높은 생존력 조직 수집을 위한 설치류의 최소 침습 뇌종양 절제술 시행

요약

본 프로토콜은 통합 조직 보존 시스템을 갖춘 최소 침습적 접근법을 통해 설치류에서 뇌종양의 표준화 된 절제술을 설명합니다. 이 기술은 설치류 및 기타 동물 모델의 치료 표준을 정확하게 반영하는 데 의미가 있습니다.

초록

본 프로토콜은 설치류 뇌종양 절제술 및 조직 보존을 위한 표준화된 패러다임을 기술한다. 임상 실습에서 최대 종양 절제술은 대부분의 뇌종양에 대한 표준 치료 치료법입니다. 그러나 현재 이용 가능한 대부분의 전임상 뇌종양 모델은 절제를 포함하지 않거나 시간이 많이 걸리고 상당한 수술 후 이환율, 사망률 또는 실험적 변동성을 유발하는 외과적 절제 모델을 활용합니다. 또한 설치류에서 절제를 수행하는 것은 임상적으로 비교할 수 있는 수술 도구 또는 프로토콜의 부족과 표준화된 조직 수집을 위한 확립된 플랫폼의 부재를 포함하여 여러 가지 이유로 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 다기능, 비 절제 장치 및 장치의 임상 버전에서 채택 된 통합 조직 보존 시스템의 사용을 강조합니다. 본 연구에 적용된 장치는 조정 가능한 흡입과 조리개에 원통형 블레이드를 결합하여 조직을 정밀하게 조사, 절단 및 흡입합니다. 최소 침습 절제 장치는 초기 종양 이식에 사용 된 것과 동일한 버 구멍을 통해 기능을 수행합니다. 이 접근법은 생검 또는 절제 수술 중 국소 해부학의 변경을 최소화하고 심각한 혈액 손실 위험을 줄입니다. 이러한 요인들은 수술 시간(<2분/동물)을 크게 단축하고, 수술 후 동물 생존을 개선하고, 실험 그룹의 변동성을 낮추고, 향후 분석을 위해 절제된 조직과 세포의 높은 생존력을 초래합니다. 이 과정은 ~ 1,400 사이클 / 분의 블레이드 속도로 촉진되며, 이는 선택한 생리 학적 용액으로 채워질 수있는 멸균 폐쇄 시스템으로 조직을 수확 할 수있게합니다. 수술의 영향, 지역화된 종양 절제술 표본의 보존 및 엄격한 비교 분석, 공동 내 전달 치료제를 연구하고 정확하게 모델링하는 것의 중요성이 커짐에 따라 이 독특한 프로토콜은 뇌종양 환자를 위한 수술 전후 관리 및 치료 발견에 대한 답이 없는 질문을 탐구할 기회를 확대할 것입니다.

서문

교모세포종(GBM)은 성인에서 가장 흔하고 공격적인 원발성 뇌종양입니다. 최근 신경외과, 표적 약물 개발 및 방사선 요법의 발전에도 불구하고 GBM 환자의 5년 생존율은 5% 미만으로 30년 이상 크게 개선되지 않은 통계^입니다1. 따라서보다 효과적인 치료 전략이 필요합니다.

새로운 치료법을 개발하기 위해 연구 프로토콜은 (1) 종양 이질성과 미세 환경을 정확하게 요약하는 번역 가능한 전임상 모델을 활용하고, (2) 현재 수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 포함하는 GBM 환자에게 사용되는 표준 치료 요법을 반영하고, (3) 절제 된 코어와 잔여 코어의 차이를 설명해야한다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 침윤성 종양 조직 2,3,4,5. 그러나 현재 이용 가능한 대부분의 전임상 뇌종양 모델은 외과적 절제를 시행하지 않거나 상대적으로 시간이 많이 소요되는 외과적 절제모델을 활용하여 상당한 양의 출혈을 초래하거나 표준화가 부족합니다. 또한, 설치류 뇌종양의 절제를 수행하는 것은 임상적으로 비교 가능한 수술 도구 또는 프로토콜이 부족하고 체계적인 조직 수집을 위한 확립된 플랫폼⁶의 부재로 인해 어려울 수 있습니다(표 1).

