在啮齿动物中实施微创脑肿瘤切除术以实现高活力组织采集

摘要

本协议描述了通过具有集成组织保存系统的微创方法对啮齿动物脑肿瘤进行标准化切除。该技术对于准确反映啮齿动物和其他动物模型中的护理标准具有意义。

摘要

本协议描述了啮齿动物脑肿瘤切除和组织保存的标准化范式。在临床实践中，最大程度的肿瘤切除术是大多数脑肿瘤的标准治疗。然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型要么不包括切除术，要么使用手术切除模型，这些模型非常耗时，并导致显着的术后发病率、死亡率或实验变异性。此外，由于多种原因，对啮齿动物进行切除可能令人生畏，包括缺乏临床上可比的手术工具或方案以及缺乏标准化组织采集的既定平台。该协议强调了多功能，非消融性切除装置和根据该设备的临床版本改编的集成组织保存系统的使用。本研究所应用的装置在孔径处结合了可调抽吸和圆柱形叶片，以精确地探测、切割和抽吸组织。微创切除装置通过用于初始肿瘤植入的相同毛刺孔 执行 其功能。这种方法最大限度地减少了活检或切除手术期间区域解剖结构的改变，并降低了大量失血的风险。这些因素显着减少了手术时间（<2分钟/只动物），改善了术后动物的存活率，降低了实验组的变异性，并导致切除的组织和细胞的高活力，以供将来的分析。该过程由~1，400个循环/分钟的刀片速度促进，这允许将组织收获到无菌封闭系统中，该系统可以填充所选的生理溶液。鉴于研究和准确建模手术的影响、区域化肿瘤切除标本的保存和严格比较分析以及腔内递送疗法的重要性，这一独特的方案将扩大探索有关脑肿瘤患者围手术期管理和治疗发现的未解答问题的机会。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤。尽管最近在神经外科、靶向药物开发和放射治疗方面取得了进展，但GBM患者的5年生存率低于5%，这一统计数据在三十多年来没有显着改善¹。因此，需要更有效的治疗策略。

为了开发新疗法，越来越明显的是，研究方案需要（1）利用可翻译的临床前模型来准确概括肿瘤异质性和微环境，（2）反映GBM患者使用的标准治疗方案，目前包括手术，放疗和化疗，以及（3）解释切除的核心和残留之间的差异， 侵袭性肿瘤组织²，³，^4，5。然而，目前可用的大多数临床前脑肿瘤模型要么不实施手术切除，要么使用相对耗时的手术切除模型，导致大量失血或缺乏标准化。此外，由于缺乏临床上可比的手术工具或方案，并且缺乏用于系统组织收集的既定平台⁶，因此进行啮齿动物脑肿瘤切除可能具有挑战性（表1）。

本协议旨在描述使用多功能非消融性微创切除系统（MIRS）和集成组织保存系统（TPS）的啮齿动物脑肿瘤切除和组织保存的标准化范式（图1）。预计这种独特的技术将提供一个标准化的平台，可用于GBM和其他类型的脑肿瘤模型的临床前研究的各种研究。研究脑肿瘤治疗或诊断方式的研究人员可以实施该协议，以实现他们的研究中的标准化切除。

研究方案

所有动物研究均获得马里兰大学和约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。C57BL / 6雌性小鼠，6-8周龄，用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。遵守了所有生物安全2级（BSL-2）规定，包括使用口罩、手套和防护服。

1.初始颅内肿瘤植入

1. 在研究的初始阶段，颅内向每只小鼠注射悬浮在4μL磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）中的100，000个细胞（GL261鼠胶质瘤细胞系），深度为2.5mm，遵循先前发表的报告⁷。
2. 在肿瘤植入后⁸ 9天使用体内成像系统量化每只小鼠中的肿瘤信号。
   注意:如果需要，根据肿瘤负荷将小鼠分层为两组。在本研究中，两组分别为:（1）肿瘤负荷相对较小的小鼠（平均生物发光信号= 5.5e+006 ± 0.1e+006光子/s，n = 10）和（2）肿瘤负荷相对较大的小鼠（平均生物发光信号= 1.69e+007 ± 0.2e + 007光子/ s，n = 10），（p < 0.05，曼惠特尼检验）⁹。
3. 将每个组划分为两个可比较的子组。
   注意:在本研究中，两个亚组是:未经治疗的小鼠（n = 5）和使用MIRS（n = 5）进行手术切除的肿瘤小鼠（p > 0.05，曼-惠特尼试验）⁹。
4. 从切除当天开始，使用 体内 成像系统以基于肿瘤生长模式的频率跟踪肿瘤进展。
   注意:对于GL261细胞系，在切除当天跟踪肿瘤进展，然后每3-6天跟踪一次。

