تنفيذ استئصال ورم الدماغ بأقل قدر من التدخل الجراحي في القوارض لجمع الأنسجة عالية الجدوى

Summary

يصف البروتوكول الحالي استئصالا موحدا لأورام الدماغ في القوارض من خلال نهج طفيف التوغل مع نظام متكامل للحفاظ على الأنسجة. هذه التقنية لها آثار على عكس مستوى الرعاية بدقة في القوارض والنماذج الحيوانية الأخرى.

Abstract

يصف هذا البروتوكول نموذجا موحدا لاستئصال أورام دماغ القوارض والحفاظ على الأنسجة. في الممارسة السريرية ، يعد استئصال الورم الأقصى هو العلاج القياسي للرعاية لمعظم أورام الدماغ. ومع ذلك ، فإن معظم نماذج أورام الدماغ قبل السريرية المتاحة حاليا إما لا تشمل الاستئصال ، أو تستخدم نماذج الاستئصال الجراحي التي تستغرق وقتا طويلا وتؤدي إلى اعتلال كبير بعد العملية الجراحية أو الوفيات أو التباين التجريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون إجراء الاستئصال في القوارض أمرا شاقا لعدة أسباب ، بما في ذلك عدم وجود أدوات أو بروتوكولات جراحية قابلة للمقارنة سريريا وعدم وجود منصة راسخة لجمع الأنسجة الموحدة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على استخدام جهاز استئصال متعدد الوظائف وغير استئصالي ونظام متكامل للحفاظ على الأنسجة مقتبس من النسخة السريرية من الجهاز. يجمع الجهاز المطبق في هذه الدراسة بين الشفط القابل للضبط وشفرة أسطوانية عند الفتحة لفحص الأنسجة وقطعها وشفطها بدقة. يؤدي جهاز الاستئصال الأقل بضعا وظائفه عبر نفس ثقب اللدغ المستخدم في زرع الورم الأولي. يقلل هذا النهج من التغييرات في التشريح الإقليمي أثناء خزعة أو جراحات الاستئصال ويقلل من خطر فقدان الدم بشكل كبير. هذه العوامل خفضت بشكل كبير من وقت العملية (<2 دقيقة /) ، وتحسين بقاء الحيوان بعد العملية الجراحية ، وانخفاض التباين في المجموعات التجريبية ، وتؤدي إلى قابلية عالية للأنسجة والخلايا المقطوعة للتحليلات المستقبلية. يتم تسهيل هذه العملية من خلال سرعة شفرة تبلغ ~ 1400 دورة / دقيقة ، مما يسمح بحصاد الأنسجة في نظام مغلق معقم يمكن ملؤه بمحلول فسيولوجي من اختيارك. ونظرا للأهمية الناشئة لدراسة ونمذجة تأثير الجراحة بدقة، والحفاظ على عينات استئصال الورم الإقليمية وتحليلها المقارن الدقيق، والعلاجات التي يتم تسليمها داخل التجويف، فإن هذا البروتوكول الفريد من نوعه سيوسع الفرص لاستكشاف الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها حول الإدارة المحيطة بالجراحة والاكتشاف العلاجي لمرضى أورام الدماغ.

Introduction

الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو ورم الدماغ الأولي الأكثر شيوعا وعدوانية لدى البالغين. على الرغم من التطورات الحديثة في جراحة المخ والأعصاب ، وتطوير الأدوية المستهدفة ، والعلاج الإشعاعي ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات لمرضى GBM أقل من 5٪ ، وهي إحصائية لم تتحسن بشكل كبير منذ أكثر من ثلاثة عقود¹. وبالتالي ، هناك حاجة إلى استراتيجيات علاج أكثر فعالية.