본 프로토콜은 다기능 비절제 최소 침습 절제 시스템(MIRS) 및 통합 조직 보존 시스템(TPS)을 사용하여 설치류 뇌종양 절제 및 조직 보존을 위한 표준화된 패러다임을 설명하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 이 독특한 기술은 GBM 및 기타 유형의 뇌종양 모델에 대한 전임상 연구의 다양한 연구에 활용할 수있는 표준화 된 플랫폼을 제공 할 것으로 기대됩니다. 뇌종양에 대한 치료 또는 진단 양식을 조사하는 연구원은 이 프로토콜을 구현하여 연구에서 표준화된 절제를 달성할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 메릴랜드 대학과 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스, 6-8주령을 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 마스크, 장갑 및 가운 사용을 포함한 모든 생물안전 레벨 2(BSL-2) 규정을 준수했습니다.

1. 초기 두개내 종양 이식

1. 연구의 초기 단계에서, 이전에 발표된 보고서⁷에 이어 4μL의 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 현탁된 100,000개의 세포(GL261 뮤린 신경교종 세포주)를 2.5mm 깊이까지 각 마우스에 두개내 주사합니다.
2. 종양 이식^{후 8}일 9일에 생체내 영상화 시스템을 사용하여 각각의 마우스에서 종양 신호를 정량화한다.
   참고: 필요한 경우 종양 부담에 따라 마우스를 두 그룹으로 계층화합니다. 본 연구에서, 두 그룹은 (1) 상대적으로 작은 종양 부담을 가진 마우스 (평균 생체 발광 신호 = 5.5e + 006 ± 0.1e + 006 광자 / s, n = 10) 및 (2) 상대적으로 큰 종양 부담을 가진 마우스 (평균 생체 발광 신호 = 1.69e + 007 ± 0.2e + 007 광자 / s, n = 10), (p < 0.05, Mann-Whitney 테스트) ⁹.
3. 각 그룹을 두 개의 비교 가능한 하위 그룹으로 나눕니다.
   참고: 이 연구에서, 두 개의 하위군은 다음과 같다: 미처리 마우스 (n=5) 및 MIRS를 사용하여 외과적 절제술을 받는 종양이 있는 마우스(n=5), (p > 0.05, Mann-Whitney test)⁹.
4. 절제 당일부터 시작하여, 종양 성장 패턴에 기초한 빈도로 생체내 영상화 시스템을 사용하여 종양 진행을 추적한다.
   참고: GL261 세포주의 경우 절제 당일과 3-6일마다 종양 진행을 추적합니다.

