4，5。操纵额外的DNA分子既需要额外的光学陷阱，也需要高质量的多通道微流体流通池⁶。

有几种方法可用于生成多个光学陷阱。这些包括振镜扫描镜、声光调制器和衍射光学器件，它们产生全息光镊⁴，⁷，^8，9。通常，扫描镜和声光调制器会产生分时陷阱。在这里描述的设置中，单个Nd:YAG激光器的光束在偏振上分裂，然后振镜激光扫描镜控制所谓的移动陷阱的位置（图1）⁴。为了便于定位反射镜和滤光片，将捕获光束引导到显微镜物镜的后孔径，使用了HeNe激光器。这使得整体对准更容易，因为HeNe光束是肉眼可见的，而红外光束则不是。氦氖光束也更安全，可以减轻镜子和其他组件的定位压力。最初，该激光器的光束路径与1064 nm光束分开，但被引入相同的光束路径，然后进入显微镜物镜。一旦实现物理对准，就可以将 1064 nm 光束定位在 HeNe 光束的顶部，这可以通过使用红外观察器和各种光束成像工具来可视化光束位置和质量来实现。然后，引入扩束镜，并将所得的扩增红外光束对准物镜的后孔径。最后，移除物镜，并使用λ/2波片测量和调整每个偏振光束中的功率以使其相等（图1C）。返回物镜后也会进行功率测量，通常有53%的功率损耗。然而，有足够的功率在焦平面中形成稳定的固定和移动光学陷阱（图1D）。

为了对DNA交易进行成像，微流体流通池起着关键作用，因为它们允许在单分子水平上进行具有高空间和时间分辨率的受控测量（图2）。术语微流体是指在一个或多个通道中操纵流体的能力，尺寸范围为5-500μm^10，11。术语流是指通道内的实际流体，通道是指一个或多个流体流在其中移动的物理通道。单通道流通池设计具有一个通用的物理通道，用于观察反应，并且通常仅存在一个流体流。因此，这些设计被称为单流流通池。相比之下，多流流通池被定义为一种微流体装置，其中两个或多个入口通道汇聚成一个公共物理通道（图2A）。在公共通道内，源自各个通道的流体流彼此平行流动，并保持分离，由于扩散，它们之间的混合很小（图2B）。在大多数实验设置中，单个泵以相同的速度将流体推入每个通道。相反，当使用边界转向时，三个或更多独立控制的泵将流体推动通过通道。然而，每个泵以不同的速度运行，但公共通道中的净流量恒定为¹²。这允许通过改变泵速来快速更换主通道组件。

除了层流，另一个关键因素是层流内的抛物线速度分布。最高流速出现在流的中间，最慢的流速出现在表面旁边（图2C）¹³。必须考虑该谱图以完全拉伸附着在流中的磁珠上的DNA分子，以实现荧光DNA的精确可视化和准确的单分子分析。在这里，DNA被拉伸到B形式，并在0pN的力下保持在适当的位置。为此，光学陷阱位置的聚焦应位于距底部盖玻片表面10-20μm的位置（图2D）。必须注意使DNA分子不会拉伸到B型以上，因为这会抑制酶反应。在典型的缓冲条件下，1 μm = 3，000 bp 的 DNA¹⁴。此外，通过从盖玻片捕获10-20μm，DNA复合物远离表面，从而最大限度地减少表面相互作用。

许多方法已被用于创建微流体设备通道，这些可以在实验室中完成，或者可以从商业来源购买^流通池6，¹⁵，^16，17。用于构建流通池的最佳材料必须是机械刚性、低荧光的光学透明和不受有机溶剂的影响⁶。通常，硼硅酸盐浮法玻璃或熔融石英用于长时间提供稳定的流动环境，适用于光学捕获、可视化和力检测。这些材料还允许使用非水溶剂（例如分光光度级甲醇）来简化表面润湿和去除气泡，并使用变性剂（例如6M盐酸胍）或洗涤剂来清洁流通池。最后，用于将流体引入流通池的方法从复杂的真空泵系统到单注射泵¹⁴，¹⁸，¹⁹，20，²¹，^22，23，²⁴，²⁵，^26，27。在这里描述的方法中，使用最多可容纳10个注射器的注射泵（图3A）。这为使用单通道流通池或具有多个入口通道的流通池提供了灵活性。在这里，使用三通道流通池，并使用聚醚醚酮（PEEK）管与注射泵上固定的注射器配合使用（图3A-C）。流体的流动由四通切换阀控制，从而最大限度地减少气泡进入流通池（图3A，D）。此外，建议使用具有坚硬玻璃壁和聚四氟乙烯（PTFE）涂层柱塞的汉密尔顿气密注射器，因为它们提供异常平稳的柱塞运动，这对于获得平稳的流动至关重要^14，27。