لتطوير علاجات جديدة ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن البروتوكولات الاستقصائية تحتاج إلى (1) استخدام نماذج ما قبل السريرية القابلة للترجمة التي تلخص بدقة عدم تجانس الورم والبيئة الدقيقة ، (2) تعكس النظام العلاجي القياسي المستخدم في المرضى الذين يعانون من GBM ، والذي يشمل حاليا الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، و (3) حساب الفرق بين النواة المقطوعة والمتبقية ، أنسجة الورم الغازية²،^3،4،5. ومع ذلك ، فإن معظم نماذج أورام الدماغ قبل السريرية المتاحة حاليا إما لا تنفذ الاستئصال الجراحي أو تستخدم نماذج الاستئصال الجراحي التي تستغرق وقتا طويلا نسبيا ، مما يؤدي إلى كمية كبيرة من فقدان الدم أو تفتقر إلى التوحيد. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون إجراء استئصال أورام دماغ القوارض أمرا صعبا بسبب عدم وجود أدوات أو بروتوكولات جراحية قابلة للمقارنة سريريا وعدم وجود منصة⁶ ثابتة لجمع الأنسجة بشكل منهجي (الجدول 1).

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف نموذج موحد لاستئصال أورام دماغ القوارض والحفاظ على الأنسجة باستخدام نظام استئصال طفيف التوغل غير استئصالي متعدد الوظائف (MIRS) ونظام متكامل للحفاظ على الأنسجة (TPS) (الشكل 1). ومن المتوقع أن توفر هذه التقنية الفريدة منصة موحدة يمكن استخدامها في دراسات مختلفة في البحوث قبل السريرية ل GBM وأنواع أخرى من نماذج أورام الدماغ. يمكن للباحثين الذين يحققون في الطرائق العلاجية أو التشخيصية لأورام الدماغ تنفيذ هذا البروتوكول لتحقيق استئصال موحد في دراساتهم.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على الحيوانات من قبل جامعة ميريلاند ولجنة جامعة جونز هوبكنز المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام C57BL/6 إناث الفئران، 6-8 أسابيع من العمر، لهذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد). تم اتباع جميع لوائح السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2) ، بما في ذلك استخدام الأقنعة والقفازات والعباءات.

1. زرع الورم الأولي داخل الجمجمة

1. في المرحلة الأولية من الدراسة ، حقن كل فأر داخل الجمجمة مع 100000 خلية (خط خلايا الورم الدبقي الفئران GL261) معلقة في 4 ميكرولتر من المالحة العازلة بالفوسفات (1x PBS) على عمق 2.5 مم بعد التقرير^{المنشور سابقا 7}.
2. تحديد كمية إشارة الورم في كل فأر باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي ⁸ 9 أيام بعد زرع الورم.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بتقسيم الفئران إلى مجموعتين بناء على عبء الورم. في هذه الدراسة ، كانت المجموعتان: (1) الفئران ذات عبء الورم الصغير نسبيا (متوسط إشارة اللمعان الحيوي = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 فوتونات / فوتونات ، n = 10) و (2) الفئران ذات عبء الورم الكبير نسبيا (متوسط إشارة الإنارة الحيوية = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 فوتونات / فوتونات ، n = 10) ، (p < 0.05 ، اختبار مان ويتنى)⁹.
3. قسم كل مجموعة إلى مجموعتين فرعيتين متشابهتين.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، كانت المجموعتان الفرعيتان: الفئران غير المعالجة (n = 5) والفئران التي لديها أورام تخضع للاستئصال الجراحي باستخدام MIRS (n = 5) ، (p > 0.05 ، اختبار Mann-Whitney)⁹.
4. بدءا من يوم الاستئصال ، تتبع تطور الورم باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي بتردد يعتمد على نمط نمو الورم.
   ملاحظة: بالنسبة لخط الخلايا GL261 ، تتبع تطور الورم في يوم الاستئصال ثم كل 3-6 أيام.