2. MIRS를 이용한 종양 절제술

1. 유도 챔버에서 이소플루란-_O2 가스 혼합물을 사용하거나 자일라진/케타민 용액을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다.
   1. 가스 마취제를 사용하는 경우 마취 유도를 위해 가스 유속을 1.0mL/min으로 설정하고 기화기를 2.0%로 설정하며 일반적으로 챔버에서 3-5분이 필요합니다( 재료 표 참조).
   2. 주사 가능한 마취제를 사용하는 경우 0.2mL의 마취액(80-100mg/kg의 케타민 및 10-12.5mg/kg의 자일라진, 재료 표 참조)을 복강 주사하여 마우스를 마취합니다.
2. 발가락을 꼬집어 적절한 진정 작용을 위해 동물을 평가하십시오. 각막의 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 시술 전에 진통제 (0.03-0.06 mg / kg 부 프레 노르 핀을 피하 투여하십시오).
3. 완전한 진정이 확인되면 입체 프레임( 재료 표 참조)에 마우스를 놓습니다.
   알림: 가스 마취제를 사용하는 경우 마우스의 코를 코 원뿔에 넣어 절차 중에 이소 플루 란 -O₂ 혼합물을 계속받을 수 있습니다 (1.5 %).
4. 이전 스테이플을 제거한 다음 탈모 크림이나 면도로 머리카락을 제거하십시오. 클로르헥시딘/베타딘 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 피부를 소독하십시오. 그런 다음 멸균 메스를 사용하여 이전 수술 흉터를 따라 1cm 세로 정중선 절개를 만듭니다.
5. MIRS 핸드피스를 스테이지 어댑터/핸드피스 홀더를 통해 스테레오택틱 암에 부착하여 안정성과 정밀도를 높입니다.
6. 다음 설정을 사용하여 MIRS 기계( 재료 표 참조)를 설정합니다(그림 1).
   1. 후면 패널에 설정된 전원 코드를 전원 코드 콘센트에 삽입합니다. 토글(1 = ON, 0 = OFF)하여 시스템의 전원을 켜거나 끕니다.
   2. 질소 호스의 한쪽 끝(콘솔과 함께 제공됨)을 콘솔 후면 패널의 수 피팅에 삽입합니다. 연결 너트를 시계 방향으로 돌려 연결을 조입니다.
      알림: 호스의 반대쪽 끝을 질소 공급 장치에 연결해야 합니다.
   3. 호스를 질소 공급 장치에 연결하기 전에 공급 압력이 콘솔에 권장되는 입력 공급 압력인 100psig를 초과하지 않는지 확인하십시오.
      알림: 콘솔은 질소가 콘솔에 공급되면 풋 페달로 활성화될 때 자체 흡인을 생성합니다.
   4. 진공 포트의 뚜껑을 고정하고 밀봉하여 진공 시스템의 누출을 방지하십시오. 흡인 시스템의 누출은 MIRS 콘솔의 성능에 영향을 미칩니다.
   5. 설정 또는 프라이밍 중에 흡인이 17 미만이면 콘솔 전면의 흡인 손잡이가 최대 수준(100)으로 설정되어 있는지 확인하고 흡인 시스템에 누출이 없는지 확인하고 질소 입력 공급 압력이 올바른지 확인하십시오.
   6. 풋 페달을 콘솔에 연결하려면 딸깍 소리가 나고 제자리에 맞을 때까지 회색 풋 페달 커넥터를 회색 콘센트에 삽입합니다.
      알림: 풋 페달 커넥터는 한 방향으로 콘솔에 연결되며 홈이 있습니다.
   7. 핸드피스를 콘솔에 연결하려면 파란색 핸드피스 커넥터가 딸깍 소리를 내며 제자리에 맞을 때까지 파란색 콘센트에 삽입합니다.
      주: 핸드피스 커넥터는 한 방향으로 콘솔에 연결되며 홈이 있습니다.
   8. 시스템을 사용하기 전에 멸균 유체를 조리개로, 튜브 및 핸드피스를 통해 캐니스터로 흡입하여 각 핸드피스를 프라이밍하여 튜브와 핸드피스 내부가 윤활되어 조직 폐색을 줄이도록 합니다.
   9. 콘솔의 전면 패널에서 적절한 모드를 선택하여 단독 또는 절단으로 포부를 준비하십시오. 풋 페달을 사용하여 시작하십시오.
7. 23G MIRS 캐뉼러를 2.5mm 깊이의 버 구멍에 삽입합니다.
8. 캐뉼러에 연결된 풋 페달을 밟아 절제 과정을 시작하십시오. 핸드피스의 컨트롤 노브를 사용하여 한 번의 전체 사이클(360°) 이상의 절제를 수행합니다.
   참고: 더 많은 사이클을 수행할수록 더 많은 양의 종양 조직이 절제됩니다.
9. 절제 과정이 완료되면 버 구멍에서 23G MIRS 캐뉼러를 빼내고 5mL의 1x PBS를 사용하여 튜브를 세척하고 잔류 파편을 제거합니다.
10. 입체 프레임에서 마우스를 제거하고 스테이플러 또는 4-0 봉합 재료로 상처를 닫습니다 ( 재료 표 참조).
11. 마우스를 케이지로 되돌리기 전에 마취에서 회복하는 동안 가열 패드 또는 따뜻한 빛 아래에 마우스를 놓습니다.
12. 실험이 완료되면 플러싱 을 통해 캐뉼러를 퍼지합니다. 식힌 배지와 공기를 번갈아 가며 절제된 모든 조직을 수집 용기로 다시 "밀어내십시오". 시스템에서 수집 캐니스터를 제거하고 제공된 캡으로 캡을 닫으십시오.
13. 2.12 단계를 완료 한 후 캐뉼러의 말단 팁을 3 % H 2 O₂에 넣고Hg 24-25에서 흡입을 적용하여 흡입 라인을 흡입 수집 캐니스터에 다시 채우고 60-90 초 동안 그대로 두십시오. 공기와 매체가 간헐적으로 펄싱되는 멸균 매체로 플러시하십시오.
14. 시술 후 신경학적 징후(비정상적인 불규칙한 움직임 또는 발작)가 있는지 마우스를 모니터링합니다.
15. 심각한 신경 장애가있는 생쥐를 안락사시킵니다 (무기력 해지거나, 수척해 보이거나, 뒤로 구부러 지거나, 불규칙한 움직임이 있음).
    참고: 본 연구에서는 시판되는 안락사 용액 200mg/kg( 재료 표 참조)을 사용하여 각 마우스를 안락사시켰습니다.