2. 使用MIRS切除肿瘤

1. 在诱导室或腹膜内注射甲苯噻嗪/氯胺酮溶液中使用异氟烷-O₂ 气体混合物麻醉小鼠。
   1. 如果使用气体麻醉剂，请将气体流速设置为 1.0 mL/min，将蒸发器设置为 2.0% 以进行麻醉诱导，通常需要在腔室中 3-5 分钟（见 材料表）。
   2. 如果使用注射麻醉剂，则通过腹膜内注射0.2mL麻醉溶液（80-100mg / kg氯胺酮和10-12.5mg / kg甲苯噻嗪，参见 材料表）麻醉小鼠。
2. 通过捏住脚趾来评估动物是否有足够的镇静作用。将眼药膏涂抹在眼睛上，以避免角膜干燥。手术前给予镇痛药（0.03-0.06 mg / kg丁丙诺啡皮下注射）。
3. 确认完全镇静后，将鼠标放在立体定向框架上（见 材料表）。
   注意:如果使用气体麻醉剂，请将鼠标的鼻子放在鼻锥中，在手术过程中它将继续接受异氟烷-O₂ 混合物（1.5%）。
4. 去除以前的订书钉，然后用脱毛膏或剃须去除头发。用氯己定/甜菜碱磨砂膏和酒精交替循环对皮肤进行消毒。然后，使用无菌手术刀，沿着先前的手术疤痕创建一个 1 厘米的纵向中线切口。
5. 通过载物台适配器/手机支架将MIRS手机连接到立体定向臂，以提高稳定性和精度。
6. 使用以下设置设置MIRS机器（参见 材料表）（图1）。
   1. 将后面板上设置的电源线插入电源线插座。通过切换打开或关闭系统电源（1 = 开，0 = 关）。
   2. 将氮气软管（随控制台提供）的一端插入控制台后面板上的公接头。顺时针旋转连接螺母以拧紧连接。
      注意: 软管的另一端需要连接到氮气供应。
   3. 在将软管连接到氮气供应之前，请确认供应压力不超过 100 psig，这是控制台推荐的输入供应压力。
      注意:一旦向控制台提供氮气，控制台将在脚踏板激活时产生自己的吸气。
   4. 盖上真空口的盖子并将其密封，以避免真空系统中的任何泄漏。吸液系统的任何泄漏都会影响MIRS控制台的性能。
   5. 如果在设置或启动期间吸气低于 17，请检查控制台前面的吸气旋钮是否设置为最大水平 （100），确保吸气系统中没有泄漏，并确认氮气输入供应压力正确。
   6. 要将脚踏板连接到主机，请将灰色脚踏板连接器插入其灰色插座，直到其发出咔嗒声并安装到位。
      注意: 脚踏板连接器以一个方向连接到控制台，并且是键控的。
   7. 要将手机连接到主机，请将蓝色听筒接头插入其蓝色插座，直到其发出咔嗒声并安装到位。
      注:手机接头以一个方向连接到主机，并且是键控的。
   8. 在使用系统之前，将无菌液体从小碗吸入孔中，通过管路和手机，然后进入罐中，以确保管子和手机的内部得到润滑以减少组织闭塞。
   9. 通过在控制台前面板上选择适当的模式，为单独抽吸或切割抽吸做好准备。使用脚踏板启动。
7. 将 23 G MIRS 插管插入毛刺孔，深度为 2.5 mm。
8. 通过踩下连接到套管的脚踏板来启动切除过程。使用手机中的控制旋钮进行一个完整的周期 （360°） 或更长时间的切除。
   注意:执行的周期越多，切除的肿瘤组织体积就越大。
9. 切除过程完成后，从毛刺孔中取出 23 G MIRS 插管，并使用 5 mL 的 1x PBS 冲洗管路并清除任何残留碎屑。
10. 将鼠标从立体定向框架中取出，并用吻合器或4-0缝合材料闭合伤口（参见 材料表）。
11. 在麻醉恢复期间，将鼠标放在加热垫上或温暖的灯光下，然后将其放回笼子。
12. 实验完成后， 通过冲洗清除 套管。与冷却介质和空气交替，将所有切除的组织"推"回收集罐。从系统中取出收集罐，并用提供的盖子盖上盖子。
13. 完成步骤2.12后，将套管的远端尖端放入3%H₂O₂ 中，并在Hg中以24-25的吸力将吸力管填充回抽吸罐中，静置60-90秒。用间歇性脉冲空气和培养基的无菌培养基冲洗。
14. 在手术后监测小鼠的任何神经系统体征（异常不稳定的运动或癫痫发作）。
15. 对患有严重神经损伤的小鼠实施安乐死（变得昏昏欲睡，外观憔悴，驼背或动作不稳定）。
    注意:对于本研究，使用200mg / kg市售安乐死溶液（见 材料表）对每只小鼠实施安乐死。