2. استئصال الورم باستخدام MIRS

1. تخدير الفأر باستخدام خليط غاز isoflurane-O₂ في غرفة الحث أو الحقن داخل الصفاق من محلول الزيلازين / الكيتامين.
   1. في حالة استخدام مخدر الغاز، اضبط معدل تدفق الغاز على 1.0 ملليلتر/دقيقة والمبخر على 2.0٪ لتحريض التخدير، وعادة ما يتطلب 3-5 دقائق في الغرفة (انظر جدول المواد).
   2. في حالة استخدام المخدر القابل للحقن ، قم بتخدير الفئران عن طريق حقن 0.2 مل من محلول مخدر (80-100 مجم / كجم من الكيتامين و 10-12.5 مجم / كجم من الزيلازين ، انظر جدول المواد) داخل الصفاق.
2. تقييم الحيوان للتخدير الكافي عن طريق معسر إصبع القدم. ضع مرهم العيون على العينين لتجنب جفاف القرنية. إعطاء مسكن (0.03-0.06 مغ/كغ من البوبرينورفين تحت الجلد) قبل الإجراء.
3. ضع الماوس على الإطار التجسيمي (انظر جدول المواد) بمجرد تأكيد التخدير الكامل.
   ملاحظة: في حالة استخدام مخدر الغاز، ضع أنف الفأر في مخروط الأنف حيث سيستمر في تلقي خليط الأيزوفلوران-O₂ أثناء الإجراء (1.5٪).
4. قم بإزالة الدبابيس السابقة ، ثم قم بإزالة الشعر إما باستخدام كريم مزيل للشعر أو عن طريق الحلاقة. قم بتطهير الجلد بدورات متناوبة من مقشر والكحول القائم على الكلورهيكسيدين / البيتادين. ثم، باستخدام مشرط معقم، قم بإنشاء شق طولي في خط الوسط طوله 1 سم على طول الندبة الجراحية السابقة.
5. قم بتوصيل قبضة MIRS بالذراع التجسيمي من خلال محول المرحلة / حامل القبضة لتعزيز الاستقرار والدقة.
6. قم بإعداد جهاز MIRS (انظر جدول المواد) باستخدام الإعدادات التالية (الشكل 1).
   1. أدخل سلك الطاقة المثبت على اللوحة الخلفية في وعاء سلك الطاقة. قم بتشغيل الطاقة إلى النظام أو إيقاف تشغيله عن طريق التبديل (1 = ON، 0 = OFF).
   2. أدخل أحد طرفي خرطوم النيتروجين (المرفق مع وحدة التحكم) في التركيب الذكري على اللوحة الخلفية لوحدة التحكم. قم بتدوير صمولة الاتصال في اتجاه عقارب الساعة لتشديد الاتصال.
      ملاحظة: يجب توصيل الطرف الآخر من الخرطوم بإمدادات النيتروجين.
   3. قبل توصيل الخرطوم بمصدر النيتروجين ، تأكد من أن ضغط الإمداد لا يتجاوز 100 رطل لكل بوصة مربعة ، وهو ضغط إمداد الإدخال الموصى به لوحدة التحكم.
      ملاحظة: ستقوم وحدة التحكم بإنشاء طموحها الخاص عند تنشيطها بواسطة دواسة القدم بمجرد تزويد النيتروجين بوحدة التحكم.
   4. قم بتأمين غطاء منفذ التفريغ وختمه لتجنب أي تسرب في نظام التفريغ. ستؤثر أي تسريبات في نظام الشفط على أداء وحدة تحكم MIRS.
   5. إذا كان الطموح أقل من 17 أثناء الإعداد أو التحضير، فتحقق من ضبط مقبض الشفط الموجود في الجزء الأمامي من وحدة التحكم على المستوى الأقصى (100)، وتأكد من عدم وجود تسرب في نظام الشفط، وتأكد من صحة ضغط إمداد مدخلات النيتروجين.