3. TPS를 통한 조직 수집

1. 종양 샘플을 RBC 용해 배지( 재료 표 참조)가 포함된 조직 배양 접시에 실온에서 5분 동안 담그십시오.
   참고: MIRS에서 TPS로 수확된 조직은 주로 조직의 작은 덩어리와 함께 단일 세포 형태입니다.
2. 50mL 원뿔형 튜브에 70μm 필터( 재료 표 참조)를 놓고 5mL 주사기의 플런저를 사용하여 종양 샘플을 필터를 통과시킵니다.
3. 전사 피펫을 사용하여 RPMI-1640 배지를 사용하여 필터를 통해 세포 및 조직 덩어리를 쉽게 통과시킬 수 있습니다.
4. 4 °C에서 5분 동안 428 x g 로 원심분리합니다. 피펫으로 상청액을 버립니다.
5. 준비된 RPMI-1640 배지 5mL에 각 샘플을 재현탁합니다.
6. 조직 생존력을 높이려면, 특히 큰 조직 덩어리가 첫인상으로 시각화되는 경우 필요한 양의 효소 칵테일(DNAse I, 콜라게나제 IV, 디스파스, 파파인 및 EDTA 함유, 재료 표 참조)을 각 샘플에 추가합니다. 와류를 사용하여 용액을 혼합하십시오.
   참고: 3.6단계는 선택 사항입니다. 효소 칵테일의 조성(총 부피 5mL/샘플): DNAse I 등급 II 300μL, 콜라게나제/디스파아제 150μL(피브로넥틴, 콜라게나제 IV, I 및 비극성 아미노산 절단), 파파인(비특이적 프로테아제) 250μL, 0.5M EDTA 6μL.
7. 샘플을 200 rpm, 37 ° C로 설정된 셰이커 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다.
8. 20분 후, 샘플을 428 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전시킨다. 상청액을 폐기하십시오.
9. 70μm 세포 스트레이너를 통해 단일 세포를 여과하고 4°C에서 3분 동안 274 x g 로 스핀다운합니다. Trypan Blue 및 혈구계를 사용하여 세포 생존율 분석¹⁰ 을 수행합니다( 재료 표 참조).
   알림: Day 0 생존율은 30%-70% 범위이며 2-3일 이내에 크게 증가합니다.
10. 필요한 생존력 테스트에 따라 4, 5 또는 6단계로 진행합니다.

4. 부착 배양에서 성장하는 세포

1. 인증된 층류 후드에서 펠릿을 혈청 함유 부착 배지(예: DMEM, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액)에 재현탁하고 부착 세포 플라스크에 세포를 플레이트합니다.
2. 세포를 조절된 인큐베이션 환경 (37°C, 5%_CO2)에 유지한다.

5. 현탁 배양에서 성장하는 세포 (신경구)

1. 인증된 층류 후드에서 펠릿을 무혈청 완전 줄기세포 배지¹¹ 에 재현탁하고 현탁 플라스크에 플레이트합니다.
2. 신경권 형성을 허용하기 위해 세포를 2-3일 동안 조절된 배양 환경(37°C, 5%_CO2)에 유지한다.
3. 배양 배지에서 신경구를 시각화 한 후 트립신 -EDTA 또는 Accutase ( 재료 표 참조)를 사용하여 계대 배양을위한 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
   참고 : 수확 중에 특별한주의를 기울이고 신경 줄기 세포를지지하는 적절한 배지를 사용하는 한, 수확 된 조직의 줄기 세포는 며칠 내에 신경구를 형성해야합니다.

6. 재 이식을위한 세포 준비

1. 펠릿을 1x PBS 4μL당 100,000개의 살아있는 세포 농도로 재현탁합니다.
2. 즉시 두개내 종양 이식법을 이용하여 나이브 마우스에 주사한다(단계 1).