3. 通过 TPS 采集 组织

1. 将肿瘤样品浸入含有RBC裂解培养基（参见 材料表）的组织培养皿中，在室温下5分钟。
   注意:从MIRS收获到TPS的组织将主要以单细胞的形式以及小块组织的形式出现。
2. 将70μm过滤器（参见 材料表）放在50mL锥形管上，并使用5mL注射器的柱塞使肿瘤样品通过过滤器。
3. 使用移液器，使用 RPMI-1640 培养基促进细胞和任何组织团块通过过滤器。
4. 在4°C下以428× g 离心5分钟。 用移液管弃去上清液。
5. 将每个样品重悬于5 mL制备的RPMI-1640培养基中。
6. 为了提高组织活力，特别是如果在初始印象中可以看到大块组织块，则向每个样品中添加所需体积的酶混合物（包含DNAse I，胶原酶IV，分散酶，木瓜蛋白酶和EDTA，参见 材料表）。使用涡旋混合溶液。
   注意:步骤 3.6 是可选的。酶混合物的组成（总体积为 5 mL/样品）:300 μL DNA se I 级 II、150 μL 胶原酶/分散酶（切割纤连蛋白、胶原酶 IV、I 和非极性氨基酸）、250 μL 木瓜蛋白酶（非特异性蛋白酶）和 6 μL 0.5 M EDTA。
7. 将样品置于设置为200rpm，37°C的摇床培养箱中20分钟。
8. 20分钟后，在4°C下以428× g 旋转样品5分钟。 弃去上清液。
9. 通过70μm细胞过滤器过滤单个细胞，并在4°C下以274× g 旋转3分钟。 用台盼蓝和血细胞计数器进行细胞活力分析¹⁰ （见 材料表）。
   注意:第 0 天的活力范围为 30%-70%，并在 2-3 天内显着增加。
10. 继续执行步骤 4、5 或 6，具体取决于所需的可行性测试。

4. 贴壁培养中的细胞生长

1. 在经过认证的层流罩中，将沉淀重悬于含血清的贴壁培养基（例如 DMEM、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素 （P/S） 溶液）中，并将细胞平板放在贴壁细胞瓶中。
2. 将细胞保持在受控的孵育环境（37°C，5%CO₂）中。

5. 悬浮培养物（神经球）中的生长细胞

1. 在经过认证的层流罩中，将沉淀重悬于无血清完整干细胞培养基¹¹ 中，并接种在悬浮瓶中。
2. 将细胞在受控的孵育环境（37°C，5%CO 2）中维持_2-3天，以使神经球形成。
3. 在培养基中可视化神经球后，使用胰蛋白酶-EDTA或Accutase（参见 材料表）获得用于传代的单细胞悬液。
   注意:只要在收获过程中特别小心并使用支持神经干细胞的适当培养基，收获组织中的干细胞必须在几天内形成神经球。