   6. لتوصيل دواسة القدم بوحدة التحكم، أدخل موصل دواسة القدم الرمادي في الوعاء الرمادي الخاص به حتى ينقر ويتناسب مع موضعه.
      ملاحظة: يتصل موصل دواسة القدم بوحدة التحكم في اتجاه واحد، ويتم إدخاله بمفتاح.
   7. لتوصيل القبضة بوحدة التحكم، أدخل موصل القبضة الزرقاء في الوعاء الأزرق الخاص بها حتى ينقر ويتناسب مع موضعه.
      ملاحظة: يتصل موصل القبضة بوحدة التحكم في اتجاه واحد، ويتم إدخاله.
   8. قم بتعبئة كل قبضة قبل استخدام النظام عن طريق شفط السائل المعقم من وعاء صغير إلى الفتحة ، من خلال الأنابيب والقبضة ، ثم إلى العلبة لضمان تشحيم الجزء الداخلي من الأنابيب والقبضة لتقليل انسداد الأنسجة.
   9. استعد للطموح وحده أو الطموح مع القطع عن طريق تحديد الوضع المناسب على اللوحة الأمامية لوحدة التحكم. ابدأ باستخدام دواسة القدم.
7. أدخل قنية MIRS 23 G في فتحة النتوء على عمق 2.5 مم.
8. ابدأ عملية الاستئصال عن طريق تثبيط دواسة القدم المتصلة بالقنية. قم بإجراء دورة كاملة واحدة (360 درجة) أو أكثر من الاستئصال باستخدام مقبض التحكم الموجود في القبضة.
   ملاحظة: كلما زاد عدد الدورات التي تم إجراؤها ، زاد حجم أنسجة الورم التي تم استئصالها.
9. بمجرد اكتمال عملية الاستئصال ، اسحب قنية MIRS 23 G من ثقب النتوء واستخدم 5 مل من 1x PBS لطرد الأنابيب وإزاحة أي حطام متبقي.
10. قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي وأغلق الجرح بدباسة أو مادة خياطة 4-0 (انظر جدول المواد).
11. ضع الماوس على وسادة تدفئة أو تحت ضوء الاحترار أثناء التعافي من التخدير قبل إعادته إلى قفصه.
12. بعد اكتمال التجربة ، قم بتطهير القنية عن طريق التنظيف. قم بالتناوب مع الوسائط المبردة والهواء "لدفع" جميع الأنسجة المقطوعة مرة أخرى إلى علبة التجميع. قم بإزالة علبة التجميع من النظام وقم بإيقاف الغطاء بالغطاء المقدم.
13. بعد الانتهاء من الخطوة 2.12 ، ضع الطرف البعيد للقنية في 3٪ H 2 O₂وتطبيق الشفط عند 24-25 في Hg لملء خط الشفط مرة أخرى إلى علبة جمع الشفط واتركه يقف لمدة 60-90 ثانية. اغسل بالهواء النابض المعقم للوسائط والوسائط بشكل متقطع.
14. راقب الفئران بحثا عن أي علامات عصبية (حركات أو نوبات غير منتظمة غير طبيعية) بعد الإجراء.
15. القتل الرحيم للفئران التي تعاني من إعاقات عصبية شديدة (تصبح خاملة ، أو لها مظهر هزيل ، أو منحنية الظهر ، أو لديها حركات غير منتظمة).
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة، استخدم 200 مغ/كغ من محلول القتل الرحيم المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) للقتل الرحيم لكل فأر.