在所描述的实验系统中，使用了具有两到五个入口通道的流通池。入口通道的数量由正在进行的实验决定。对于RecBCD和Hop2-Mnd1的研究，两个流道就足够了^14，28。对于解旋酶，酶与DNA的自由端结合并翻译成含有镁和ATP的流以启动易位和解开。对于Hop2-Mnd1，光学捕获的DNA被翻译成含有蛋白质和缓冲液的相邻流体流±二价金属离子。使用三通道流通池可以捕获流1中的DNA，将DNA翻译成流2以允许蛋白质结合发生，然后在存在ATP的情况下将DNA翻译成流3，例如启动反应。上述方法的变体是在通道2中使用荧光标记的蛋白质，这导致流体流完全白色并排除DNA的可视化。当该分子被翻译成流3时，当反应开始时，蛋白质和DNA现在都可见。

使用四通切换阀来控制流体流量是消除流通池中气泡的系统的关键组成部分。气泡不利于稳定的流体流动，因为它们以不可预测的方式收缩和膨胀，导致流速快速变化并引入湍流。当阀门位于注射器和入口管之间时，当更换注射器时，通过切换阀门位置来断开流路。当新注射器就位时，可以手动压下柱塞，以便喷射出>6μL（阀门的死体积），这几乎完全消除了气泡。

将连接器连接到流通池通常是流通池使用中的限速步骤。我们描述了两种类型的连接器的使用:称为压接的可拆卸连接器和永久连接器（纳米端口组件）。可拆卸连接器易于粘附在流通池上，除了推荐的PTFE外，还可以使用这些连接器测试不同类型的柔性管。这是一种快速且经济高效的方法来测试管道和连接器，而不会牺牲更昂贵的玻璃流通池。相比之下，纳米端口组件是永久连接的，可承受高达1，000 psi的压力，并且在我们手中，它们的使用仅限于不同直径的PEEK管。这不是缺点，因为最好使用PEEK管。连接有永久组件的单个玻璃流通池可以重复使用 1 年以上，小心使用。