7. 조직 학적 분석

1. 절제술 직후, 뇌를 추출하여 4% 파라포름알데히드(PFA)로 24시간¹²분 동안 고정합니다.
2. 뇌가 자당으로 포화 될 때까지 30 % 자당 용액으로 옮깁니다 (용기 바닥까지 가라 앉음).
3. 뇌를 70 % 에탄올 용액으로 옮깁니다.
4. 파라핀 블록 임베딩, 절편 및 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 이전에 공개된 보고서¹³에 따라 수행한다.
   참고: 염색을 위해 취한 각 섹션의 두께는 10μm였습니다.

결과

MIRS를 이용한 외과적 절제술은 종양 부담의 현저한 감소를 초래한다.
종양 부담이 더 작은 그룹에서 평균 기준선 생체 발광 신호는 절제술을받은 하위 그룹에서 5.5e + 006 광자 / s ± 0.2e + 006이었습니다. 절제술 후 평균 생체 발광 신호는 0.3e + 006 ± 3.09e + 006 광자 / s로 감소했습니다 (p <0.0001, Mann-Whitney 테스트) ⁹ (그림 2)). 생체...

토론

종양 절제술은 저등급 및 고급 뇌종양 모두에 대한 신경외과 종양 치료 계획의 초석입니다. 종양의 세포 감소 및 용적 축소는 뇌종양 환자의 신경 기능 개선 및 전체 생존과 상관관계가 있습니다 1,2,5,6. 외과적 절제를 위한 프로토콜이 이전에 설치류 모델에서 기술되었지만, 이러한 프로토콜은 생성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD	309628
15 mL conical tubes	Corning	430052
200 proof ethanol	PharmCo	111000200
5 mL pipettes	CoStar	4487
70 micron filter	Fisher	08-771-2
Accutase	Millipore Sigma	SIG-SCR005
Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL)	Covetrus	33198
Anesthesia System	Patterson Scientific	78935903
Anesthesic Gas Waste Container	Patterson Scientific	78909457
Bench protector underpad	Covidien	10328
C57Bl/6, 6-8 week old mice	Charles River Laboratories	Strain Code 027
ChroMini Pro	Moser	Type 1591-Q
Collagenase-Dispase	Roche	#10269638001
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Countess II FL Hemacytometer	Thermo Fisher	A25750
Debris Removal Solution	Miltenyi Biotech	#130-109-398
D-Luciferin	Goldbio	LUCK-1G
DMEM F12 media	Corning	10-090-CV
DMEM media	Corning	10-013-CV
DNAse I	Sigma Aldrich	#10104159001
Eppendorf tubes	Posi-Click	1149K01
Euthanasia solution	Henry Schein	71073
FBS	Millipore Sigma	F4135
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10437-028
Formalin	Invitrogen	INV-28906
Gauze	Henry Schein	101-4336
hEGF	PeproTech EC	100-15
Heparin	Sigma	H-3149
hFGF-b	PeproTech EC	1001-18B
Induction Chamber	Patterson Scientific	78933388
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Isoflurane Vaporizer	Patterson Scientific	78916954
Ketamine	Covetrus	11695-0703-1
Kopf Stereotactic frame	Kopf Instruments	5001
Lightfield Microscope	BioTek	Cytation 5
Microinjection Unit	Kopf	5001
Micromotor drill	Foredom	F210418
MRI system	Bruker	7T Biospec Avance III MRI Scanner
NICO Myriad System	NICO Corporation
Ophthalmic ointment	Puralube vet ointment
Papain	Sigma Aldrich	#P4762
PBS	Invitrogen	#14190250
PenStrep	Millipore Sigma	N1638
Percoll solution	Sigma Aldrich	#P4937
Pipette controller	Falcon	A07260
Povidone-iodine solution	Aplicare	52380-1905-08
Progesterone	Sigma	P-8783
Putrescine	Sigma	P-5780
RPMI Media	Invitrogen	INV-72400120
Scalpel blade	Covetrus	7319
Scalpel handle	Fine Science Tools	91003-12
Skin marker	Time Out	D538,851
Staple remover	MikRon	ACR9MM
Stapler	MikRon	ACA9MM
Staples	Clay Adams	427631
Stereotactic Frame	Kopf Instruments	5000
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Suture, vicryl 4-0	Ethicon	J494H
T-75 culture flask	Sarstedt	83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)	Lonza	BP10-548E
Trypsin-EDTA	Corning	MDT-25-053-CI