3. جمع الأنسجة عبر TPS

1. اغمر عينة الورم في طبق زراعة الأنسجة الذي يحتوي على وسط تحلل RBC (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: الأنسجة التي يتم حصادها من MIRS إلى TPS ستكون في المقام الأول في شكل خلايا مفردة جنبا إلى جنب مع قطع صغيرة من الأنسجة.
2. ضع مرشحا بسعة 70 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على أنبوب مخروطي سعة 50 مل واستخدم مكبس حقنة سعة 5 مل لتمرير عينة الورم عبر الفلتر.
3. باستخدام ماصة النقل ، استخدم وسائط RPMI-1640 لتسهيل مرور الخلايا وأي كتلة أنسجة عبر الفلتر.
4. جهاز طرد مركزي عند 428 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بواسطة ماصة.
5. أعد تعليق كل عينة في 5 مل من وسط RPMI-1640 المحضر.
6. لزيادة صلاحية الأنسجة ، خاصة إذا تم تصور قطع الأنسجة الكبيرة عند الانطباع الأولي ، أضف الكميات المطلوبة من كوكتيل الإنزيم (الذي يحتوي على الحمض النووي الأول ، والكولاجيناز الرابع ، و dispase ، و Papain ، و EDTA ، انظر جدول المواد) إلى كل عينة. استخدم الدوامة لخلط الحلول.
   ملاحظة: الخطوة 3.6 اختيارية. تكوين كوكتيل الإنزيم (لحجم إجمالي قدره 5 مل / عينة): 300 ميكرولتر من الحمض النووي الأول من الدرجة الثانية ، و 150 ميكرولتر من الكولاجيناز / ديسباز (يشق الفيبرونيكتين ، والكولاجيناز الرابع ، الأول ، والأحماض الأمينية غير القطبية) ، و 250 ميكرولتر من الغراء (البروتياز غير المحدد) ، و 6 ميكرولتر من 0.5 م EDTA.
7. ضع العينات في حاضنة اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
8. بعد 20 دقيقة ، قم بتدوير العينات عند 428 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
9. قم بتصفية الخلايا المفردة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر وقم بالدوران لأسفل عند 274 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإجراء تحليل جدوى الخلية¹⁰ باستخدام Trypan Blue ومقياس الدم (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: تتراوح صلاحية اليوم 0 من 30٪ إلى 70٪ وتزداد بشكل كبير في غضون 2-3 أيام.
10. انتقل إلى الخطوات 4 أو 5 أو 6، بناء على اختبار الجدوى المطلوب.

4. نمو الخلايا في ثقافة الالتصاق

1. في غطاء التدفق الرقائقي المعتمد، أعد تعليق الكريات في وسط ملتصق يحتوي على مصل (مثل DMEM، ومصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS)، ومحلول البنسلين/الستربتومايسين (P/S) بنسبة 1٪) وخلايا الصفيحة في قارورة خلية ملتصقة.
2. الحفاظ على الخلايا في بيئة محتضنة خاضعة للرقابة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂).

5. الخلايا النامية في ثقافة التعليق (الغلاف العصبي)

1. في غطاء التدفق الرقائقي المعتمد، أعد تعليق الكريات في وسط الخلايا الجذعية الكاملة الخالية من المصل¹¹ والصفيحة في قارورة تعليق.
2. الحفاظ على الخلايا في بيئة محتضنة خاضعة للرقابة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2) لمدة_2-3 أيام للسماح بتكوين الغلاف العصبي.
3. بعد تصور الغلاف العصبي في وسط الزرع، استخدم التربسين-EDTA أو Accutase (انظر جدول المواد) للحصول على معلقات أحادية الخلية للمرور.
   ملاحظة: طالما يتم توخي الحذر بشكل خاص أثناء الحصاد ويتم استخدام الوسائط المناسبة التي تدعم الخلايا الجذعية العصبية ، يجب أن تشكل الخلايا الجذعية في الأنسجة التي تم حصادها أغلفة عصبية في غضون أيام قليلة.

6. إعداد الخلايا لإعادة زرعها

1. أعد تعليق الكريات بتركيز 100000 خلية حية لكل 4 ميكرولتر من 1x PBS.
2. حقن على الفور في الفئران الساذجة باستخدام طريقة زرع الورم داخل الجمجمة (الخطوة 1).

7. التحليل النسيجي

1. مباشرة بعد الاستئصال ، استخراج وإصلاح الأدمغة في 4 ٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 24 ساعة¹².
2. انقل الأدمغة إلى محلول السكروز بنسبة 30٪ حتى يتم تشبعها بالسكروز (الغارقة حتى أسفل الحاوية).
3. نقل الأدمغة إلى محلول الإيثانول بنسبة 70٪.
4. قم بإجراء تضمين كتلة البارافين وتقسيمها وتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين القياسي (H & E) بعد التقرير المنشور سابقا¹³.
   ملاحظة: سمك كل قسم مأخوذ للتلطيخ كان 10 ميكرومتر.