6. 准备细胞进行再植入

1. 以每 4 μL 1x PBS 100，000 个活细胞的浓度重悬沉淀。
2. 立即使用颅内肿瘤植入方法（步骤1）注射到幼稚小鼠中。

7. 组织学分析

1. 切除后立即将大脑提取并固定在4%多聚甲醛（PFA）中24小时¹²。
2. 将大脑转移到30%蔗糖溶液中，直到它们被蔗糖饱和（沉入容器底部）。
3. 将大脑转移到70%乙醇溶液中。
4. 按照先前发表的报告¹³ 进行石蜡块包埋、切片和标准苏木精和伊红 （H&E） 染色。
   注意:用于染色的每个切片的厚度为10μm。

结果

使用MIRS进行手术切除可显著降低肿瘤负荷
在肿瘤负荷较小的组中，接受切除的亚组中的平均基线生物发光信号为5.5e+006光子/秒±0.2e+006。切除后，平均生物发光信号降至3.09e+006光子/秒±0.3e+006，（p <0.0001，曼-惠特尼检验）⁹ （图2）。生物发光信号在接下来的几天内增加，直到小鼠被安乐死。同样，在肿瘤负荷较大的组中?...

讨论

肿瘤切除术是低级别和高级别脑肿瘤神经外科肿瘤治疗计划的基石。肿瘤的细胞减灭和减瘤与脑肿瘤患者的神经功能和总生存期的改善相关¹，²，^5，6。尽管手术切除方案之前已在啮齿动物模型中描述过，但这些方案存在一些局限性，可能会混淆生成的结果和临床前模型的整体可转化性。例如，先前报...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD	309628
15 mL conical tubes	Corning	430052
200 proof ethanol	PharmCo	111000200
5 mL pipettes	CoStar	4487
70 micron filter	Fisher	08-771-2
Accutase	Millipore Sigma	SIG-SCR005
Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL)	Covetrus	33198
Anesthesia System	Patterson Scientific	78935903
Anesthesic Gas Waste Container	Patterson Scientific	78909457
Bench protector underpad	Covidien	10328
C57Bl/6, 6-8 week old mice	Charles River Laboratories	Strain Code 027
ChroMini Pro	Moser	Type 1591-Q
Collagenase-Dispase	Roche	#10269638001
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Countess II FL Hemacytometer	Thermo Fisher	A25750
Debris Removal Solution	Miltenyi Biotech	#130-109-398
D-Luciferin	Goldbio	LUCK-1G
DMEM F12 media	Corning	10-090-CV
DMEM media	Corning	10-013-CV
DNAse I	Sigma Aldrich	#10104159001
Eppendorf tubes	Posi-Click	1149K01
Euthanasia solution	Henry Schein	71073
FBS	Millipore Sigma	F4135
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10437-028
Formalin	Invitrogen	INV-28906
Gauze	Henry Schein	101-4336
hEGF	PeproTech EC	100-15
Heparin	Sigma	H-3149
hFGF-b	PeproTech EC	1001-18B
Induction Chamber	Patterson Scientific	78933388
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Isoflurane Vaporizer	Patterson Scientific	78916954
Ketamine	Covetrus	11695-0703-1
Kopf Stereotactic frame	Kopf Instruments	5001
Lightfield Microscope	BioTek	Cytation 5
Microinjection Unit	Kopf	5001
Micromotor drill	Foredom	F210418
MRI system	Bruker	7T Biospec Avance III MRI Scanner
NICO Myriad System	NICO Corporation
Ophthalmic ointment	Puralube vet ointment
Papain	Sigma Aldrich	#P4762
PBS	Invitrogen	#14190250
PenStrep	Millipore Sigma	N1638
Percoll solution	Sigma Aldrich	#P4937
Pipette controller	Falcon	A07260
Povidone-iodine solution	Aplicare	52380-1905-08
Progesterone	Sigma	P-8783
Putrescine	Sigma	P-5780
RPMI Media	Invitrogen	INV-72400120
Scalpel blade	Covetrus	7319
Scalpel handle	Fine Science Tools	91003-12
Skin marker	Time Out	D538,851
Staple remover	MikRon	ACR9MM
Stapler	MikRon	ACA9MM
Staples	Clay Adams	427631
Stereotactic Frame	Kopf Instruments	5000
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Suture, vicryl 4-0	Ethicon	J494H
T-75 culture flask	Sarstedt	83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)	Lonza	BP10-548E
Trypsin-EDTA	Corning	MDT-25-053-CI