研究方案

1. 使用聚苯乙烯微珠进行激光陷阱对准和测试

注:有关设置，请参阅 图 1A，B。

注意:在激光束对准期间，实验人员应佩戴适当的防护眼镜或激光安全眼镜。由于本文描述的光学镊子系统同时使用HeNe和IR光束，因此需要两套单独的激光安全玻璃器皿。

1. 氦氖光束对准
   1. 将所有光学元件放在面包板上。对齐试验板，使其相对于显微镜尽可能接近90°角。
   2. 将包含物镜和特兰透镜的配合管连接到显微镜上（图1A-11，12）。
      注意:特兰镜头是一种镜头系统，用于将图像聚焦在目镜的中间图像平面上。
   3. 打开氦氖激光并打开快门（图1A-18）。光束应在 54 mm 的高度撞击滤光片（图 1A-3），将 50% 的光反射到镜子 5 上（图 1A-5）。其余 50% 的光束以与反射镜 3 相同的高度撞击镜子 4（图 1A-4）。
   4. 调整镜子4（图1A-4），使光束以51毫米的高度撞击镜子6（图1A-6）。
   5. 调整镜子6（图1A-6），使光束指向高度为51 mm的下部电流镜。从上部电镜射出的光束将为57.5毫米。
   6. 调整镜子3（图1A-3），使该光束以57.5毫米的高度撞击镜子5（图1A-5）。一旦从镜子5反射，光束应以相同的高度撞击镜子9（图1A-9）。光束在镜子9处有效地重新组合，穿过物镜，特兰透镜系统进入镜子21（图1A-21），将其反射到物镜中。
   7. 将干净的显微镜载玻片放在显微镜载物台上。打开相机，在屏幕上分别对固定光束和扫描光束的光束进行成像。从镜子 3 开始，然后是 5 和 9，最后是 21，执行小调整以将固定光束定位在屏幕中央。
   8. 为了确保光束离开镜21的角度为90°，改变显微镜的Z高度并将成像的光束定位在载玻片的上表面和下表面上。当它们相同时，光束处于正确的位置，垂直于载物台。使用快门19快门使此光束快门（图1A-19）。
   9. 从镜子 4 和 6 开始，执行小的调整以将固定光束定位在屏幕的中心。关闭此光束。
2. 红外 （IR） 光束对准
   注意:出于安全原因，在低激光功率下执行所有步骤。
   1. 调整波片14（图1A-14）以调整在分束器2处被分割的透射光束和反射光束的比例（图1A-2）。分束器2反射激光束的s分量并透射p分量。
   2. 穿过 2 的光束撞击镜子 7（图 1A-7），后者将光束偏转到下部电镜上。它应该沿着HeNe光束的路径进入镜子21。执行镜子7的小动作以实现此定位。
   3. 调整镜子2，使镜子2反射的光束以57.5mm的高度照射镜子10（图1A-10）。
   4. 光束从镜子10反射到镜子8（图1A-8）上，高度为57.5毫米。随后的光束应以相同的高度撞击镜子9。如果没有，请根据需要对镜像 10 和 8 进行小幅调整。
   5. 拆下物镜并将功率计的头部放在物镜转盘的端口上。
   6. 使用板14，15和16（图1A-14，15，16）调整每个激光束的功率，使它们相等，如图1C所示。
   7. 将扩束镜 1（图 1A-1）安装到位。将扩展的激光束调整为圆形，没有任何昏迷或散光。
   8. 为了测试光学陷阱，使悬浮在水中的1μm聚苯乙烯珠溶液。然后，将该溶液的 10 μL 放在显微镜载玻片上，将盖玻片放在顶部并用指甲油密封。将载玻片放在显微镜载物台上，并通过捕获这些1μm珠子来测试光学陷阱。确保珠子被吸入陷阱中，并在移动载物台时稳定地保持。从陷阱的所有侧面进行陷印应该同样有效地进行。

2. 微流控室制备

1. 如果流通池是由盖玻片上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的商业构建设备，请继续执行步骤3。如果是连接了连接器的玻璃设备，请继续执行步骤 4。
2. 如果流通池未连接连接器，请先将它们粘合到显微镜载玻片上的入口孔上。有关连接连接器的步骤，请参阅步骤 3。

3. 使用 PDMS 流通池的流通池连接

注:有关设置，请参阅 图 2D。

1. 将流通池放在干净的平坦表面上。用镊子将 PTFE 管从自由端固定 3 毫米。将管子推入预成型端口（端口可支持2巴管路压力）。
2. 对其余每个端口重复此过程。将入口端口连接到注射泵，将出口连接到废液瓶（图4A，B）。
3. 用 1 mL 分光光度级甲醇填充每个玻璃注射器。将每个注射器连接到切换阀。确保阀门的出口指向废物，并用 50 μL 甲醇吹扫每条管路（图 4C，关闭位置）。
4. 将出口位置切换到流通池（图 4C，打开位置）。以 100 μL/h 的流速将 800 μL 甲醇泵入流通池，以润湿表面并消除气泡。
5. 第二天，使用 800 μL 超纯水重复此过程。流通池现已准备就绪，可供使用。

4. 压接管接头的附件

注:有关设置，请参阅 图 2F。

1. 如果要使用压接管接头，请小心地从接头的一侧取下胶带，并将其放在显微镜载玻片的孔上。按下几秒钟。对其余连接器重复此过程。
2. 将流通池放在干净的平坦表面上。用镊子将 PTFE 管从自由端固定 3 毫米。将管子推入端口中的预成型孔中，并对其余每个端口重复此过程。
3. 将管道从入口连接到切换阀。继续执行步骤 7。