النتائج

الاستئصال الجراحي باستخدام MIRS يؤدي إلى انخفاض كبير في عبء الورم
في المجموعة ذات عبء الورم الأصغر ، كان متوسط إشارة خط الأساس الحيوي 5.5e + 006 فوتونات / ثانية ± 0.2e + 006 في المجموعة الفرعية التي خضعت للاستئصال. بعد الاستئصال، انخفض متوسط إشارة الإنارة الحيوية إلى 3.09e+006 فوتونات/ثانية ± 0...

Discussion

استئصال الورم هو حجر الزاوية في خطط علاج الأورام العصبية الجراحية لكل من أورام الدماغ منخفضة الدرجة وعالية الجودة. يرتبط الحد من الخلايا وإزالة الضخامة من الورم مع تحسين الوظيفة العصبية والبقاء على قيد الحياة بشكل عام في المرضى الذين يعانون من أورام الدماغ¹،^2?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD	309628
15 mL conical tubes	Corning	430052
200 proof ethanol	PharmCo	111000200
5 mL pipettes	CoStar	4487
70 micron filter	Fisher	08-771-2
Accutase	Millipore Sigma	SIG-SCR005
Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL)	Covetrus	33198
Anesthesia System	Patterson Scientific	78935903
Anesthesic Gas Waste Container	Patterson Scientific	78909457
Bench protector underpad	Covidien	10328
C57Bl/6, 6-8 week old mice	Charles River Laboratories	Strain Code 027
ChroMini Pro	Moser	Type 1591-Q
Collagenase-Dispase	Roche	#10269638001
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Countess II FL Hemacytometer	Thermo Fisher	A25750
Debris Removal Solution	Miltenyi Biotech	#130-109-398
D-Luciferin	Goldbio	LUCK-1G
DMEM F12 media	Corning	10-090-CV
DMEM media	Corning	10-013-CV
DNAse I	Sigma Aldrich	#10104159001
Eppendorf tubes	Posi-Click	1149K01
Euthanasia solution	Henry Schein	71073
FBS	Millipore Sigma	F4135
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10437-028
Formalin	Invitrogen	INV-28906
Gauze	Henry Schein	101-4336
hEGF	PeproTech EC	100-15
Heparin	Sigma	H-3149
hFGF-b	PeproTech EC	1001-18B
Induction Chamber	Patterson Scientific	78933388
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Isoflurane Vaporizer	Patterson Scientific	78916954
Ketamine	Covetrus	11695-0703-1
Kopf Stereotactic frame	Kopf Instruments	5001
Lightfield Microscope	BioTek	Cytation 5
Microinjection Unit	Kopf	5001
Micromotor drill	Foredom	F210418
MRI system	Bruker	7T Biospec Avance III MRI Scanner
NICO Myriad System	NICO Corporation
Ophthalmic ointment	Puralube vet ointment
Papain	Sigma Aldrich	#P4762
PBS	Invitrogen	#14190250
PenStrep	Millipore Sigma	N1638
Percoll solution	Sigma Aldrich	#P4937
Pipette controller	Falcon	A07260
Povidone-iodine solution	Aplicare	52380-1905-08
Progesterone	Sigma	P-8783
Putrescine	Sigma	P-5780
RPMI Media	Invitrogen	INV-72400120
Scalpel blade	Covetrus	7319
Scalpel handle	Fine Science Tools	91003-12
Skin marker	Time Out	D538,851
Staple remover	MikRon	ACR9MM
Stapler	MikRon	ACA9MM
Staples	Clay Adams	427631
Stereotactic Frame	Kopf Instruments	5000
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Suture, vicryl 4-0	Ethicon	J494H
T-75 culture flask	Sarstedt	83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)	Lonza	BP10-548E
Trypsin-EDTA	Corning	MDT-25-053-CI