5. 常设大会的附件

注:有关设置，请参阅图 2A-C。

1. 在干净、平坦的表面上或在定制的歧管上执行连接，以便在粘合时将流通池和连接器固定到位。
2. 将流通池放在干净的平坦表面上或歧管的凹陷部分（图 2B）。将少量玻璃胶放在组件底部并插入密封件。
3. 将纳米端口定位在显微镜载玻片上的一个入口孔上。轻轻向下推并保持到位，不要横向移动。对其余端口重复此过程。
4. 在歧管中干燥或夹紧到位。轻轻地从歧管中取出流通池，并确保组件与流通池中的入口端口正确对齐。准备就绪后继续执行步骤 7。

6. 流通池连接和制备

注:有关设置，请参阅 图 4A，B。

1. 将流通池放在显微镜载物台上。使用手指紧固的连接器连接管道。
2. 用 1 mL 分光光度级甲醇填充每个玻璃注射器。将每个注射器连接到切换阀。确保阀门的出口指向废物，并用 50 μL 甲醇吹扫每条管路（图 4C，关闭位置）。
3. 将出口位置切换到流通池（图 4C，打开位置）。以 100 μL/h 的流速将 800 μL 甲醇泵入流通池，以润湿表面并消除气泡。
4. 第二天，使用 800 μL 超纯水重复此过程。流通池现已准备就绪，可供使用。

7. 流体流量控制

1. 将切换阀转到关闭位置（图4C）。取出注射器，丢弃残留的水，并用实验溶液填充注射器，例如DNA珠;酶;和 ATP。将注射器返回到泵并将它们连接到切换阀。
2. 在此位置，手动将柱塞向下压 5-10 μL 以去除任何气泡。将切换阀位置更改为 打开。
3. 使用流速方案实现最佳捕集和可视化的流体流动速度，如 表 1 所示。用于光学捕获的最佳流体流动应能够稳定捕获磁珠，一旦DNA被拉伸，它应该是B型（~3，000 bp / μm）。

8. 捕获附着有单个DNA分子的聚苯乙烯珠

1. 在 10 倍放大倍率下，定位靠近通道入口点的流体流之间的边界。向100倍物镜加油并切换到更高的放大倍率。
2. 打开光学陷阱的百叶窗（两个或一次一个）。聚焦的激光束应该捕获珠子，DNA应该立即伸展。
3. 一旦复合物被捕获，将垂直于流动的载物台平移（图3A，C，插图）。这会将捕获的复合物从DNA珠溶液中移入流2。进一步的翻译会将复合体移动到流 3。

9. 流通池清洗

注意:每天执行此操作。

1. 实验完成后关闭泵。将切换阀转到关闭位置（图4C）。
2. 取出注射器并清空它们。用过滤的蒸馏水冲洗三次。
3. 用清洁溶液填充注射器。将注射器放入泵中并连接到切换阀。
4. 吹扫切换阀并更改打开位置。以 100 μL/h 的流速泵送 800 μL 清洁溶液，通常过夜。
5. 第二天，关闭切换阀，然后取出并用水冲洗注射器。用 4-800 μL 水以 400-800 μL/h 的流速冲洗流通池和管线。如果需要对流通池进行更剧烈的清洁，请用6 M盐酸胍替换清洁溶液。

结果

捕集阱排列和强度的初始测试是用1 μm的非荧光聚苯乙烯珠完成的。由于在实验室中进行的大多数研究都使用荧光，因此我们使用1μm龙绿色聚苯乙烯珠进一步测试捕集强度（图1D，E）。此后，工作改为DNA珠复合物的光学捕获，其中DNA用双插层染料YOYO-1^14，29染色。当这些复合物被困在微流体流通池中盖玻片表面上方10-15...

讨论

流动系统的仔细组装对于实验^4，6的成功结果至关重要。该协议最具挑战性的方面之一是将连接器连接到玻璃表面。为此，我们使用以下两种方法:压配管接头和纳米端口组件。压接连接器很容易粘附在玻璃上，然后使用镊子将PTFE管推入预成型孔中。当需要更稳定的附着时，优选纳米端口组件的粘合。通过仔细使用和清洁，带有永久组件的单个玻璃流通?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser